羧基荧光素二醋酸琥珀酰亚胺酯（CFSE）用于监视淋巴细胞增殖

摘要

CFSE共价键的标签与荧光染料，羧基的长寿命的细胞内分子。因此，一个CFSE标记的细胞分裂时，它的后代有一半的荧光量，从而可以被用来评估细胞分裂。本文介绍与CFSE标记的小鼠淋巴细胞通常使用的程序。

摘要

羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）是一个有效的和流行的手段来监测淋巴细胞^分工 1-3 。 CFSE共价键的标签与荧光染料，羧基的长寿命的细胞内分子。因此，一个CFSE标记的细胞分裂时，其后代具有羧基荧光素标记的分子数的一半，因此每个细胞分裂，可通过测量细胞通过流式细胞仪检测荧光的相应减少评估。 CFSE的标签与特别低方差的荧光强度高，再加上其低细胞毒性淋巴细胞人口的能力，使一个理想的染料来衡量细胞分裂。由于它是一种基于荧光染料，它也与其他荧光使其适用于多色流式细胞仪的广泛兼容。本文介绍标签为目的的监控多达8个细胞分裂的小鼠淋巴细胞通常使用的程序。这些标记的细胞，可用于在体外和体内研究。

研究方案

1）试剂设定

1.1）CFSE原液

CFSE染料羧基荧光素二醋酸琥珀酰亚胺酯（CFDA，SE）（兆瓦557.47克/摩尔）购买，通常在25毫克小瓶。溶于8.96 mL的DMSO为5毫米的最后原液（如50-100微升等分几个月，在-20 ° C店）25毫克。 CFDA，SE将与水溶液反应，因此它是至关重要的，这种接触是在存储过程中避免。

1.2）淋巴细胞

隔离或从小鼠脾脏和淋巴结的淋巴细胞和悬浮在1毫升培养液中（如的RPMI）5％热灭活（HI）的小牛血清（FCS），与一个细胞浓度在0.5 × ¹⁰ 6 - 10 × 10 ⁷ /毫升。

2）CFSE标签

2.1）常规方法：

1. 在中期和地点1 mL体积，在一个新的（非湿）10 mL锥形管底部，仔细，彻底重悬细胞。
2. 铺设管水平（使用非湿润管会阻止移动和过早与CFDA，SE的解决方案混合的1毫升细胞悬液）。
3. 小心加110μL的PBS以确保它不会使细胞溶液接触的管道顶部的塑料非湿部分。
4. 重悬于1.1 CFDA，SE 5毫米的股票在110μL的PBS液。
5. 快速帽管，倒置和涡获得快速均匀混合的解决方案。注意，CFSE染料在终浓度为5微米，但是，最佳浓度可能被确定为每个准备一批，然后检查每6个月，以确保它是有效的。
6. 5分钟在室温下孵育细胞。注意CFDA，SE后转换为CFSE（见讨论）成为荧光染料，从而容易出现过度照射漂白。因此，最好是从这个角度来保护管，例如，用铝箔覆盖。
7. 洗细胞稀释在20 ° C PBS含5％您好FCS 10卷，300 XG沉积在离心5分钟，在20 ° C和丢弃上清液。重复洗两次。

2.2）的替代方法，这也是适合于较高的手机号码（10 - 30 ^× 10 7 ）：

1. 1毫升PBS及快速添加这个彻底的重新悬浮细胞，以1毫升加入2μL的5毫米​​股票准备一个2 ×（10μM）CFDA，SE的解决方案，然后迅速帽管和仰拱和涡得到快速均匀混合。
2. 在室温下5分钟的孵育细胞和洗涤步骤2.1（F）和2.1（G）。

2.3）的细胞可以被应用到的利益诱导细胞分裂的协议。可用于标记细胞在体外和体内实验。

2.4）在增殖实验完成，细胞收获和流式细胞仪分析（见下文有代表性的例子）。

3）代表性的成果

为了评估淋巴细胞增殖CFSE稀释，这是需要了解的有用不可分割的细胞（即最大荧光）和非标记的细胞（即最低荧光）的荧光。因此，你的实验设计应考虑到这些控件。下面是在体外和体内实验使用CFSE流式细胞仪来衡量的CD8 + T细胞分裂的例子。

3.1） 在体外刺激

图1显示的CFSE型材CFSE -标记的卵白蛋白（OVA）的特异性T细胞受体的转基因CD8 + OT - I T细胞与树突状细胞与卵子的各种款项后3天的文化。 CD8 + T细胞的纯化OT -我小鼠的脾和淋巴结肿大与CFSE和1 × 10 ⁵细胞培养3.3 × 10 ⁴直流标记。直流脉冲的OVA 1小时在37 ° C，洗两次前文化。经过3天，收获和抗- CD8 - APC的抗体和Hoechst 33258荧光标记，然后用流式细胞仪（收集到50,000个事件）分析细胞。演唱会（Hoechst 33258荧光 - ）CD8 +细胞显示。作为对照，CD8 +的T细胞单独培养，显示了非细胞CFSE强度，同时非标记细胞的自体荧光检测细胞分裂的细胞和限制。请注意在这个例子中，每个小组4 CFSE峰可以看出，这表明，这些细胞都发生了多达3个分支。

