軸索の開発を制御する神経細胞の機械的な操作

要約

アプリケーションと2000から1000 microdyneの範囲内のニューロンに作用する力の直接測定は、校正済みのガラス針を用いて高精度で実現されています。この方法論は、軸索の開始、軸索張力、軸索伸長の速度、および力ベクトルを含む、軸索の開発のいくつかの側面を、制御および測定に使用することができます。

要約

セルの操作と神経軸索の延長は、10から1000μdyne範囲の^1,2の力を測定し、適用可能な校正済みガラスのマイクロファイバーを使用して行うことができます。力の測定は、直接、経験的な方法³によって校正されているガラス針の曲げHookeanの観察を通して得られる。 、製造校正、治療、および細胞に針を使用するための機器の要件と手順が詳しく説明されています。力は、これらの技術は方法論の柔軟性を示すが適用されていると、将来の検討^4-6の例として与えられるために以前に使用し、異なる細胞型の制度。技術的な利点は、操作によって生成される力の継続的な"可視化"し、直接携帯電話のさまざまなイベントに介入できることです。と同様に剥離し、培養細胞⁸の任意のタイプの機械的な測定は、これらは直接的な刺激や軸索の成長と収縮⁷の規定が含まれています。

プロトコル

1。ガラス針を作る。

1. 調整可能なマイクロニードルプラーは、4の長さはmmと固体のビームを閉じている約テーパー先端に針を製造するために使用されます。長く柔軟な先端とは対照的に、この短い4 mmの長さは、実験中の針の先端の振動を制限する。ファイバーの先端ほとんどの1ミリメートルの直径は2.5μmである間に4mmの繊維の近位領域では、針は、1mm以内ガラス管の直径から15μmで急速にテーパ。我々は、治験責任医師が他の力の範囲を測定することに興味を持っている場合は、。異なるバネ特性（すなわち、異なる長さのある針をR - 6ガラスキャピラリーチューブ、外径0.9ミリメートル、ID 0.6ミリメートル8"長さとBB - CHプラーを使用したり、厚さが）アップしてください。各キャピラリーチューブは、4つの2"針に引き出します。針は、針が軽く押されているかに2つの粘土"蛇"で覆われて160ミリメートルのペトリ皿に格納されています。
2. ガラス針だけでなく、後述するワイヤーの針は、本質的に力の必要な測定のための適切な剛性の曲げバネとして使用されるビームである。に関係なく、組成の、その長さの立方体のようなビームスケールのその曲げ力に注意してください。従って、以下で説明するキャリブレーションの手順のいずれかに対して、不十分な剛性の針/ビームはショートニングの少量（例えば10％の短縮が剛性で28％増、すなわち0.9 ³生成）によって硬めにすることができます。

2。ワイヤー針を作成し、キャリブレーション

1. と場所に26 mmの長さの先端からワイヤを引き抜きます。破損し、その先端にガラス針の内部を通して0.001"クロメル線を（セクション1.1で作られた）を挿入することによりワイヤのキャリブレーションの針を作成し、接着剤スーパー接着剤。フックにワイヤの遠位1 mmの曲げ。
2. 0.003"コンスタンタン線の1メートルからマイクロ重みを行う。ワイヤーを測定するために、まっすぐに、できるだけそれを取得する際に支援するためにメーターの棒にそれをテープ。正確に1cmの部分にそれをカットし、曲げる、ワイヤーの1メートルを計量VSに複数の部分
3. ワイヤー針のキャリブレーションは測定レチクルとマニピュレータとの解剖顕微鏡が必要です。顕微鏡は、ワイヤー針の下方への撓みが観察できるようなことが、普遍的なブームスタンドを使用して、その側に90 °傾いている。フック地域は顕微鏡の光軸に対して垂直になるようにマイクロマニピュレータの工具ホルダーに2.1節のワイヤー針をマウントします。レチクルマークと線の針のフックの位置を合わせます。フックのマイクロ重量1cmをハングとたわみを記録。観測されたたわみ（μm）をで割った値：基準線の（μdynes/μm）の曲げ定数は、マイクロ重量（1ミリグラム= 0.98ダイン注）の比として計算されます。次のステップのためにワイヤーの針を準備するには、メスで計量の時点でフックを切り取ります。フックの存在は小さな程度に曲がるワイヤーをその追加の重量です。重量が追加される前に、したがって、レチクルの線の初期位置に影響します。重量が屈曲点（線の将来の先端）に追加されたときにワイヤースプリング定数の測定は、ワイヤのたわみから導出されます。フックが切断されると、ワイヤのバネ定数は変化しません。

