载入果蝇与神经末梢钙指标

摘要

钙是一种在神经系统中无处不在的使者，触发神经递质释放和突触强度的变化。在这里，我们展示了^一个加载的^Ca 2 +指标到果蝇的神经终端的技术。我们也证明所需设备的制造，并强调技术的成功的关键点。

摘要

钙在神经系统中的许多角色，但没有更令人印象深刻，作为神经递质释放的触发，并没有比支持学习和记忆的突触可塑性的重要使者深刻。为了进一步阐明的分子基础的Ca ^{2 +}依赖的突触机制，需要一个模型系统，基因可塑性和生理访问。果蝇提供了这样一个模型。在这个系统中，基因编码的荧光指标，可用来检测^神经末梢的Ca ² +的变化。然而，这些指标是有限的敏感性^钙+和常常表现出非线性响应。合成荧光指标更适合于测量迅速的Ca ^{2 +}与神经活动有关的变化。在这里，我们展示了一个加载到果蝇幼虫生活的神经末梢^葡聚糖偶联合成的Ca 2 +指标的技术。特别强调的是放置在协议的那些方面最关键该技术的成功，例如如何以避免沿的隔离神经静电，保持编制的健康在扩展装载期间，，并确保轴突^生存提供的^Ca 2 +促进密封切断轴突末梢。低亲和力右旋糖酐标记的Ca ^{2 +}的指标，如氟- 4和rhod，这显示了一个高信号的信噪比，同时微创干扰^突触前的^{Ca 2} +动力学。葡聚糖共轭有助于防止^钙进入细胞器如线粒体扣押⁺指标。加载技术可以同样适用于幼虫，胚胎和成人。

研究方案

1. 选择一个干净的清扫菜，没有接触过任何固定液。
   
   
2. 解剖流浪3 ^路龄果蝇在施耐德的果蝇含有^钙的中等^幼虫+和L -谷氨酰胺，（不削减任何神经或损伤肌纤维第7，6，13或12） 。
   
   
3. 选择一个12微米的小费（内径）的玻璃灌装吸管。
   
   
4. 使用注射器和油管（应用负压吸管）确保不妨碍枪头。
   
   
5. 选择一个优良的塑料填充丝可插入玻璃吸管的长度。
   
   
6. ⁺指标绘制到5毫米右旋糖酐标记的^钙 2〜1厘米的塑料丝。
   
   
7. 切段所有的神经。
   
   
8. 支持吸管上一个坡道，让枪头方法解剖幼虫的腹侧中线。
   
   
9. 画出一个神经段第四砍完，不捏的神经，进入移液器（包括施耐德的培养基中的少量）。
   
   
10. 取出油管，插入吸管的塑料丝，直到结束的灯丝在50微米的神经切断（避免触及神经）。
    
    
11. 弹出足够的Ca ^{2 +}到结束施耐德的中期量增加约33％（终浓度应小于2MM）神经指标。重要的 - 这必须在5分钟切割神经内完成。
    
    
12. 在室温下放置在黑暗的准备，而神经负载。
    
    
13. 40分钟后取出的Ca ^{2 +}使用灯丝的指标。
    
    
14. 离开地方吸管和填写完全新鲜施耐德的中期的，因为这将被用于刺激的神经脉冲。
    
    
15. 允许的Ca ^{2 +}指标在神经平衡至少60分钟，但不超过4小时，才开始的Ca ^{2 +}成像。
    
    
16. 冲洗新鲜施耐德的中期每30分钟一班，而它是平衡的准备。
    
    
17. 20分钟前成像取代施耐德与淋巴，像第六溶液（HL6; MacLeod等人2002年，2003年）的中期。
    
    
18. L -谷氨酸或谷氨酸可以添加到HL6在7MM的解决方案，脱敏突触后的谷氨酸受体，以防止神经诱发的肌肉收缩（MacLeod等人2004年。赖夫等人2002年，2005年）。

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Schneider’s Insect Medium	Reagent	Sigma-Aldrich	S0146	must contain L-glutamine and calcium
L-glutamic acid monosodium salt hydrate	Reagent	Sigma-Aldrich	G1626