3.2） 在体内的刺激

图2显示了CFSE型材CFSE标记的OVA特异性T细胞受体转基因CD8 + OT - I T细胞体内后3天我n为20微克OVA存在。 CD8 + T细胞的纯化CD45.1 congenic OT我小鼠的脾和淋巴结肿大，CFSE和5 × 10 ⁶细胞注入尾静脉的C56BL/6J小鼠（CD45.2 +）第四标记。经过2小时的小鼠注射四卵子与20微克。 3天之后，从小鼠脾脏，制成单细胞悬液，抗- B220 - PerCP，抗- CD8 - APC - Cy7和反CD45.1 PE - Cy7抗体和Hoechst 33258标记，然后分析流式细胞仪（百万事件收集）。现场（33258赫斯特 - ）B220 -细胞都显示在左面板和右面板中显示的门CD8 + CD45.1 +细胞。作为对照，未刺激CFSE标记的CD8 + T细胞，显示了非细胞CFSE强度，同时非标细胞的自体荧光检测细胞分裂的细胞和限制。请注意，使用CD45的异型差异是重要的解决转让，CD8 + T细胞，从主机，因为他们是一个总CD8 + T细胞（左侧面板）未成年人的一个子集。请注意，大多数细胞属于7 CFSE峰，在这个例子中（右图），这表明，这些细胞都发生了高达6师。

图1。能力CFSE -标记的卵清蛋白（OVA）的特定T细胞受体的转基因CD8 + OT，我T 细胞在不同浓度的OVA 致敏体外到直流的回应，经过3天的文化显示的数据。注意非，划分的CD8人口+ T在缺乏抗原（浅灰色的柱状图）和非标记的人口（深灰色直方图）的自体荧光的细胞。该图描绘CD8 + T的划分基于CFSE稀释峰的1-3倍除以在较高的抗原浓度与更多的T细胞，细胞。

图2。能力CFSE -标记的卵清蛋白（OVA）的特异性T细胞受体的转基因CD8 + OT，我T细胞，时过继到C57BL / 6小鼠转移响应的OVA，数据显示继转移后3天左面板：。CD8 +，CD45的。 1 + OT - 1 T细胞在受体小鼠。右面板：CFSE扩散轮廓。注意：非人口的CD8 + T细胞在受体小鼠不接受抗原（浅灰色的柱状图）和非标记的淋巴细胞（深灰色直方图）的自体荧光。该图描绘CD8 + T细胞分为1-6倍的基础上CFSE稀释峰。

图3。一个代表各种分子事件发生在细胞与羧基荧光素二醋酸琥珀酰亚胺酯（CFDA，SE）标签的过程的详细信息。看到讨论的案文。注：通用的缩写“CFSE”，CFDA，SE，是用来描述一般的标签试剂和标签程序。图基于教区^4。

讨论

为了明白如何CFSE的工作原理，以及为什么需要快速统一的标签，是其在使用扩散分析，它是有用的了解CFSE细胞标记的分子基础。这可分为两个阶段，1）进入细胞和2）蛋白标签（图3）。 1）是介导进入细胞到细胞的染料进入diacetylated形式，染料羧基荧光素二醋酸琥珀酰亚胺酯（CFDA，SE）。醋酸乙烯酯使染料的高度膜permeant允许其跨质膜的快速通量。酯酶，细胞内的存在，切割醋酸CFDA，SE，从而引起的要少得多的膜permeant染料CFSE形式，因此集中在细胞内的染料。 2）蛋白质标记：虽然都CFDA，SE和CFSE氨基反应琥珀侧链，只有CFSE荧光。 CFSE细胞内的高浓度，有利于快速和高层次的细胞内蛋白质的标签。 CFSE细胞的标签，必须迅速进行，以获得一个均匀的标记细胞的人口，这是为解决经历了几个部门，在代表性的结果（图1和2）所示的细胞至关重要。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
CFDA,SE	Molecular Probes, Life Technologies
DMSO	Cambridge Isotope Laboratories
Lymphocytes	eg mouse or human
RPMI	GIBCO, by Life Technologies
FCS	SAFC Global
10-15ml conical tubes	Falcon BD
PBS	GIBCO, by Life Technologies
Aluminium foil	Capral Aluminium
Vortex	Scientific Industries Inc.
Centrifuge	Eppendorf
Flow cytometer	BD Biosciences