3。中間ガラス針のキャリブレーション

1. 中間ガラス針のキャリブレーションは、眼のレチクルと倒立顕微鏡を使用する必要があります。顕微鏡ステージの片側に光学分野の中心にセクション2の線の針を保持するために使用される機械的なマイクロマニピュレーターです。反対側に校正されている中間のガラス針を移動するために使用する3つの軸油圧マイクロマニピュレーター（機器の表を参照）です。マニピュレーターを使用して、10倍のフィールドに水160ミリメートル× 30ミリメートルのペトリ皿に〜45 °の角度で光の場の中心に両方の針を一堂に。
2. ピペットプラーで異なる設定で引っ張ら針のシリーズは、最初の評価用に生成されます。目標は20〜30μdynes/μmの一定の曲げバネで中間のガラス針を作ることです。剛性の決定は、ワイヤーの針の振れと比較して中間の針の振れの比率を測定することによって行われます。例えば、ワイヤーとガラス針が触れると、ガラスの針は、ワイヤー針の眼の部分を段階的に見られるようにレチクル上の5点の距離をそらすために移動されます。ガラス針を移動すると、横に針を外れます。ワイヤー針は、元の開始位置に戻りますが、ガラスの針は、新しい位置になります。ガラス針の負荷は、均等に力負荷（両方の針が従事して）の両方の針の位置を引いたその新しいゼロ力の位置から計算されます。両方の針が5の（ゼロからレチクル上で）マークするために偏向している場合は、この例では、、ワイヤー針は、GLAながら、ゼロに戻ります。もしそうならSS針は、25春かもしれない、それはワイヤー針5点を屈曲同じ力で20マークを曲げる。したがって、2本の針の間に曲げの比率は、ガラスの針のキャリブレーションを与え、それは¼線の針のように硬い。セクション3.4のバネ定数の計算は、倍率やレチクル分割サイズの独立している距離の比率を使用しているため。唯一の制限の考慮事項は、偏向が針の線形弾性範囲にあることが十分に小さいということです。
3. レチクル上5,10,15,3,7,12,17,5,10,15マークの位置におけるたわみの一連の操作を行います。いずれかのたわみがリリースすると途中でそれらを繰り返す。たわみの間にゼロに整列ワイヤー針を保つ。これらのたわみのそれぞれについて、偏向量とリリース後のガラス針の最後のゼロ負荷の位置に注意してください。これは、データポイントの10組を作成します。他の配列を使用することもできますが、このシリーズは、内部的な一貫性の初期の兆候を与えるように設計され、直線性及びヒステリシス（たわみ5の結果+ 10 = 15; 3 +7 = 10;リリース後5,10,15たわみ約はずです先頭と末尾）に同じ。
4. セクション3.3から記録されたたわみの線形回帰は、単一のたわみ比よりも中間のガラス針の曲げ定数のより正確な定量を与える。また、ゼロに回帰直線の切片の高いR値と近さで示されるキャリブレーションの針と質の直線性の評価を提供します。回帰のためにセクション3.3からの10個のデータのペアを準備するには、記録されたペアの2番目の数、リリース後のガラス針の最後のゼロ負荷の位置は、最初の数であることから減算対応する初期たわみを、持っている必要がありますペア。この操作が実行されると、新しい番号のペアのセットは、初期たわみと計算された対応の違いで構成されています。ゼロたわみのためにゼロの力で線形回帰を固定するためにこれらの10個の実験データのペアに0,0の5コントロールのペアを追加します。これは絶対に必要ですが、精度の余分度を追加されていません。 0,0停泊する力が適用されない場合、針が曲がっていないことを原則に基づいています。これらの15個のデータのペアを使用して線形回帰を計算する。キャリブレーションされているガラス針の定数曲げバネは、線の針を曲げ定数は、この回帰直線の傾きで割った知られているです。

