Caricamento terminazioni nervose Drosophila con gli indicatori di calcio

Riepilogo

Il calcio è un messaggero onnipresente nel sistema nervoso, essenziale per innescare il rilascio dei neurotrasmettitori e dei cambiamenti nella forza sinaptica. Qui mostriamo una tecnica per il caricamento di Ca ^{2 +-indicatori} in terminazioni nervose Drosophila. Abbiamo anche dimostrare fabbricazione degli apparati necessari e sottolineare i punti critici per il successo della tecnica.

Abstract

Il calcio gioca molti ruoli nel sistema nervoso, ma nessuno più impressionante come trigger per il rilascio dei neurotrasmettitori, e nessuno più profonda di come il messaggero essenziali per la plasticità sinaptica, che supporta l'apprendimento e la memoria. Per ulteriormente chiarire le basi molecolari di Ca ^{2 +-dipendente} meccanismi sinaptici, un sistema modello è necessario che sia geneticamente malleabile e fisiologicamente accessibile. Drosophila melanogaster fornisce un tale modello. In questo sistema, gli indicatori fluorescenti geneticamente codificate sono a disposizione per rilevare Ca ^{2 +} variazioni di terminazioni nervose. Tuttavia, questi indicatori hanno limitato la sensibilità al Ca ^{2 +} e mostrano spesso una risposta non lineare. Sintetici indicatori fluorescenti sono più adatti per misurare la rapida Ca ^{2 +} cambiamenti associati con l'attività del nervo. Qui mostriamo una tecnica per il caricamento destrano coniugato sintetico Ca ^{2 +} indicatori in terminali nervosi larve vivono in Drosophila. Particolare enfasi è posta sugli aspetti del protocollo più critico per il successo della tecnica, come il modo di evitare scariche di elettricità statica lungo i nervi isolato, il mantenimento della salute della preparazione durante i periodi di carico prolungato, e di garantire la sopravvivenza degli assoni, fornendo Ca ^{2 +} per la promozione di tenuta delle terminazioni degli assoni reciso. Bassa affinità destrano coniugato Ca ^{2 +-indicatori,} come fluo-4 e Rhod, sono disponibili che mostrano un elevato rapporto segnale-rumore mentre minimamente disturbare presinaptico Ca ^{2 +} dinamica. Destrano-coniugazione aiuta a prevenire Ca ^{2 +} indicatori essere sequestrato in organuli come i mitocondri. La tecnica di carico può essere applicato anche per le larve, gli embrioni e adulti.

Protocollo

1. Seleziona un piatto pulito dissezione che non è stato esposto a qualsiasi fissativi.
   
   
2. Sezionare un errante 3 ^° instar larva di Drosophila in Medio Drosophila Schneider contenente Ca ^{2 +} e L-glutamina, (non tagliare qualsiasi nervi o fibre muscolari danno numeri 7, 6, 13 o 12).
   
   
3. Selezionare una pipetta di vetro riempimento con una punta di 12 micron (diametro interno).
   
   
4. Utilizzando una siringa e tubo (per applicare una pressione negativa alla pipetta) garantire che la punta della pipetta non sia ostruito.
   
   
5. Selezionare un riempimento di plastica sottile filamento che possono essere inseriti per tutta la lunghezza della pipetta di vetro.
   
   
6. Disegnare ~ 1 cm di 5 mM destrano coniugato Ca ^{2 +-indicatore} nel filamento di plastica.
   
   
7. Tagliare tutti i nervi segmento.
   
   
8. Sostenere la pipetta su una rampa che consentirà la punta della pipetta di avvicinarsi alla linea mediana ventrale della larva sezionato.
   
   
9. Disegna la fine di un nervo tagliato a segmento n.4, senza pizzicare il nervo, nella parte finale della pipetta (includere una piccola quantità di mezzo di Schneider).
   
   
10. Rimuovere il tubo e inserire il filamento di plastica nella pipetta fino alla fine del filamento è all'interno di 50 micron del taglio del nervo (evitare di toccare il nervo).
    
    
11. Espellere sufficiente Ca ^{2 +-indicatore} sul nervo fine di aumentare il volume del mezzo di Schneider di circa il 33% (concentrazione finale deve essere <2 mm). Importante - Questo deve essere completato entro 5 minuti di tagliare il nervo.
    
    
12. Mettere la preparazione al buio a temperatura ambiente, mentre i carichi dei nervi.
    
    
13. Dopo 40 minuti togliere il Ca ^{2 +-spia} con il filamento.
    
    
14. Lascia la pipetta in posizione e riempirlo completamente con mezzo fresco di Schneider, in quanto questo sarà utilizzato per applicare gli impulsi stimolando il nervo.
    
    
15. Lasciare che il Ca ^{2 +-indicatore} per equilibrare nel nervo per almeno 60 minuti, ma non più di 4 ore, prima di iniziare Ca ^{2 +-imaging.}
    
    
16. Sciacquare la preparazione con mezzo fresco di Schneider ogni 30 minuti mentre è equilibrante.
    
    
17. 20 minuti prima di imaging sostituire medio Schneider con emolinfa-Like No.6 soluzione (HL6; Macleod et al 2002;. 2003).
    
    
18. Acido L-glutammico o glutammato può essere aggiunto HL6 soluzione a 7 mm per desensibilizzare i recettori del glutammato postsinaptici per evitare nervo-evocato contrazione muscolare (Macleod et al 2004;. Reiff et al 2002;. 2005).

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Schneider’s Insect Medium	Reagent	Sigma-Aldrich	S0146	must contain L-glutamine and calcium
L-glutamic acid monosodium salt hydrate	Reagent	Sigma-Aldrich	G1626