Использование карбоксифлуоресцеина диацетат сукцинимидил Эстер (CFSE) для контроля пролиферации лимфоцитов

Резюме

CFSE ковалентно этикетки долгоживущих внутриклеточных молекул флуоресцентного красителя, карбоксифлуоресцеина. Таким образом, когда CFSE меченных клетка делится, его потомства есть половина суммы флуоресценции, который тем самым может быть использован для оценки клеточного деления. В этой статье описываются процедуры обычно используются для маркировки мыши лимфоцитов с CFSE.

Аннотация

Карбоксифлуоресцеина сукцинимидил эфира (CFSE) является эффективным и популярным средством для контроля лимфоцитов деление ^1-3. CFSE ковалентно этикетки долгоживущих внутриклеточных молекул флуоресцентного красителя, карбоксифлуоресцеина. Таким образом, когда CFSE меченных клетка делится, его дочерних наделены вдвое меньше карбоксифлуоресцеина-оснащенных молекул и, таким образом каждым делением клетки могут быть оценены путем измерения соответствующего уменьшения в ячейке флуоресценции с помощью проточной цитометрии. Мощностью CFSE маркировать популяций лимфоцитов с высокой интенсивностью флуоресцентного исключительно низкой дисперсией, в сочетании с низкой токсичностью клетки, делают его идеальным красителем для измерения клеточного деления. Так как это флуоресцеина основе красителя она также совместима с широким кругом других флуорохромов что делает его применимым к многоцветной проточной цитометрии. В этой статье описываются процедуры обычно используются для маркировки мыши лимфоцитов с целью мониторинга до 8-клеточных делений. Эти меченые клетки могут быть использованы как для в пробирке и в естественных исследованиях.

протокол

1) реагента установки

1.1) CFSE маточного раствора

CFSE краситель приобрести как карбоксифлуоресцеина диацетат сукцинимидил эфира (CFDA, SE) (МВт 557,47 г / моль), как правило, в 25 флаконов мг. Растворите 25 мг в 8,96 мл ДМСО для окончательного решения запас 5 мм (50-100 хранить мкл аликвоты при -20 ° С в течение нескольких месяцев). CFDA, SE будет реагировать с водным раствором так важно, чтобы такого воздействия следует избегать во время хранения.

1.2) Лимфоциты

Изолировать лимфоциты селезенки и лимфатических узлов или от мышей и ресуспендируют в 1 мл культуральной среды (например, RPMI) с 5% тепла инактивированной (HI) эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), при концентрации клеток от 0,5 х 10 ⁶ - 10 х 10 ⁷ / мл.

2) CFSE маркировки

2.1) Рутинный метод:

1. Тщательно ресуспендирования клеток в 1 мл объем среды и места тщательно на дне свежих (не контактирующих с продуктом) 10 мл коническую трубку.
2. Положите трубку горизонтально (с использованием не контактирующих с трубкой будет препятствовать 1 мл клеточной суспензии, от движущихся и преждевременно смешивания с CFDA, решения SE).
3. Аккуратно добавить 110 мкл PBS, чтобы не контактирующих с продуктом части пластик в верхней части трубки обеспечении это не имеет контакта с клеткой решение.
4. Ресуспендируют 1,1 мкл 5 мМ запас CFDA, SE в 110 мкл PBS.
5. Быстро колпачок трубки и инвертировать и вихревые хорошо, чтобы получить быстрый равномерного смешивания растворов. Обратите внимание, что CFSE красителя в конечной концентрации 5 мкМ, однако, оптимальная концентрация, возможно, придется определяться для каждой партии подготовлены, а затем проверять каждые 6 месяцев, чтобы убедиться, что он является эффективным.
6. Инкубируйте клетки в течение 5 мин при комнатной температуре. Обратите внимание, что при преобразовании CFDA, SE, чтобы CFSE (см. обсуждение) краситель становится люминесцентные и, следовательно, склонным к обесцвечиванию под воздействием чрезмерного света. Таким образом, желательно, чтобы защитить от света трубки с этого момента, например, с помощью покрытия из алюминиевой фольги.
7. Вымойте клетки путем разведения в 10 объемах 20 ° C PBS, содержащий 5% HI ФТС, осаждающихся центрифугированием при 300 мкг в течение 5 мин при 20 ° С и отбрасывая супернатант. Повторите мыть два раза больше.

