Биоэнергетический Эксперимент профиля использования C2C12 клетках миобластов

Резюме

Описание метода для профилирования функции митохондрий в клетках предоставляется. Митохондриальной профиля порожденных предоставляет четыре параметра функции митохондрий, которые можно измерить в одном эксперименте: базальный уровень дыхания, АТФ-связанных дыхания, протон течь, и резервные мощности.

Аннотация

Возможность измерения клеточного метаболизма и понять митохондриальной дисфункцией, позволил ученым во всем мире для продвижения своих исследований в понимании роли функции митохондрий при ожирении, сахарном диабете, старения, рака, сердечно-сосудистой системы и безопасность токсичности.

Клеточного метаболизма это процесс поглощения подложки, такие как кислород, глюкоза, жирные кислоты и глутамина, и последующее преобразование энергии с помощью ряда ферментативно контролируемого окисления и восстановления реакций. Эти внутриклеточные биохимические реакции в результате производства АТФ, выделение тепла и химических побочных продуктов, таких как лактат и CO ₂ в внеклеточной среде.

Ценную информацию о физиологическом состоянии клеток, и изменение состояния этих клеток, могут быть получены путем измерения скорости потребляемого кислорода клетками, показатель митохондриального дыхания - Скорость потребления кислорода - или OCR. Клетки также генерировать АТФ через гликолиз, т.е. превращения глюкозы в лактат, независимо от кислорода. В культурной скважин, лактат является основным источником протонов. Измерение молочная кислота производится косвенно через протоны попадают внеклеточной среды, окружающей клетки, что вызывает закисление среды обеспечивает внеклеточного Подкисление Оценить - или ECAR.

В этом эксперименте C2C12 клетках миобластов высевают при заданной плотности в Морской конек пластин культуре клеток. Базального потребления кислорода (OCR) и внеклеточной подкисления (ECAR) ставки намерены установить базовые ставки. Затем клетки метаболически возмущенного три дополнения различных соединений (подряд), что сдвиг биоэнергетический профиль клеток.

Этот анализ происходит от классического эксперимента для оценки митохондрии и выступает в качестве основы, с которой для построения более сложных экспериментов, направленных на понимание как физиологических и патофизиологических функций митохондрий и прогнозировать способность клеток реагировать на стресс и / или оскорбления.

протокол

В этом эксперименте C2C12 клетках миобластов высевают при заданной плотности в Морской конек пластин культуре клеток. Базального потребления кислорода (OCR) и внеклеточной подкисления (ECAR) ставки намерены установить базовые ставки.

1. Клетки инъекций

Клетки метаболически возмущенного три дополнения различных соединений (подряд), что сдвиг биоэнергетический профиль клеток. Одна группа будет служить контролем, работает медиа добавлены как контроль "соединения".

1. Первая инъекция является олигомицину. Олигомицин ингибирует синтез АТФ путем блокирования протонного канала часть F _о АТФ-синтаза (комплекс V). В митохондриальной исследования, она используется для предотвращения состояния 3 (фосфорилирования) дыхания. С клетки, он может быть использован для отличать процент потребления О2 посвящена синтез АТФ, а доля потребления О2, необходимых для преодоления природных утечки протонов через внутреннюю мембрану митохондрий.
2. Вторая инъекция FCCP. FCCP (Карбонильные цианид-р-trifluoromethoxyphenylhydrazone) является ионофором то есть оператор мобильной связи иона. Это разобщение агента, поскольку он нарушает синтез АТФ за счет транспортировки ионов водорода через мембрану митохондрий, а не протона канал АТФ-синтазы (комплекс V). Это крах митохондриального потенциала мембраны приводит к быстрому потреблению энергии и кислорода без поколение АТФ. В этом случае, как OCR и ECAR будет увеличиваться, OCR-за разобщение, а ECAR как клетки попытке сохранить их энергетический баланс с помощью гликолиза для генерации АТФ.
   FCCP лечения может быть использована для расчета "запасных" дыхательные способности клеток, который определен как количественная разница между максимальным и неконтролируемое OCR начальной базальной OCR. Было высказано предположение, что сохранение некоторых запасных дыхательных мощностей даже в условиях максимальных физиологических или патофизиологических стимул является основным фактором, определяющим жизнеспособность и / или выживание клеток. Способность клеток реагировать на стресс в условиях повышенного спроса на энергию в большей части зависит от биоэнергетического потенциала митохондрий. Это биоэнергетический потенциал определяется несколькими факторами, включая способность ячейки для доставки субстрата митохондрий и функциональной способности ферментов, участвующих в электронном транспорте
3. В третьей инъекции, ротенон, комплекс ингибитор I, добавляется в клетки. Это позволит закрыть митохондриального дыхания и позволит обеим митохондриальной и не митохондриальной фракции способствуют дыханию, чтобы быть рассчитаны. Будет наблюдаться снижение OCR в связи с нарушением функции митохондрий, с сопутствующим увеличением ECAR как клетка переходит на более гликолитических государства в целях поддержания энергетического баланса
   Ротенон является митохондриальная ингибитор, который предотвращает переход электронов из Fe-S центр в комплексе, чтобы я убихинон (коэнзим Q). Это торможение Комплекс I препятствует потенциальной энергии в NADH от того, преобразуется в полезную энергию в виде АТФ.
   