4。神経細胞を操作するために使用する作業ガラス針のキャリブレーション

1. セクション3で説明したように神経細胞で実験的に使用するのに十分なコンプライアンスのガラス針、2-15μdynes/μmのは、類似の方法で中間のガラス針に対して校正されています。つまり、候補者の作業の針は、セクション3でワイヤの針の位置に配置された既知の剛性の中間の針を偏向させる。 2未満μdynes/μmのガラス針はわずかに適切な剛性の範囲にそれらをもたらすために短くなることがあります。

5。針は接着因子で前処理されています

1. 扱われるように針は、針の唯一の先端を溶液に浸漬されるように、接着因子の溶液10mlをビーカー、上記の設定クランプで開催された粘土の塊の側面に押されている。それは、剛性を変化させ、添付の針の有効性を軽減時、上の先端にコーティングの蓄積を増大させるため、キャピラリーチューブのシャフトを浸すことは望ましくありません。校正された針は、約4回使用することができ、精度のために再測定することができます。針は30分、30分してから、コンカナバリン（PBSで1 mg / ml）を、0.1％ポリリジン溶液中に順次浸漬されています。ポリリジンは、数週間にわたって繰り返し使用することができますし、-20℃で保存されています4時に錯那新鮮毎週とストアを行う℃に他の細胞型のため針によって、その表面に提示される分子は、調査のコースを指示することができる。

6。機器は、セットアップ

1. 曳航のワークステーションは、防振テーブル上に設定されています。それは二重工具ホルダーが挿入される私たちの輪のカスタム拡張機能を、保持、ステージ上の左側にあるバーとそれに接続された油圧マニピュレータを装着した倒立顕微鏡で構成されています。マニピュレータのコントロールが、その範囲の中央に配置されている間、顕微鏡の光路に、そのホルダーに針を入れて、バーに沿って油圧マイクロマニピュレーターを配置します。針は接着因子で処理されている時点で、Ringcubatorまたは他の顕微鏡のステージの加熱システムをオンに、ステージでは、実験の開始時に熱平衡にあるので。

