机械操纵控制神经元轴突的发展

摘要

应用在2-1000 microdyne范围内的神经元上的力量和直接测量是实现与高精密校准的玻璃针。这种方法可以用来控制和测量轴突发展的几个方面，包括轴突起始，轴突紧张，轴突伸长速度，和力矢量。

摘要

细胞操作和神经轴突的延伸，可以校准玻璃微纤维能够测量和应用在^{10-1000μdyne}范围1,2的力量来完成。力的测量是通过观察Hookean弯曲的玻璃针，这是直接和实证方法³校准获得。设备制造，校准，处理和使用的针头对细胞的要求和程序进行了全面介绍。力制度与以前使用的不同的细胞类型，这些技术已应用示范的方法的灵活性，并为^今后的调查4-6的例子给出。技术优势是连续的“可视化”的操作所产生的力量和能力在各种细胞活动的直接干预。这些措施包括直接刺激和调节轴突生长和^回缩 7，以及分队，对任何类型的培养^细胞 8机械测量。

研究方案

1。使玻璃针。

1. 一个可调的微针车夫是用来制造一个约4毫米长，已关闭了坚实的梁锥尖的针。相对于长期的灵活的提示，这短短的4毫米的长度将限制在实验过程中针尖的振动。在4毫米的光纤近端地区，针锥迅速从玻璃管的直径在1毫米至15微米，而最远端1毫米的纤维直径为2.5微米。我们使用的R - 6玻璃毛细管，外径为0.9毫米，编号0.6毫米8“长度和BB - CH车夫。如果研究者感兴趣的是在测量不同的弹簧属性（即不同的长度和或其他力量的范围，针应该拉到厚度），每个毛细管拉成4个“针。针是储存在两个橡皮泥“蛇”到其中的针轻轻按下覆盖160毫米培养皿。
2. 的玻璃针，以及一个被描述的线针，基本上是梁用于适当刚度的弯曲弹簧力所需的测量。请注意，作为其长度立方体光束尺度的弯曲力，无论组成。因此，下面描述的校准步骤，针/梁刚度不足可以提高通过缩短少量（例如缩短10％，产生一个刚性增加28％，即^0.9 3） 。

2。制作和校准线针

1. 通过玻璃针内（第1.1节）为0.001的“镍铬丝，其尖端折断插入一根电线校准针的线拉出来的尖端在长度26毫米和胶水超级胶水。弯曲成钩远端1毫米的导线。
2. 使微重量从0.003“康铜导线1米。措施的电线，磁带到一米棒，以协助它尽量伸直。称量的1米的电线，准确地切1厘米的片，和弯曲到VS的几件
3. 校准线针，需要一个测量光罩和显微解剖显微镜。该显微镜是在其一侧倾斜90 °，使用一个普遍繁荣的立场，例如，可以观察到的线针向下偏转。一个刀架在显微迷上地区是显微镜的光轴垂直安装到2.1节的线针。一个十字线标记线钩线针。挂起勾上1厘米的微型重量，并记录偏转。弯曲常数的参考线（μdynes/微米）除以所观察到的偏转（微米）的微重量比（注：1毫克= 0.98达因）计算。要准备，为下一步的线针，用手术刀在权衡点切断钩。钩的存在是额外的重量，弯曲的线，以一个小的程度。因此，它的影响光罩线的初始位置前的体重是补充。丝弹簧常数的测量是从线的挠度时的重量将被添加到弯曲点（线未来的提示）。当钩子是切断它不会改变春天的电线不断。