2. Реагенты и материалы

1. Олигомицин, FCCP, и Ротенон Solutions (Морской конек Mito Stress Test Kit)
2. DMEM Запуск Media (Морской конек # 100965-000)
3. ДМСО (Sigma D8418)
4. Дистиллированная вода (Gibco 15230-170)
5. Калибровка буфер (Морской конек Bioscience)

3. Рост среднего

1. 500 мл DMEM (Gibco 11965-092)
2. 10% FBS (Hyclone SH90070.03)
3. 5 мл Пенн / Strep (Gibco 15140-122)
4. 5 мл пирувата натрия (Sigma S8636)
5. 5 мл Glutamax (Gibco 35050-061)

4. Посев протокола

1. Клетки высевают в XF96 клеточных культур пластин с 10 000 клеток / лунку в 100 мкл питательной среды и помещен в 37 ° С инкубатор с 10% CO _2.
2. Клетки будут придерживаться XF96 пластины культуре клеток в течение 1 часа.
3. Анализ клеток в XF96 24 часов после посева.

5. Подготовка Пробирной шаблона

1. Использование пробирного мастера (Приложение I), создавать шаблон следующее расположение группы:
   
   Рисунок 1. Ну макет сетки определения столбца и групповых заданий

6. Подготовка соединений

1. Подготовьте следующие соединения в XF DMEM Пробирной СМИ следующим образом:
   10 мкМ Олигомицин, 30,0 мкМ FCCP, 20,0 мкМ ротенон,
   Эти концентрации представляют 10X разведение, которые будут сделаны, когда соединения вводятся в колодец. Рабочая концентрация:
   1 мкМ Олигомицин, 3,0 мкМ FCCP, 2,0 мкМ Ротенон

7. Медиа Изменение и клеточной подготовка

Место ячейки пластины на XF Подготовка станции

Установить окончательный объем среды до 160 мкл на лунку.

Инкубируйте в 37 ° C инкубатор без CO ₂ в течение 60 минут, чтобы клетки предварительно уравновешиваются с анализа среды.

8. Загрузка датчика картриджа

1. Теплый соединений до 37 ° C до загрузки датчика картриджа и нагрузки соединений в портах инжектора следующим образом:
   1. Столбцы 1-4: 16 Нагрузка, 18 и 20 мкл XF Анализ средств массовой информации (DMEM) в порты A, B и C, соответственно.
   2. Столбцы 5-12:
      Нагрузка 16 мкл Олигомицин в порты
      Нагрузка 18 мкл FCCP в порты B
      Нагрузка 20 мкл Ротенон в порты C

9. Протокол команд

Команда	Время (мин)	Порт
Калибровать
Уравновешивать
Loop Start	3X
Смесь	3
Ждать	2
Мера	3
Loop End
Вводить
Loop Start	2X
Смесь	3
Ждать	2
Мера	3
Вводить		B
Loop Start	2X
Смесь	3
Ждать	2
Мера	3
Вводить		C
Loop Start	2X
Смесь	3
Ждать	2
Мера	3
Конец

Таблица 1. Протокол команд

Обсуждение

Этот анализ происходит от классического эксперимента для исследования митохондриальной функции и выступает в качестве основы, с которой для построения более сложных экспериментов, направленных на понимание различных изменений в клеточном метаболизме, функции митохондрий, и в целом биоэнергетики.

