使用C2C12成肌细胞的生物能简介实验

摘要

在细胞线粒体功能分析的方法的描述。线粒体产生的个人资料提供线粒体的功能，可以在一次实验中测量的四个参数：基础呼吸速率，ATP挂钩呼吸，质子漏，和储备能力。

摘要

的能力，测量细胞的新陈代谢和理解线粒体功能障碍，使全世界的科学家了解肥胖的线粒体功能的作用，糖尿病，衰老，癌症，心血管功能和安全性的毒性，以推动他们的研究。

细胞代谢底物的吸收，如氧，葡萄糖，脂肪酸，谷氨酰胺，并随后通过一系列酶控制的氧化和还原反应的能量转换过程中。在生产ATP，释放的热量和化学副产品，如乳酸和_CO 2到细胞外环境，这些细胞内的生化反应结果。

进入细胞的生理状态，并改变这些细胞的状态可以得到宝贵的见解，通过测量细胞消耗氧气，线粒体呼吸的指标利率 - 耗氧率 - 或OCR。细胞也通过糖酵解生成ATP，即：葡萄糖转化为乳酸，独立的氧气。在培养的井，乳酸是质子的主要来源。测量乳酸产生通过间接释放到细胞外的周边中等质子，从而导致介质酸化提供了细胞外酸化率 - 或ECAR。

在这个实验中，C2C12成肌细胞在海马细胞培养板的密度接种。建立基准利率基础耗氧量（OCR）和细胞外酸化（ECAR）率测量。细胞代谢扰动由三个增加不同的化合物（继承），这种转变细胞的生物能个人资料。

这个实验是来自一个经典的实验，以评估线粒体作为一个框架，建立在更为复杂的实验，旨在了解双方的生理和病理生理线粒体功能和预测细胞的能力，以应对压力和/或侮辱。

研究方案

在这个实验中，C2C12成肌细胞在海马细胞培养板的密度接种。建立基准利率基础耗氧量（OCR）和细胞外酸化（ECAR）率测量。

1。细胞注射

这些细胞代谢由三个增加不同的化合物（继承），这种转变细胞的生物能个人资料的困扰。其中一组将作为控制，运行控制的“化合物”添加的媒体。

1. 第一次注射寡。寡抑制ATP的合成，阻断质子_通道 F O部分ATP合酶（综合五） 。在线粒体的研究，它是用来防止呼吸状态3（磷酸）。与细胞，它可以用来区分氧气消耗量的百分比，ATP的合成和需要克服自然的跨线粒体膜质子漏的氧气消耗量的百分比。
2. 第二次注射FCCP。 FCCP（羰基氰化物- P - trifluoromethoxyphenylhydrazone）是一个载体，是一个移动的离子载体。这是因为它扰乱运输氢离子穿过线粒体膜，而不是ATP合酶（综合五）的质子通道的ATP合成偶联代理。这种线粒体膜电位的崩溃导致的快速消耗能源和氧气，无ATP生成。在这种情况下，OCR和ECAR将增加，OCR由于偶联，ECAR细胞试图利用糖酵解产生ATP来维持自己的能量平衡。
   FCCP治疗可用于计算的“备用”的定义是最大失控OCR和初步基础OCR之间的定量差异的细胞的呼吸能力。有人曾提出一些备用的呼吸能力，即使在最大的生理或病理生理刺激的条件下维护定义的活力和/或细胞的生存是一个主要因素。细胞的反应能力，能源需求增加的情况下强调的是影响了很大一部分的生物能量的线粒体能力。这种生物能的能力是由几个因素，包括能力的细胞线粒体和功能的电子传输所涉及的酶的能力提供基板，阻止开采
3. 在第三次注射，鱼藤酮，复杂的I抑制剂，加入到细胞中。这将关闭线粒体呼吸，使线粒体和非线粒体的分数来计算的促进呼吸。人们将观察在OCR减少由于线粒体功能受损，在ECAR随之增加的细胞转移到更糖酵解的状态，以保持其能量平衡
   鱼藤酮是一种线粒体抑制剂，以防止在复杂的Fe - S中心我泛醌（辅酶Q）的电子转移。我抑制这种复杂防止在NADH的潜在能量，在ATP的形式转换成可用能量。
   

2。试剂和材料

1. 寡，FCCP，鱼藤酮的解决方案（海马美图压力测试套件）
2. DMEM运行Media（海马＃100965-000）
3. DMSO（Sigma公司D8418）
4. 蒸馏水（Gibco公司15230-170）
5. 校准缓冲液（海马生命科学）

3。生长介质

1. 500毫升的DMEM（GIBCO 11965-092）
2. 10％胎牛血清（Hyclone公司SH90070.03）
3. 5毫升宾夕法尼亚/链球菌（GIBCO 15140-122）
4. 5毫升丙酮酸钠（Sigma公司S8636）
5. 5毫升Glutamax（GIBCO 35050-061）