3。校准中间的玻璃针

1. 中间的玻璃针的校准需要使用眼光罩倒置显微镜。在显微镜阶段的一侧是一个机械的显微操纵器，用于在光学领域的中心举行​​的第2条线针。在另一边则是一个用于移动中间的玻璃针校准（见设备表）三轴液压显微。使用micromanipulators，在光学领域的中心带来两针一起〜45 °角成160毫米× 30毫米的Petri水盘，在10倍的领域。
2. 第一次产生了一系列使用不同的设置吸管拉马拉针进行评估。我们的目标是使中间的玻璃针弯曲的弹簧常数为20-30μdynes/微米。刚度的测定是通过测量中间针偏转的比例相比，线针偏转。例如，电线和玻璃针触摸，玻璃针移动偏转线针的距离光罩5马克，通过眼片。侧身移动的玻璃针分离针。线针，然后返回到原来的起始位置，但现在的玻璃针将在一个新的位置。玻璃针的负载，然后计算出其新的零力具有同等效力的负载（两个针头从事）减去两针位置的位置。在这个例子中，如果两个针偏转法郎（从零光罩），线针将返回到零的GLASS针弹簧至25日，如果是这样，它弯曲具有同等效力的，弯曲的线针5分20分。因此，两针之间的弯曲的比例给人的玻璃针的校准，它是¼线针僵硬。由于弹簧的弹性系数在3.4节计算使用的距离，它们是独立的放大或光罩大小划分比例。唯一的限制的考虑是，变形小到足以在针的线性弹性范围。
3. 做的挠度一系列5,10,15,3,7,12,17,5,10,15光罩上的标记的位置。如果任何变形释放过早地重复。挠度之间保持在零线针对齐。对于这些变形，注意的偏转量和最终零负载释放后的玻璃针的位置。这将创建10个数据点对。其他序列可以使用，但这个系列的目的是给内部的一致性，线性和滞后的早期迹象（挠度结果5 + 10 = 15; 3 +7 = 10;释放后5,10,15挠度应约相同的开头和结尾）。
4. 从3.3节的记录挠度线性回归，给出了一个比一个单一的偏转比例的中间的玻璃针弯曲常数更准确的量化。它还提供了一个针和质量较高的R值接近回归线为零的截距表示校准线性的评估。从3.3节准备的10个数据对回归，第二个数字录得双，最终零负载释放后的玻璃针的位置，必须有相应的初始挠度减去，这是第一个数字对。一旦执行此操作包括设置新的电话号码对初始挠度和相应的差额计算。新增5个控制对0,0这10个实验数据对锚定在零零偏转力的线性回归。这不是绝对必要的，但增加了一个额外的准确性程度。锚固在0,0针没有弯曲武力时是不适用的原则基础上。有了这15个数据对计算线性回归。不断校准的玻璃针是弯曲的弹簧钢丝针的弯曲常数除以此回归线的斜率。

4。校准工作的玻璃针用来操纵神经元

1. 玻璃针充分遵​​守，2-15μdynes/微米，可用于对神经元的实验是一个类似的方式进行校准第3条所述的对中间的玻璃针。也就是说，候选人的工作针偏转已知刚度中间线针的位置摆在第3针。 ，小于2μdynes/微米的玻璃针可能会略有缩短，使他们在适当的刚度范围。

5。针是带有附件的因素预处理

1. 压入一侧以上的附件因素的解决方案，如只有针尖在溶液中浸泡10毫升的烧杯中设置一个钳举行的粘土一次性针头处理。浸入毛细管轴是不可取的，因为它提高了涂层的积累随着时间的推移，这会改变的刚度和减少针疗效的附着尖。只能用于校准的针约4倍，可用于重新校准精度。针蘸依次在0.1％多聚赖氨酸为30分钟和30分钟，然后刀豆蛋白A（1毫克/毫升的PBS）解决方案。的多聚赖氨酸可反复使用几个星期，并储存在-20 ° C ConA的新鲜每周和存储4 ° C。对于其他类型的细胞，其表面的分子针可以直接调查的过程中。

6。设备设置了

1. 牵引工作，站上设置隔振表。它由倒置显微镜装有沿着舞台上方的左侧和液压机械臂连接到它，我们平衡的自定义扩展，在其中插入双刀架酒吧。沿栏液压显微定位，将其持有人一针显微镜的光路，而在其范围为中心的机械臂的控制。针是带有附件的因素时，打开Ringcubator或其他显微镜阶段加热系统，因此在实验开始阶段，在热平衡。

