Cargando Drosophila terminales nerviosas con indicadores de calcio

Resumen

El calcio es un mensajero en todas partes en el sistema nervioso, esencial para desencadenar la liberación de neurotransmisores y los cambios en la fuerza sináptica. Aquí se demuestra una técnica para la carga de Ca ^{2 +-los} indicadores en las terminaciones nerviosas de Drosophila. También demuestran la fabricación de los aparatos necesarios y hacer hincapié en los puntos críticos para el éxito de la técnica.

Resumen

El calcio juega muchos papeles en el sistema nervioso, pero ninguno tan impresionante que, como el detonante de la liberación de neurotransmisores, y ninguno más profundo que el mensajero fundamental para la plasticidad sináptica que apoya el aprendizaje y la memoria. Para aclarar aún más los fundamentos moleculares de Ca ^{2 +-dependiente} de los mecanismos sinápticos, un modelo de sistema se requiere que sea genéticamente maleable y accesible fisiológicamente. Drosophila melanogaster ofrece este modelo. En este sistema, genéticamente codificados indicadores fluorescentes están disponibles para detectar cambios de Ca ^{2 +} en las terminaciones nerviosas. Sin embargo, estos indicadores han limitado la sensibilidad a Ca ^{2 +} y, a menudo muestran una respuesta no lineal. De índices sintéticos fluorescentes son más adecuados para la medición de la rapidez de Ca ^{2 +} cambios asociados con la actividad nerviosa. Aquí se demuestra una técnica para la carga de dextrano conjugado sintético Ca ^{2 +} indicadores en las terminaciones nerviosas en vivo en larvas de Drosophila. Se hace especial hincapié en aquellos aspectos del protocolo más crítico para el éxito de la técnica, tales como la forma de evitar descargas de electricidad estática a lo largo de los nervios aislados, mantener la salud de la preparación durante los períodos de carga extendida, y asegurar la supervivencia de los axones, proporcionando Ca ^{2 +} para promover el sellado de las terminaciones del axón cortado. De baja afinidad dextrano conjugado con Ca ^{2 +-indicadores,} como la fluo-4 y Rhod, están disponibles, que muestran una alta relación señal-ruido, mientras que mínimamente interrumpir presináptica Ca ^{2 +} dinámica. Dextrano-conjugación ayuda a prevenir la Ca ^{2 +} indicadores que se están secuestradas en orgánulos como las mitocondrias. La técnica de carga se puede aplicar igualmente a las larvas, embriones y adultos.

Protocolo

1. Seleccione un plato disección limpia que no ha sido expuesto a los fijadores.
   
   
2. La disección de un errante ³ de instar larva de Drosophila en medio de Schneider Drosophila contiene Ca ^{2 +} y L-glutamina, (no cortar los nervios o fibras de daño muscular Nos. 7, 6, 13 ó 12).
   
   
3. Seleccione un vaso de llenado de pipeta con una punta de 12 micras (diámetro interno).
   
   
4. Utilizando una jeringa y el tubo (para aplicar una presión negativa en la pipeta) asegurarse de que la punta de la pipeta no esté obstruido.
   
   
5. Seleccione un plástico fino relleno de filamentos que pueden ser insertados a lo largo de la pipeta de vidrio.
   
   
6. Dibuja ~ 1 cm de 5 mM de dextrano conjugado Ca ^{2 +-indicador} en el filamento de plástico.
   
   
7. Cortar todos los nervios del segmento.
   
   
8. Apoyo a la pipeta en una rampa que permitirá a la punta de la pipeta de acercarse a la línea media ventral de la larva disecada.
   
   
9. Dibujar el extremo del corte de un nervio al segmento N º 4, sin presionar el nervio, en el extremo de la pipeta (incluyen una pequeña cantidad de medio de Schneider).
   
   
10. Retire el tubo e introducir el filamento de plástico en la pipeta hasta el final del filamento está a 50 micras del extremo cortado del nervio (evitar el contacto con el nervio).
    
    
11. Expulsar suficiente Ca ^{2 +-indicador} en la terminación nerviosa para aumentar el volumen de medio de los Schneider en un 33% (concentración final debe ser <2 mm). Importante - Este debe ser completado dentro de 5 minutos de cortar el nervio.
    
    
12. Colocar la preparación en la oscuridad a temperatura ambiente mientras se carga el nervio.
    
    
13. Después de 40 minutos, retire el Ca ^{2 +-indicador} con el filamento.
    
    
14. Dejar la pipeta en el lugar y llenarlo completamente con un nuevo medio de Schneider, ya que se puede utilizar para aplicar pulsos de estimulación del nervio.
    
    
15. Deje que el Ca ^{2 +-indicador} que se equilibre en el nervio por lo menos durante 60 minutos, pero no más de 4 horas, antes de comenzar el Ca ^{2 +-imagen.}
    
    
16. Enjuague la preparación con un nuevo medio de Schneider cada 30 minutos mientras se está equilibrando.
    
    
17. 20 minutos antes de cambiar de imagen medio de Schneider con hemolinfa-Como solución N º 6 (HL6; Macleod et al 2002;. 2003).
    
    
18. L-ácido glutámico o glutamato se puede agregar a HL6 solución a 7 mm para desensibilizar los receptores de glutamato postsinápticos para evitar que los nervios provocado la contracción muscular (Macleod et al 2004;. Reiff et al 2002;. 2005).

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Schneider’s Insect Medium	Reagent	Sigma-Aldrich	S0146	must contain L-glutamine and calcium
L-glutamic acid monosodium salt hydrate	Reagent	Sigma-Aldrich	G1626