4。播种协议

1. 的细胞接种于XF96细胞文化板10,000个细胞/孔 100μL培养液，并置于37℃ 与10％的_CO 2 ° C培养箱中培养。
2. 在1小时内，细胞将坚持XF96细胞培养板。
3. XF96 24小时后播种的检测细胞。

5。检测模板的制备

1. 使用分析向导（附录I），产生一个与以下组的布局模板：
   
   图1井的网格布局，确定列和组分配

6。复方制剂

1. 准备下列化合物在XF的DMEM含量媒体如下：
   10 UM寡，30.0 UM FCCP，20.0微米鱼藤酮，
   这些浓度的化合物注射入井时将要进行的的10倍稀释。工作浓度：
   1 UM寡，3.0 UM FCCP，2.0μM鱼藤酮

7。媒体的变化和细胞制备

1. 广场上的XF准备站的单元板
2. 设置最终成交量中等，每孔160μL。
3. 在37℃培养箱中孵育60分钟，让细胞平衡与检测介质前没有的CO _2。

8。载入传感器盒

1. 暖化合物为37 ° C装货前对传感器的墨盒装入喷油器的端口如下化合物：
   1. 列1-4：负载16，18和20μLXF含量媒体（DMEM）到端口A，B和C，分别。
   2. 列5-12：
      加载到端口16μL寡一个
      加载到端口B 18μLFCCP
      装入端口彗星20μL鱼藤酮

9。协议命令

命令	时间（min）	港口
校准
平衡
环路启动	3X
组合	3
等待	2
测量	3
循环结束
注入		一
环路启动	2X
组合	3
等待	2
测量	3
注入		乙
环路启动	2X
组合	3
等待	2
测量	3
注入		彗星
环路启动	2X
组合	3
等待	2
测量	3
完

表1。协议命令

讨论

这个实验是来自经典的实验探测线粒体功能和作为一个建立更为复杂的实验，旨在了解，在细胞的新陈代谢，线粒体功能和整体生物能的各种变化的框架。

应在本实验中使用的所有化合物的浓度提供了极大的作用的优化。也就是说，必须执行单独的滴定实验，以确定这些值。这是与FCCP尤其重要，作为滴定曲线往往是相当尖锐的，太多FCCP实际上可以减少在OCR的回应。典型的范围（终浓度），以测试将是：

• 0.1 - 1.0微克/毫升的寡
• 0.1 - 5.0 UM FCCP
• 0.1 - 1.0 UM鱼藤酮

请注意，每个上述化合物（尤其是FCCP）的反应将被检测媒体组成（基本类型，葡萄糖，丙酮酸，存在/ BSA的情况下，等）的影响。此外，如果XF检测媒体组成的改变，优化将需要重新执行。丙酮酸的存在和浓度是特别重要的，在取得最大呼吸能力由于FCCP。海马生物科学的观察，在一些细胞系，遗漏丙酮酸废除的细胞的能力，以最大限度地回应（基线以上）FCCP。通常情况下，浓度为1-10毫米丙酮酸，应进行测试，以了解最佳浓度的丙酮酸，以获得最大的呼吸。请注意，[丙酮酸]和[糖]，可能需要“跨滴定”，以获得最佳的媒体实验条件。

OCR随时间变化和另一个显示ECAR随时间的图形显示，本次实验的典型结果介绍如下：

图2。OCR的随时间变化

图3。ECAR随时间变化

在这里，我们观察到OCR和ECAR预期反应的细胞与每个连续的复合处理。对于寡，OCR作为ATP合成阻断线粒体复合物V.由于细胞不能合成ATP通过OXPHOS，他们恢复糖酵解，以满足他们对ATP的需求下降，因此，我们观察ECAR增加。如前所示，FCCP行为作为偶联剂。由于细胞必须克服跨线粒体膜的质子漏，OCR显着增加，更多的氧气被消耗掉多余的质子穿过线粒体膜泵。最后，鱼藤酮抑制线粒体复合物I和综合第三，分别，这会导致停止在电子传递链的电子流，从而氧气消耗量大幅降低。

图4呼吸参数。

除了呼吸和ECAR的预期变化，呼吸参数，可从这个数据。这是总结在上图中：

这里我们可以看到，我们可能会获得有关的基底细胞呼吸，致力于ATP的生产以及致力于维持质子梯度（H +泄漏）的金额的氧气消耗量的百分之的信息。此外，我们可能会耦合的呼吸（有时也被称为呼吸能力作为备用）的条件下获得最大的呼吸频率，最后，我们可以判断氧气消费量不因线粒体进程。

一个研究数量迅速增加是采用这种线粒体的个人资料，评估细胞的生物能，确定线粒体功能障碍和预测细胞的能力，以应对压力和/或侮辱。欲了解更多的信息和对本实验方法和备用呼吸能力的想法的细节， ^请参阅参考1-8以下出版物。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oligomycin, FCCP, Rotenone and Antimycin A Solutions	Seahorse Bioscience		Seahorse Mito Stress Test Kit
DMEM Running Media	Seahorse Bioscience	100965-000
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Distilled Water	GIBCO, by Life Technologies	15230-170
Calibration buffer	Seahorse Bioscience