7。调心针

1. 我们的目标是获得两针（参考和工作针），在显微镜的视野安排，以便他们的秘诀是相距约50微米，除了上述培养皿中的参考，因此有些失焦​​，当牵引针盘上的重点是。安装到徕卡双刀架，它本身就是一个小显微持针两针。使用双刀架显微，两个提示被带进平行排列。参考针插入一个持针器，只在短距离，足以让收紧领握，并放置在右侧的双刀架本次大会。插入持针器的处理工作针其长度的一半，并放置在左侧的双刀架。当两个针尖带来相同的前沿阵地，一字排开，在其持有的针头长度不同错开的领子，所以他们不妨碍获得非常接近的提示。第7.2至7.4没有放大倍率。第7.5-7.8下进行显微观察。
2. 预先设定的垂直控制液压显微所以一路。设置其他控制其活动范围的中心，也是前进/后退刀架螺丝。
3. 带两针的提示一起使用右侧刀架一侧到另一侧的调整螺丝。然后推持针双刀架在自己向前或向后需要带来的针尖相同的前沿阵地。检查从侧面对使用右侧的向上/向下拧，使其在同一平面上提示。在刀架旋转针持有人关闭的差距，如果在其持针一针的角度。
4. 摆动刀架，​​并放入上述介质的表面光路的秘诀，钓鱼他们急剧下降。在基地的球关节螺钉拧紧之前，你移动你的手推开。
5. 在显微镜的视野中找到您的针尖之前他们带来太远向下突破或犯规培养皿底部的碎片。在一个60毫米的菜，15毫升的中型盘底部以上的安全保证金提供足够的深度。不要与未校准针的初步实践，得到这一步的感觉。由以上的细胞a10x目标盘的底部向上重点开始。面积的菜远离光敏感或惩戒性的实验细胞。降低到媒体的针头。移动的针一边到另一边寻找自己的影子。如果你看不出来，降低一点，向前移动的菜，重复一边到另一边通过。查找提示，搬回（或转发）上下。
6. 打开一侧到另一侧的螺丝，看看你发现的针。如果你是在寻找参考针用螺丝的动作，如果没有它的校准针。校准针，使用侧面侧面的螺丝推向参考针。移动前进和后退参考的影子。如果它是你找到参考针，拧到左边，而移动的液压寻找校准针的权利。
7. 当两个位于针使用的精细控制的双刀架行。未来针头在盘边缘的陡峭的角度向上/向下控制的原因也有向前，向上调整，缩短与上下延长组件。左侧，前进/后退螺丝控制，相反，推动前进的提示也下降了入菜，拔回撤回针，同时提高针尖的位置。因此，提高的参考和推动校准针将延长既能使他们即使在提示的同时，也带来了成以上菜的最佳高度关系。如果参考针延伸远远超出了工作的针，你可以螺丝/工作针向下和向前推而摆动参考，并缩短，直到两个甚至工作针是较低的。倍螺丝范围不会带来针，所以你可能需要轻轻滑动的持有人本身，确保球关节螺钉以及收紧，用手指对刀架的边缘楔形使用武力滑动轴。像以前一样，您也可以在刀架旋转持针，而在媒体和观察的效果，看到的，如果他们越来越近。
8. 记录下这最后的调整位置的图像，应用没有任何力量的针头分离是零的参考距离。提高试样的平面以上和“公园”他们的视野边缘针。
9. 提高通过半月板，一针的碎片可能会被删除。第一招参考远离其他针针到对方锁定，以避免两个提示。可能需要多次传递。