7。針の位置合わせ

1. 目的は、顕微鏡の視野内の2つの針（基準や作業針が）ように配置させることです曳航針が皿の上にフォーカスがあるときにそれらの先端はややボケのため、培養皿上に参照しながら、離れて、約50μm程度離れている。その針ホルダーの2本の針が小さなマイクロマニピュレータ自体はライカダブルツールホルダー、にマウントされています。ダブルツールホルダーのマイクロマニピュレーションを使用して、2つのヒントが平行に整列させられる。十分な締め付け襟がそれをグリップとダブルツールホルダの右側にこのアセンブリを配置できるように、ニードルホルダーにのみ短い距離を、基準針を挿入します。ニードルホルダーに扱わ作業針半分の長さを挿入し、ダブルツールホルダの左側に配置します。彼らは先端が非常に接近して取得阻害しないように、2つの針先が同一の前方に位置するもたらしたと並んでいるときは、その所有者の中に針の長さが異なるが首輪をずらす。 7.4節まで7.2倍率なしで行われます。セクション7.5から7.8までは、顕微鏡観察下に行われます。
2. 垂直方向の制御が完全に開いているので、油圧マイクロマニピュレーターを事前に設定する。その範囲の中央に他のコ​​ントロールを設定し、また、工​​具ホルダーの前方に/バックネジ。
3. ツールホルダの右側に横方向の調整ねじを使用して一緒に2本の針の先端をもたらす。同じ前方に位置する針の先端をもたらすため、必要に応じてダブルツールホルダーに前方または後方針ホルダー自体を押してください。側からペアを検証し、同一平面にヒントをもたらすために、ネジの右側を上/下に使用してください。そのニードルホルダーの針の角度であればギャップを埋めるためのツールホルダの針ホルダーを回転させます。
4. ツールホルダーをスイングし、急それらを釣り、メディアの表面上の光路内にヒントを置きます。あなたが離れてあなたの手を動かす前に、ベースにボールジョイントネジを締めます。
5. あなたもはるかにダウン、それらを持参し、それらを壊したり、培養皿の底に破片でそれらを汚染する前に、顕微鏡の視野で針のヒントを見つける。 60mmディッシュでは、培地15mlは、皿の底部上に安全性のマージンのための十分な深さを提供します。このステップの感触をつかむためにキャリブレーションされていない針での初期の練習を実行してください。 a10x目的と皿の底にある細胞の上に上向きに着目することから始めます。離れて、光に敏感なまたは例示的な実験的な細胞から料理の分野でこれを行います。メディアに針を下ろします。彼らの影を探している側に針側に移動する。あなたがそれらを表示されない場合は、それらを少し下げて、サイドのパスにサイドを繰り返して、皿の中で前方に移動する。後方への移動（または転送）とダウンで、先端を見つける。
6. あなたが見つけたどの針を確認するために横方向のネジを回します。それは、あなたが参照の針を見ているスクリューで移動する場合、それができない場合には、校正済みの針です。キャリブレーション済み針の場合は、それに向かって、基準針をプッシュする側のネジに側を使用してください。前方に移動し、後方参照の影を探して。それはあなたが見つけた、基準針の場合は校正された針を探して右に油圧を移動させながら、左にネジ止めして。
7. 両方の針が配置されているときにそれらを並べるためにダブルツールホルダの細かいコントロールを使用します。皿の端に来て針の急角度で上方修正とダウンと短縮するためにコンポーネントを長く、また前方に持ってアップ/ダウン制御を引き起こします。左側には、フォワード/バックネジのコントロールは、先端の位置を上げながら針を撤回、下皿にも前方に先端をされプッシュバックを引っ張って、反対しています。したがって、基準を高め、キャリブレーション針を進めても、皿の上に高さの最適な関係にそれらを取り入れながら、さらに先端にそれらを作るために両方が長くなります。参照の針がはるかに作業針を超える場合には、ネジ止めすることができます/参照をダウンスイングと二人さえれており、正常に動作し、針が下になるまでそれを短縮しながら、ダウンして前方に働くニードルを押してください。時にはネジの範囲が一緒に針を持っていないので、あなたは、優しくホルダー自体をスライドさせる必要がボールジョイントネジがよく締まっていることを確認して、スライドさせる力を適用するためのツールホルダーの端に挟まあなたの指を使用することができますシャフト。また、一方、最大のメディアで、以前と同様に工具ホルダーの針ホルダーを回転させ、彼らがより緊密なっている場合に見て、効果を観察することがあります。
8. この最後の調整位置の画像を記録し、適用されたすべての力のない針の分離は、ゼロ基準距離です。視野の端での試料面と"公園"、その上の針を上げる。
9. 針の破片がメニスカスを介して上げることによって削除される可能性があります。最初にお互いにラッチの2つのヒントを避けるため、他の針からの参照針を動かす。複数のパスが必要になる場合があります。