Все соединения, используемые в этом эксперименте должен быть оптимизирован для концентрации, которая обеспечивает максимальный эффект. То есть, надо выполнять отдельные эксперименты титрования установить эти значения. Это особенно важно с FCCP, как кривой титрования, как правило, довольно резкий, и слишком много FCCP может реально уменьшить ответы в OCR. Типичные диапазоны (конечные концентрации), чтобы проверить будет выглядеть так:

• 0,1 - 1,0 мкг / мл Олигомицин
• 0,1 - 5,0 мкМ FCCP
• 0,1 - 1,0 мкМ Ротенон

Обратите внимание, что ответы на каждое соединение выше (особенно FCCP) будет зависеть от состава анализа СМИ (базовый тип, [глюкоза], [пируват], наличие / отсутствие BSA и т.д.). Далее, если анализ XF СМИ состава меняется, оптимизации необходимо будет повторно выполнена. Наличие и концентрацию пирувата особенно важно в получении максимальной мощности дыхательной из-за FCCP. Морской конек Bioscience уже наблюдается в ряде клеток линий, что отсутствие пируват отменяет способность клеток реагировать максимально (выше базовой), чтобы FCCP. Как правило, концентрации 1-10 мМ пирувата должны быть проверены, чтобы понять оптимальной концентрации пирувата для получения максимального дыхания. Заметим, что [пируват] И [глюкоза], возможно, должны быть «кросс-титровать», чтобы получить оптимальные условия среды для эксперимента.

Типичные результаты этого эксперимента представлены ниже в график, показывающий OCR в зависимости от времени, а другой показывает ECAR в зависимости от времени:

Рисунок 2. OCR по времени

Рисунок 3. ECAR по времени

Здесь мы наблюдали ожидать ответов в OCR и ECAR как клетки обрабатывают с каждым последующим соединением. Для олигомицину, OCR уменьшается в результате блокирующий синтез АТФ на митохондриальной комплекс V. Так как клетки не способны синтезировать АТФ через OXPHOS, они возвращаются к гликолиза, чтобы удовлетворить свои потребности в АТФ, таким образом, мы наблюдаем увеличение ECAR. Как было показано ранее, FCCP выступает в качестве агента расцепления. Поскольку клетки теперь должны преодолеть протонов утечки через внутреннюю мембрану митохондрий, OCR значительно возрастает по мере O2 потребляется для перекачки избыточных протонов назад через митохондриальную мембрану. Наконец, ротенон ингибирует митохондриальный комплекс я и комплекс III, соответственно, в результате чего поток электронов прекратить в электрон-транспортной цепи, и, следовательно, потребление О2 резко снижается.

Рисунок 4. Дыхание параметры

Помимо ожидаемых изменений в дыхании и ECAR, число дыхательных параметров могут быть получены из этих данных. Это суммированы на рисунке выше:

Здесь мы видим, что мы можем получить информацию о базальной дыхание клеток, процент потребления О2 посвящена АТФ производства, а также количество посвященных поддержанию протонный градиент (из-за утечки Н +). Кроме того, мы можем получить максимальные частоты дыхания в условиях несвязанных дыхания (иногда их называют запасных дыхательной емкости) и, наконец, мы можем определить объем потребления О2 не из-за митохондриальных процессов.

Быстро растущего числа исследований использования этого митохондриальной профиля для оценки сотовой биоэнергетика, выявление митохондриальной дисфункции и прогнозировать способность клеток реагировать на стресс и / или оскорбления. Более подробную информацию и подробную информацию об этом экспериментальный метод и идея запасных дыхательной емкости, см. ссылки на следующие публикации ^1-8.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oligomycin, FCCP, Rotenone and Antimycin A Solutions	Seahorse Bioscience		Seahorse Mito Stress Test Kit
DMEM Running Media	Seahorse Bioscience	100965-000
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
Distilled Water	GIBCO, by Life Technologies	15230-170
Calibration buffer	Seahorse Bioscience