Profilo Esperimento bioenergetica utilizzando cellule dei mioblasti C2C12

Riepilogo

Una descrizione di un metodo per la profilatura funzione mitocondriale nelle cellule è fornito. Il profilo mitocondriale generato fornisce quattro parametri della funzione mitocondriale, che può essere misurata in un esperimento: frequenza respiratoria basale, ATP-linked respirazione, perdita protonica, e la capacità di riserva.

Abstract

La capacità di misurare il metabolismo cellulare e comprendere la disfunzione mitocondriale, ha permesso agli scienziati di tutto il mondo per promuovere la loro ricerca nella comprensione del ruolo della funzione mitocondriale nell'obesità, tossicità diabete, invecchiamento, il cancro, la funzione cardiovascolare e sicurezza.

Metabolismo cellulare è il processo di assorbimento di substrato, come l'ossigeno, glucosio, acidi grassi, e glutammina, e conversione di energia attraverso una serie successiva di ossidazione enzimatica controllata e reazioni di riduzione. Queste reazioni biochimiche intracellulari risultato nella produzione di ATP, il rilascio di calore e sottoprodotti chimici, come il lattato e CO ₂ nell'ambiente extracellulare.

Informazioni preziose sullo stato fisiologico delle cellule, e l'alterazione dello stato di queste cellule, può essere ottenuta attraverso la misurazione del tasso di ossigeno consumato da parte delle cellule, un indicatore della respirazione mitocondriale - il tasso di consumo di ossigeno - o OCR. Cellule anche generare ATP attraverso la glicolisi, ovvero: la conversione del glucosio in lattato, indipendente di ossigeno. In pozzi colto, lattato è la fonte primaria di protoni. Misurare l'acido lattico prodotto indirettamente attraverso i protoni rilasciati nel mezzo extracellulare che circonda le cellule, che provoca acidificazione del mezzo fornisce extracellulare Vota acidificazione - o ECAR.

In questo esperimento, mioblasti C2C12 cellule vengono seminate ad una densità dato in lastre di cellule Seahorse cultura. Il consumo di ossigeno basale (OCR) e l'acidificazione extracellulare (ECAR) sono misurati per stabilire i tassi di riferimento. Le cellule sono poi metabolicamente perturbati da tre all'aggiunta di composti diversi (in successione) che spostano il profilo bioenergetico della cellula.

Questo test è derivato da un esperimento classico per valutare mitocondri e funge da quadro con cui costruire esperimenti più complessi volti a comprendere la funzione sia fisiologici e fisiopatologici dei mitocondri e di predire la capacità delle cellule di rispondere allo stress e / o insulti.

Protocollo

In questo esperimento, mioblasti C2C12 cellule vengono seminate ad una densità dato in lastre di cellule Seahorse cultura. Il consumo di ossigeno basale (OCR) e l'acidificazione extracellulare (ECAR) sono misurati per stabilire i tassi di riferimento.

1. Cellule di iniezione

Le cellule sono metabolicamente perturbati da tre all'aggiunta di composti diversi (in successione) che spostano il profilo bioenergetico della cellula. Un gruppo servirà come il controllo, con la corsa media, ha aggiunto il controllo "composti".