8。細胞への接続

1. この点に、針は顕微鏡で直接観察されている。細胞接着に始まり、観察は顕微鏡を経由してビデオの画面上で両方行われます。両方の左/右の側面には同じですが、ビデオ画面上のイメージのアップ/ダウン方向は、顕微鏡の上下（重力）と同じではありません。顕微鏡で直接観察し、ビデオの画面上に観察されるように、アップ/ダウン方向の違いを明確にするために、後者は引用符で囲んで"アップ"と"ダウン、"すなわちと呼ばれる
2. 曳航のプロセスは、ビデオ画面上で左から右（'水平'）に2本の針の位置を変えることによって行われます。その結果、実験的な軸索の選択は、同じ"水平"方向に延びる軸索の部分で作られています。これはセクション8.5の"押し上げる"策略によって補償されるように軸索は、限り15℃で"水平"から"下向き"を逸脱することもできます。さらに、操作用に選択された軸索は、アクティブな成長円錐で、細胞体の長さ以上でなければなりません。細胞体の右側に伸びる軸索が原因で、基準針の左側に取り付けられた作業を針で二重工具ホルダーの設定、曳航時のようにかかる張力は、2本の針の間のギャップを広げるために好まれます。
3. 細胞体の左側に伸びるプライム軸索は、針の間のギャップを拡大し、基準針を少し上げることによって設定をダブルツールホルダーをreorientingなく曳航することができます。これは、牽引、針、より多くのスペースが基準に向かって屈曲し、必要に応じてその下に渡すことができます。曳航し、左側に進みますと曳航針は、緊張が増加するとリファレンスの針に向かって曲がります。データを分析する際の基準距離への緊張関係の変化は、ゼロ基準の距離ではなく、測定からゼロ距離から針の分離測定を減算してスプレッドシートに入力されます。
4. 針は、軸索の成長円錐に近い再びゼロ距離を記録し、針を上げ、防振テーブル上の空気に移動します。
5. 単に前進成長円錐の前に立つ針を置くことは、成長円錐の進歩などの自発的な添付ファイルを生成することがあります。への積極的、成長円錐に添付ファイルを操作する"下の"成長円錐を牽引、針を下に配置し、皿の底部に対して針低い。これは、針は曲げと成長円錐に料理を一緒に滑り、それを外れて"上向き"に移動、"を"偏向するようになります。だけで十分なので、成長円錐は、針の先端の周りにフックすること皿の底部に対して針を押して、ではなく、これまでのところそれは針と​​後方のスライドにわたって伝票はいる。グリップは、定着させるために20分待ってください。経験と、成功率は90％と高いことができますが、75％の範囲で、より典型的である。最初は成功率は25％に近いかもしれません。初めは、成長円錐を"操作上の"としているときに、主な落とし穴。 "ステップを押し上げる"の最初の相互作用は、数秒かかります。成長円錐は、会社の添付ファイルを形成するために、そのままにしておいてください。その後、忍耐は、次の手順の間に行使する必要があります。
6. 成長円錐は、針上にあるとき、右に針を動かすことによってその上にわずかな緊張を置いて、針を少し上げる。上げながら前方に少し針を動かして、"下向き"を移動させる針を補償する。あなたが針から、皿の表面上に垂直に延在する、アタッチされたプロセスを持ってまで、段階的に引き上げる。曳航開始後の針から伸びる軸索の垂直配置は、唯一の加えられた力のベクトルは、軸索の軸に沿っているように、すなわち、正確な力の測定値が必要です。離れて針から曳航プロセスの角度の場合、力のベクトルは、むしろ針が曲がったり、全体の力が測定されていない以上、針の軸に沿って生まれている。最初の皿の添付ファイルの場所から離れて得ることは針に永続的な添付ファイルの見通しを向上させます。先端には、皿の表面（皿から少し振動や焦点の異なる面に見られる）の上または最小限の力でそれに触れる可能性があります。あまりにも多くの表面で測定をスキューされるドラッグ。突然添付ファイルが失われる可能性と"ゆるいポップ"基板に再付着皿に付着針、または細胞のプロセス、それを移動しようとし続けている場合は読み込みを強制的につながる、。このような固着点から針を解放するために、より多くの力を（右）追加する代わりに（画面の平面の"上"と"ダウン"）前後に針を動かす。

9。軸索や細胞プロセスを拡張する

1. 曳航は、離れて細胞体から針を移動することによって力の小さなインクリメントを適用することによって達成されます。力がobserです針の間に増加させるギャップとしてVED。徐々に緊張を増加させながら、慎重に針から成長円錐の剥離の兆候を観察する。
2. 成長円錐が外れると急激に後退ではない場合、少し緊張を減少させ、待って、多くの場合、成長円錐は、"追いつき"なると再び先端につかむ。軸索は、針は針で料理に対してそれをトラップし、"押し上げる"または"プルダウン"はそれに少し緊張を置くと再結合のための約10分待つことを繰り返すことによってそれ後退する前にそれをキャッチが外れている場合。故障した2台の試みの後、我々は、別のセルを使用することをお勧めします。
3. 最初の深さを示すために皿の側面にマークを使用して、カウンターバランスの蒸発に時間水を加えてシャーレ内のメディアのレベルを維持する。長いパスツールピペットで、ゆっくりと針から皿の横に水を加える。メディアが高浸透圧になった場合に頻繁に"屋台"プロセスの拡張子。蒸発は、メディアの表面にオイルコーティングを減少することができますが、これは針がメディアになって後に追加される必要があります。針は、油を通過する場合、成長円錐は、はるかに少ない針に付着する可能性があります。
4. 実験の最後に、お皿、再確認してゼロ距離から針を持ち上げ前に。