8。附加到细胞

1. 这一点，已针直接观察到通过显微镜。从细胞附着，意见将通过显微镜和视频屏幕上。左/右的方面是相同的，但在视频屏幕上的形象向上/向下方向是不一样的（引力）显微镜上的向上和向下。为了澄清向上/向下直接观察，通过显微镜和视频屏幕上观察到的方向之间的差异，后者将被转介和引号“'”了下来，“即
2. 拖曳的过程是通过改变两针的视频屏幕上从左至右（“块块”）位置。因此，选择实验轴突部分，在相同的“横向”方向延伸的轴突。轴突可以“横向”偏离“向下”的高达15 °，因为这将是补偿由8.5节的“推”演习。此外，应选择操纵轴突细胞体的长度或更多，与活跃的生长锥。轴突延伸至细胞体的权利，是首选，由于安装参考针左侧的工作针双刀架，紧张，在牵引应用，扩大了两针之间的差距。
3. 一个主要的轴突延伸到细胞体的左，可以被拖走而重新调整针之间的差距扩大和提高针一点点参考的双刀架。这将允许更多的空间牵引针弯曲走向的参考，如有必要，它下面通。拖车将提前到左，牵引针弯曲走向参考针张力增加。在紧张的参考距离的关系的改变，当分析数据输入到电子表格中减去从零参考距离，而不是从测量的零距离针分离测量。
4. 移动接近轴突的生长锥针，再次记录零距离，提高针，隔振表了空气。
5. 干脆把促进生长锥前的工作针，可能会产生自发的生长锥的进步附件。要积极主动地操纵生长锥的附件，将牵引针降“下面的”生长锥，然后降低对盘底部的针。这将导致针，以“转移”，弯曲和滑动沿生长锥的菜，撞出和移动“向上”。按对盘底部的针足以使周围生长锥针尖挂钩，但到目前为止，它比单针和幻灯片落后。等待20分钟，让抓地力成为建立。随着经验的积累，成功率可高达90％高，但比较典型的是在75％范围内。起初的成功率可能接近25％。开始的时候是“操纵”生长锥的主要缺陷。在“推步”的初始互动需要几秒钟。生长锥，然后被单独留在家中，形成一个坚定执着。然后耐心的行使必须在以下步骤。
6. 当生长锥，针，通过移动针的权利上略有紧张，提高针一点点。补偿针针位，而提高的“向下”移动。分阶段提高，直到你有附加的进程，扩大针和上面的菜表面的垂直。轴突的垂直安排延长拖带已经开始从针一次，即需要准确的测力，沿轴突的轴是唯一适用于力矢量。如果远离针牵引过程的角度，力矢量是沿轴针，而不是弯曲的针，总兵力不测量出生。从初始菜附件当场了提高持久附件针的前景。提示可能是上面的菜的表面（可见小的震动或从盘的重点不同的平面）或触摸它以最小的力量。太多拖动表面会歪斜的测量。针坚持的菜，或重新连接到基板的细胞的过程会导致强制加载，如果你继续试图将它移到，然后突然“持久性有机污染物松”附件可能发生的损失。要摆脱这种症结针，将针头和背面（“起来”和“倒”在屏幕平面），而不是添加更多的力量（右）。

9。扩展轴突或细胞的过程

1. 牵引是通过运用武力，通过移动针远离细胞体小的增量。部队是观测VED作为针之间的差距日益扩大。虽然逐渐增加了紧张的情绪，仔细观察支队从生长锥针的任何迹象。
2. 生长锥分离，如果不能迅速收回，略有下降的紧张等待，往往生长锥将“追赶”和再次抢尖上。如果轴突脱落针对盘针，它通过捕获并重复之前捕获它缩回“推”或一个“下拉”把它一点点紧张，等待大约10分钟再附着。经过两次失败的尝试后，我们建议使用不同的细胞。
3. 加水，每小时以抵消蒸发，使用的菜端上的一个标志，以表明最初的深度保持在菜的媒体水平。有了一个长远的巴斯德吸管，慢慢加水的菜一边远离针。扩展过程中，往往一个“摊位”，如果媒体变成高渗。可以减少蒸发量与介质的表面上涂油，但这个针后是在媒体上，都必须加入。如果通过油针传递，生长锥是不太可能附加到针。
4. 在一个实验结束时，你解除前的菜，复检针零距离。