2.2) Альтернативный метод, который также подходит для высших номера сотовых (10 - 30 х 10 ^7):

1. Подготовка 2 х (10 мкМ) CFDA, SE решение путем добавления 2 мкл 5 мМ акции по 1 мл ФСБ и быстро добавить по 1 мл тщательно ресуспендировали клетки, а затем быстро колпачок трубки и инвертировать и вихревые хорошо, чтобы получить быстрое равномерное перемешивание.
2. Инкубируйте клетки в течение 5 мин при комнатной температуре и мыть как в шагах 2.1 (е) и 2.1 (г).

2.3) Клетки могут быть применены к протоколу, представляющих интерес для индукции клеточного деления. Маркированный клетки могут быть использованы в как в пробирке и в естественных анализов.

2.4) По завершении анализа распространения, клетки собирают и исследуют методом проточной цитометрии (см. ниже представитель примеры).

3) Результаты представитель

Для оценки пролиферацию лимфоцитов путем разбавления CFSE, полезно знать, флуоресценция безраздельно клетки (то есть максимальная флуоресценция) и не-меченых клеток (то есть минимальная флуоресценции). Таким образом, ваша опытно-конструкторских должны эти элементы управления во внимание. Ниже приведены примеры в пробирке и в естественных анализов использованием CFSE для измерения CD8 + Т-клеточного деления с помощью проточной цитометрии.

3.1) В стимуляции пробирке

На рисунке 1 показана CFSE профили CFSE меченных овальбумина (ОВА)-специфических Т клеточного рецептора трансгенных CD8 + OT-I Т-клетки после культуре 3-х дней с дендритные клетки импульсный с различными количествами OVA. CD8 + Т-клеток, очищенный от селезенки и лимфатических узлов OT-я мышей были помечены CFSE и 1 х 10 ^{5 клеток} культивировали с 3,3 х 10 ⁴ постоянного тока. Округ Колумбия, где с импульсным ОВА в течение 1 часа при температуре 37 ° C и промывают два раза до культуры. Через 3 дня, клетки, где собраны и помечены с анти-CD8-APC антител и Hoechst 33258, а затем анализировали с помощью проточной цитометрии (50000 событий, собранных). Live (Hoechst 33258 -) CD8 + клетки показано на рисунке. В качестве контроля, CD8 + T-клеток, культивированных один, показывает CFSE интенсивности, не разделили клетки, в то время как не-меченых клеток показывает, авто-флуоресценцию клеток и пределы обнаружить клеточных делений. Обратите внимание, что 4 пики CFSE можно увидеть в каждой из панелей в этом примере, показывая, что клетки претерпели до 3 подразделений.

3.2) В естественных условиях стимуляции

На рисунке 2 показан CFSE профили CFSE меченных ОВА-специфических рецепторов Т-клеток CD8 + трансгенных OT-I Т-клеток, через 3 дня в естественных условиях ян присутствии 20 мкг ОВА. CD8 + Т-клеток, очищенный от селезенки и лимфатических узлов CD45.1 congenic OT-я мышей были помечены CFSE и 5 х 10 ^{6 клеток} вводили IV в боковую вену хвоста C56BL/6J (CD45.2 +) мышей. Через 2 часа мышей вводили IV с 20 мкг ОВА. Через 3 дня, селезенки от мышей были собраны, сделанные в суспензии отдельных клеток, меченных анти-B220-PerCP, анти-CD8-APC-Cy7 и анти-CD45.1-PE-Cy7 антител и Hoechst 33258, а затем проанализированы методом проточной цитометрии (1000000 событиям, собранным). Live (Hoechst 33258 -) B220-клеток показаны на левой панели и закрытого CD8 + CD45.1 + клеток показано на правой панели. В качестве контроля нестимулированных CFSE меченных CD8 + Т-клеток, показывает CFSE интенсивности, не разделили клетки, в то время как не-меченых клеток показывает, авто-флуоресценцию клеток и пределы обнаружить клеточных делений. Обратите внимание, что использование CD45 allotypic разница имеет жизненно важное значение в решении переданы CD8 + Т-клеток от хозяина, так как они незначительные подмножество общего CD8 + Т-клеток (слева). Обратите внимание, что большинство клеток падения в течение 7 CFSE пиков в этом примере (справа), указывая, что клетки претерпели до 6 дивизий.