10。データ解析

1. 画面上の横軸、細胞体と記録時間の位置に沿って針の位置を読んでください。針の曲げ定数を掛けた無負荷ゼロ距離マイナス針の分離距離が適用される力のμdynesに等しくなります。ステージのマイクロメータを使用して画面イメージの距離のキャリブレーションを行います。
2. 非常に重要な品質データのために基準距離（ゼロフォース）の針の間の分離を確保され、実験中に変更されることはありません。熱の変化は、実験中はエアコンをオンにしない、すなわち、ミクロンスケールの機器に影響を与えるでしょう。あなたの顕微鏡の加熱システムは、遅延時間を持っている場合には熱安定性を持つまでも待ちます。 Ringcubatorは、遅延時間を減少させ、また顕微鏡と熱ゼロのドリフトやフォーカスの変化を減少させる操作システムの他の部分から料理の熱変化を分離します。針の無負荷時の分離を変更する別の力が針のシャフト上に表面張力です。皿の液体の深さと荷重の変化。針のバックアップや一時的に実験中に時折、無力ゼロ距離を見ることで、基準距離をチェックすると、分離の変化を指摘している場合でも、データの品質を向上させます。

11。代表的な結果：

力キャリブレーション、光学顕微鏡で直接可視化として、ガラスの針が簡単に、通常、成長円錐、どんな携帯電話の地域に適用することができます。細胞の添付ファイルを取得するために、針の適切な治療で、機械的張力は実験的に関心の細胞の領域に適用することができます、またはその地域で生産力を測定することができます。代表的な神経曳航実験は曳航索が2時間で長さが倍増されている図1に示されています。


図1。曳航用配向による培養鶏後根神経節細胞が選択されます。実験的な操作が始まる（）の前に針の間に最初のゼロ基準の距離が記録されます。 "プッシュアップ"操作は、成長円錐（B）に適用されます。針の分離（C）で示されるように曳航は、増加した力の負荷から始まります。曳航が軸索を延長した、曳航索及び作業針の"水平"と垂直の位置合わせが良好な力の測定値（D）を促進している。バー= 40μmの。針のキャリブレーション= 6.9μdyne/μmの。

ディスカッション

携帯電話の力を適用し、測定する技術は長い歴史⁹持っている。我々の方法は、もともと私たちと電動油圧装置^10を用いて一定速度で"けん引"神経細胞に似たガラスの針を使用デニスブレイ、の作業が動機とされた。ステッピングモータ^11、磁気ビーズ^12、微細加工ビーム¹³と流体の流れ^14：含まれる細胞に力を適用することの多くの代替?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
R-6 cap. Tube	Drummond Scientific	9-000-3111	R-6 glass OD 0.9mm, ID 0.6 mm, 8"
BB-CH puller	Mecanex S.A., Geneva, Switzerland	BB-CH puller	Use Mode 4 Alt by CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000
0.001" Chromel wire	Omega Engineering, Inc.	SPCH-001-50	unsheathed, themocouple wire, 50ft spool now called Chromega
0.003" Constatan wire	Omega Engineering, Inc.	SPCI-003-50	unsheathed, themocouple wire, 50 ft spool
fine forceps	Fine Science Tools	91150-20	Dumont Inox #5
universal microscope boom stand	Nikon Instruments	76135 or 90430	most brands or types of boom stand will work for this use
mechanical micromanipulator	Narishige International	M-152	three-axis direct-drive coarse micromanipulator
hydraulic micromanipulator	Narishige International	MO-203	now available as MMO-203, three movable axis type
needle holder	Leica Microsystems	11520145	set of 3
single instrument holder	Leica Microsystems	11520142
double instrument holder	Leica Microsystems	11520143
mechanical micromanipulator	Leica Microsystems	39430001	post mount,1 prob holder, RH Model 430001
joystick mech. micromanipulator	Leica Microsystems	11520137
Leica DM IRB	Leica Microsystems		inverted microscope
Vibraplane isolation table	Kinetic Systems	1200 series	ours is model 1201-02-12
Ringcubator	Home made (see reference 19)		reference 19, requires updated controller listed below
programable temperature controller	Instrumart.com	Fuji Electric PXR3	replaces the retired PXV3 temperature controller
Nikon Diaphot TMD	Nikon Instruments		inverted microscope, circa 1980
Nikon SMZ-10 binocular dissecting	Nikon Instruments		other dissecting microscopes will work