10。数据分析

1. 陪读针的位置，在屏幕上的横轴，细胞体的位置，并记录时间。分离针针弯曲常数乘以减去卸载零距离距离等于所适用的武力μdynes。使用一个阶段千分尺校准屏幕图像的距离。
2. 不会改变在实验过程中非常重要的是确保质量数据的参考距离（零武力）针之间的分离。温度变化会影响到微米尺度上的设备，即不打开空调在一个实验。此外，如果您的显微镜加热系统有一个滞后的时间等到你的热稳定性。 Ringcubator跌幅滞后时间也隔离在盘子里的温度变化，其余的显微镜和操纵系统，减少零温漂和重点的变化。另一种力量，改变针的卸载分离针轴的表面张力。负载的变化与液体深度菜。检查备份针的参考距离和暂时无零距离武力在一个实验中偶尔看到提高数据的质量，即使你注意到一个变化中分离。

11。代表性的成果：

校准玻璃针可以很容易地应用到任何蜂窝地区，通常生长锥，可视光镜直接的力量。随着针获得细胞附着适当的治疗，机械张力实验可以应用到蜂窝地区的利益，或该地区所产生的力量可以测量。一个有代表性的神经牵引试验是在图 1 所示 ，其中已被拖走轴突的长度增加了一倍，在两小时内。


图1。一个培养的鸡背根神经节细胞与牵引的首选方向选择。前开始实验操作（一），针之间最初的零参考距离记录。 “推”演习是适用于生长锥（二）。牵引开始增加武力针（三）分离加载。牵引延长的轴突，拖走轴突和工作针“的水平和垂直对齐，有利于良好的测力（D）。酒吧= 40微米。针校准= /μdyne6.9微米。

讨论

技术应用和测量细胞的力量，有着悠久^的历史9。我们的方法最初是由丹尼斯布雷，谁使用玻璃针，类似我们的“拖”的神经元在一个恒定的速率使用^机动液压设备10的工作积极性。有许多细胞，其中包括应用力量的替代手段：步进电机^11，磁珠^12日，13微束和流体流动^14。后者是类似于我们的做法，在蜂窝探头最终是对一个已知的刚度弯曲梁校准和蜂窝测量?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
R-6 cap. Tube	Drummond Scientific	9-000-3111	R-6 glass OD 0.9mm, ID 0.6 mm, 8"
BB-CH puller	Mecanex S.A., Geneva, Switzerland	BB-CH puller	Use Mode 4 Alt by CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000
0.001" Chromel wire	Omega Engineering, Inc.	SPCH-001-50	unsheathed, themocouple wire, 50ft spool now called Chromega
0.003" Constatan wire	Omega Engineering, Inc.	SPCI-003-50	unsheathed, themocouple wire, 50 ft spool
fine forceps	Fine Science Tools	91150-20	Dumont Inox #5
universal microscope boom stand	Nikon Instruments	76135 or 90430	most brands or types of boom stand will work for this use
mechanical micromanipulator	Narishige International	M-152	three-axis direct-drive coarse micromanipulator
hydraulic micromanipulator	Narishige International	MO-203	now available as MMO-203, three movable axis type
needle holder	Leica Microsystems	11520145	set of 3
single instrument holder	Leica Microsystems	11520142
double instrument holder	Leica Microsystems	11520143
mechanical micromanipulator	Leica Microsystems	39430001	post mount,1 prob holder, RH Model 430001
joystick mech. micromanipulator	Leica Microsystems	11520137
Leica DM IRB	Leica Microsystems		inverted microscope
Vibraplane isolation table	Kinetic Systems	1200 series	ours is model 1201-02-12
Ringcubator	Home made (see reference 19)		reference 19, requires updated controller listed below
programable temperature controller	Instrumart.com	Fuji Electric PXR3	replaces the retired PXV3 temperature controller
Nikon Diaphot TMD	Nikon Instruments		inverted microscope, circa 1980
Nikon SMZ-10 binocular dissecting	Nikon Instruments		other dissecting microscopes will work