1. La prima iniezione è oligomicina. Oligomicina inibisce la sintesi di ATP, bloccando il canale protonico della porzione F _o ATP sintasi (complesso V). Nella ricerca mitocondriale, è usato per prevenire lo stato 3 (fosforilazione) respirazione. Con le cellule, può essere utilizzato per distinguere la percentuale di consumo di O2 dedicata alla sintesi di ATP e la percentuale di consumo di O2 necessari per superare la perdita naturale di protoni attraverso la membrana mitocondriale interna.
2. La seconda iniezione è FCCP. FCCP (carbonile cianuro-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) è un ionoforo che è un vettore di ioni mobili. Si tratta di un agente disaccoppiamento perché interrompe la sintesi di ATP da trasportare ioni di idrogeno attraverso la membrana mitocondriale invece del canale protonico della ATP sintasi (complesso V). Questo collasso del potenziale di membrana mitocondriale porta ad un rapido consumo di energia e ossigeno senza la produzione di ATP. In questo caso, sia OCR e ECAR aumenterà, OCR a causa di disaccoppiamento, e ECAR come le cellule tentativo di mantenere l'equilibrio energetico utilizzando glicolisi per produrre ATP.
   FCCP trattamento può essere usata per calcolare la capacità di "ricambio" delle cellule delle vie respiratorie che è definito come la differenza quantitativa tra massima incontrollata OCR e l'iniziale OCR basale. E 'stato proposto che il mantenimento di una certa capacità di riserva respiratoria anche in condizioni di massima stimolo fisiologico o fisiopatologico è uno dei principali fattori che definiscono la vitalità e / o la sopravvivenza delle cellule. La capacità delle cellule di rispondere allo stress, in condizioni di maggiore domanda energetica è in gran parte influenzato dalla capacità bioenergetiche dei mitocondri. Questa capacità bioenergetico è determinata da diversi fattori, inclusa la capacità della cellula di fornire supporto ai mitocondri e la capacità funzionale degli enzimi coinvolti nel trasporto degli elettroni
3. Nella terza iniezione, rotenone, un inibitore complesso I, si aggiunge alle cellule. Questa si spegnerà la respirazione mitocondriale e consentirà ad entrambe le frazioni mitocondriali e non contribuisce alla respirazione mitocondriale da calcolare. Un osserverà una diminuzione OCR a causa di alterata funzione mitocondriale, con un aumento concomitante ECAR come la cellula si sposta verso uno stato più glicolitica al fine di mantenere il proprio equilibrio energetico
   Rotenone è un inibitore mitocondriale che impedisce il trasferimento di elettroni dal Fe-S centro Complesso I ubichinone (coenzima Q). Questa inibizione del complesso I impedisce l'energia potenziale in NADH di essere convertito in energia utilizzabile sotto forma di ATP.
   

2. Reagenti e materiali

1. Oligomicina, FCCP, e soluzioni Rotenone (Seahorse Kit Mito stress test)
2. DMEM corsa Media (Seahorse # 100965-000)
3. DMSO (Sigma D8418)
4. Acqua distillata (Gibco 15230-170)
5. Calibrazione del buffer (Seahorse Bioscience)

3. Crescita media

1. 500 ml DMEM (Gibco 11965-092)
2. 10% FBS (Hyclone SH90070.03)
3. 5 ml Penn / Strep (Gibco 15140-122)
4. 5 ml Piruvato di sodio (Sigma S8636)
5. 5 ml Glutamax (Gibco 35050-061)

4. Semina protocollo

1. Le cellule sono seminate in piastre di colture cellulari XF96 con 10.000 cellule / pozzetto in 100 ml di mezzo di crescita e posti in incubatore a 37 ° C con 10% di CO _2.
2. Cellule aderiscono alla piastra di coltura cellulare XF96 entro 1 ora.
3. Cellule saggio in XF96 24 ore dopo la semina.

5. Preparazione del modello di analisi

1. Utilizzando la procedura guidata di analisi (Appendice I), generare un modello con il layout seguente gruppo:
   
   Figura 1. Layout di griglia ben identificare incarichi colonna e di gruppo

6. Composto di preparazione

1. Preparare i seguenti composti in XF DMEM Assay media come segue:
   10 oligomicina uM, uM FCCP 30,0, 20,0 Rotenone mM,
   Queste concentrazioni rappresentano la diluizione 10X, che sarà fatta quando i composti vengono iniettate nel pozzo. Le concentrazioni di lavoro sono:
   1 oligomicina uM, 3.0 uM FCCP, 2.0 mM Rotenone

7. Cambia mezzi e preparazione cellulare

1. Posizionare la piastra cella del Prep XF Stazione
2. Impostare il volume finale di media a 160 microlitri per bene.
3. Incubare a 37 ° C incubatore senza CO ₂ per 60 minuti per consentire alle cellule di pre-equilibrare con il terreno di coltura.

8. Caricamento della cartuccia del sensore

1. Composti calda a 37 ° C prima del caricamento della cartuccia sensore e caricare i composti nelle porte iniettore come segue:
   1. Colonne 1-4: Carico 16, 18 e 20 ml di XF Assay media (DMEM) nei porti A, B e C, rispettivamente.
   2. Colonne 5-12:
      Carico da 16 ml di oligomicina nei porti A
      Carico di 18 l di FCCP nei porti B
      Carico di 20 l di Rotenone nei porti C

9. Protocollo comandi

Comando	Tempo (min)	Porto
Calibrare
Equilibrare
Loop Start	3X
Mescolare	3
Aspettare	2
Misura	3
Loop End
Iniettare		A
Loop Start	2X
Mescolare	3
Aspettare	2
Misura	3
Iniettare		B
Loop Start	2X
Mescolare	3
Aspettare	2
Misura	3
Iniettare		C
Loop Start	2X
Mescolare	3
Aspettare	2
Misura	3
Fine

Tabella 1. Protocollo comandi

Discussione

Questo test è derivato dal classico esperimento per sondare la funzione mitocondriale e funge da quadro con cui costruire esperimenti più complessi volti a comprendere diversi cambiamenti nel metabolismo cellulare, la funzione mitocondriale, e bioenergetica generale.