Рисунок 1. Способность CFSE меченных овальбумина (ОВА)-специфических Т клеточного рецептора трансгенных CD8 + OT-I Т-клеток реагировать в пробирке в постоянный импульсный с различными концентрациями ОВА, данные, приведенные время после 3 дней культуры. Обратите внимание, не разделили население CD8 + Т- клеток в отсутствие антигена (светло серый гистограмма) и авто-флуоресценции без меток населения (темно-серый гистограмма). Рис изображает CD8 + Т-клеток, которые разделили 1-3 раза на основе пиков CFSE разбавления, с большим количеством Т-клеток, деление на более высокие концентрации антигена.

Рисунок 2. Способность CFSE меченных овальбумина (ОВА) конкретного Т-клеток рецептор трансгенных CD8 + OT-I Т-клетки, когда восприимчиво переданы в C57BL / 6 мышей в ответ на OVA, данные, приведенные 3 дня после приемных передачи Слева:. CD8 +, CD45. 1 + OT-1 Т-клеток у мышей получателя. Правая панель: профиль CFSE распространения. Обратите внимание, не разделили население CD8 + Т-клеток у мышей получатель не получает антиген (светло серый гистограмма) и авто-флуоресценции без меток лимфоцитов (темно-серый гистограмма). Рис изображает CD8 + Т-клеток, которые разделили 1-6 раз на основе пиков CFSE разбавления.

Рисунок 3. Представительство различных молекулярных событий, которые происходят во время маркировки клеток с карбоксифлуоресцеина диацетат сукцинимидил эфира (CFDA, SE). Более подробную информацию о процессе см. Обсуждение текста. Примечание: 'CFSE "общий акроним, а не CFDA, SE, используется для описания маркировки реагента и маркировки процедуры в целом. Рис на основе приход ^4.

Обсуждение

Для того, чтобы оценить, насколько CFSE работает и почему быстрое равномерное маркировка необходима для ее использования в анализе распространения, полезно понять молекулярные основы CFSE маркировки клеток. Это может быть разделен на две фазы, 1) Сотовые входа и 2) Белки маркировки (рис. 3). 1) Сотовые запись: ввод красителя в к ячейке опосредовано diacetylated формы красителя, карбоксифлуоресцеина диацетат сукцинимидил эфира (CFDA, SE). Ацетаты сделать красителем высоко проникающий мембраны позволяет его быстрого потока через плазматическую мембрану. Эстераз, присутствующие в клетке, расщепляющие ацетаты от CFDA, SE и тем самым привести к CFSE форме краситель, который гораздо меньше, проникающий мембраны, таким образом, концентрация красителя в клетке. 2) Белки маркировки: в то время как CFDA, SE и CFSE имеют амино-реактивного сукцинимидил боковые цепи, только CFSE является флуоресцентные. Высокие внутриклеточные концентрации CFSE способствует быстрому и высокий уровень внутриклеточного маркировки белков. CFSE маркировки клетки должны быть выполнены быстро, чтобы получить однородную помечены популяция клеток, которая имеет решающее значение для решения клетки, которые прошли несколько дивизий, как показано на репрезентативные результаты (рис. 1 и 2).

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
CFDA,SE	Molecular Probes, Life Technologies
DMSO	Cambridge Isotope Laboratories
Lymphocytes	eg mouse or human
RPMI	GIBCO, by Life Technologies
FCS	SAFC Global
10-15ml conical tubes	Falcon BD
PBS	GIBCO, by Life Technologies
Aluminium foil	Capral Aluminium
Vortex	Scientific Industries Inc.
Centrifuge	Eppendorf
Flow cytometer	BD Biosciences