Tutti i composti utilizzati in questo esperimento dovrebbe essere ottimizzato per la concentrazione che fornisce il massimo effetto. Che è, si deve eseguire esperimenti di titolazione separati per accertare questi valori. Questo è particolarmente importante con FCCP, come la curva di titolazione tende ad essere abbastanza forte, e FCCP troppo può effettivamente diminuire risposte in OCR. Range tipico (concentrazioni finali) per testare sarebbe:

• 0,1-1,0 ug / mL di oligomicina
• 0,1-5,0 uM FCCP
• 0,1-1,0 Rotenone uM

Si noti che le risposte a ogni composto sopra (soprattutto FCCP) sarà influenzata dalla composizione del test media (tipo di base, [glucosio], [piruvato], presenza / assenza di BSA, ecc.) Inoltre, se il test XF mezzi di comunicazione la composizione è cambiata, ottimizzazione dovranno essere nuovamente eseguite. La presenza e la concentrazione di piruvato è particolarmente importante per ottenere la massima capacità respiratoria a causa di FCCP. Seahorse Bioscience ha osservato in un numero di linee di cellule che omissione del piruvato abroga la capacità delle cellule di rispondere al massimo (di sopra del basale) per FCCP. Tipicamente, le concentrazioni di piruvato 1-10 mm dovrebbe essere testato per capire la concentrazione ottimale di piruvato di ottenere la massima respirazione. Si noti che [piruvato] E [glucosio] potrebbe essere necessario "cross-titolato" per ottenere le condizioni ottimali dei media per l'esperimento.

Risultati tipici di questo esperimento sono presentati qui di seguito in un grafico che mostra OCR in funzione del tempo e un altro che mostra ECAR tempo contro:

Figura 2. OCR vs Tempo

Figura 3. ECAR vs Tempo

Qui abbiamo osservato le risposte attese in OCR e ECAR come le cellule vengono trattate con ogni composto successive. Per oligomicina, OCR diminuisce a causa del blocco alla sintesi di ATP mitocondriale Complesso V. Poiché le cellule sono in grado di sintetizzare ATP via OXPHOS, ritornano a glicolisi per soddisfare la loro domanda di ATP, in tal modo si osserva un aumento della ECAR. Come mostrato in precedenza, FCCP agisce come un agente sganciamento. Dal momento che le cellule devono ora superare la perdita di protoni attraverso la membrana mitocondriale interna, OCR aumenta in maniera significativa come più O2 viene consumato per pompare i protoni in eccesso indietro attraverso la membrana mitocondriale. Infine, rotenone inibisce Complesso I mitocondriale e Complesso III, rispettivamente, che fa sì che il flusso di elettroni al cessare della catena di trasporto degli elettroni, e quindi il consumo di O2 è drasticamente ridotto.

Figura 4. Respirazione parametri

Al di là dei cambiamenti attesi nella respirazione e ECAR, una serie di parametri respiratori possono essere ottenute da questi dati. Questo è riassunto nella figura sopra:

Qui vediamo che si può ottenere informazioni circa la respirazione basale delle cellule, la percentuale di consumo di O2 dedicata alla produzione di ATP e l'importo destinato a mantenere il gradiente di protoni (H + a causa di perdite). Inoltre, possiamo ottenere la massima capacità respiratoria in condizioni di respirazione disaccoppiato (a volte indicato come ricambio capacità respiratoria) e, infine, siamo in grado di determinare la quantità di consumo di O2 non a causa di processi mitocondriali.

Un numero sempre crescente di studi stanno utilizzando questo profilo mitocondriale per la valutazione bioenergetica cellulare, identificare la disfunzione mitocondriale e di predire la capacità delle cellule di rispondere allo stress e / o insulti. Per ulteriori informazioni e dettagli su questo metodo sperimentale e l'idea di ricambio capacità respiratoria, consultare riferimento alle seguenti pubblicazioni ^1-8.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oligomycin, FCCP, Rotenone and Antimycin A Solutions	Seahorse Bioscience		Seahorse Mito Stress Test Kit
DMEM Running Media	Seahorse Bioscience	100965-000
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Distilled Water	GIBCO, by Life Technologies	15230-170
Calibration buffer	Seahorse Bioscience