V3的HIV - 1取向的基因型推理使用人口为基础的测序

摘要

可以推断出艾滋病毒嗜性病毒包膜V3区。 V3是一式三份，采用巢式RT - PCR扩增，测序，PCR扩增，并解释使用生物信息学软件。被列为非R5病毒与G2P分数低1个或多个序列（S）的样品。

摘要

背景：收到CCR5拮抗剂类艾滋病毒治疗的一个药物之前，患者必须接受艾滋病毒嗜性测试，以确认他或她的病毒的人口使用蜂窝进入了CCR5辅助受体，而不是替代辅助受体。向性测试的方法之一，是研究HIV包膜，与辅助受体相互作用的V3区序列。

方法：从血浆中提取病毒RNA。 V3区是一式三份嵌套逆转录PCR扩增。的扩增，测序和分析软件，RE_Call。如geno2pheno生物​​信息学算法推断病毒嗜从V3区序列，然后提交。推断序列被非R5，如果他们geno2pheno的假阳性率低于5.75％。如果从样品中的三个序列中的任何一个推断非R5，病人是不会回应一个CCR5拮抗剂。

研究方案

程序：

1。提取：

此基因型的艾滋病毒嗜测试样本输入所需的至少500μL血浆。

1. easyMAG（生物梅里埃）自动提取，或提取您的实验室的首选方法500μL血浆中提取的HIV RNA。
   成60微升等分洗脱提取的病毒RNA。贮存在-20摄氏度或反向转录- PCR解压后立即开始。

2。 RT - PCR检测：

样品提取液4μL将被放大，用巢式RT - PCR方法一式三份。必须建立的RT - PCR反应在PCR洁净室。

1. 计算被放大的样本数量所需的试剂用量。按照下面的说明1反应试剂卷表。
   

   试剂	量（μl） （1X反应）
   DEPC处理水	10.56
   2倍的反应缓冲液	20
   50％的蔗糖和0.04％溴酚蓝混合	4
   针对艾滋病毒V3区的上游引物	0.32
   反向引物	0.32
   酶 - 标​​第三步白金Taq DNA聚合酶RT - PCR系统	0.8
   共有	36

   表1 1单步RT - PCR反应所需的试剂卷。
   每一个步骤RT - PCR反应需要以下几招：
   • 10.56μL，DEPC处理水
   • 20μL的反应缓冲液2倍
   • 4μL，50％的蔗糖和0.04％溴酚蓝混合
   • 0.32μL的远期目标艾滋病毒V3区引物
   • 0.32μL的反向引物
   • 0.8μL的酶
   对于一个总的36μL每反应。
2. 打成线了旁边一个空行中的样品提取液管，96孔PCR板。
3. 使用一个中继器移液器，加36μL样本混合，以每孔PCR板，有3口井是每个样本提取物准备。
   *注意：此过程必须一式三份，以最低的，以确保有足够的采样病毒的人口。
4. 使用8通道多道移液器，将其3井的样品提取液4μL。更改彼此之间另外的提示。
5. 用PCR地带帽盖井。
6. 当转移是comlete，放置在一个热循环PCR板。设置热循环与下面的程序运行：30分钟52℃2分钟94 ° C，40个周期（15秒94℃，在5530秒° C和1.5分钟在68℃）5分钟68 ° C
7. 删除从热循环PCR板。板可以在室温下保存。

继续进行第二轮PCR步骤

3。第二轮PCR：

1. 计算被放大的样本数量所需的试剂用量。按照下面的说明1反应试剂卷表。
   

   试剂	量（μl） （1X反应）
   DEPC处理水	13.45
   60％的蔗糖，0.08％甲酚红混合	2
   罗氏公司的HiFi系统缓冲区2	2
   MgCl 2的	0.8
   的dNTP	0.16
   正向PCR引物	0.15
   反向PCR引物	0.15
   展开高保真酶	0.29
   共有	19

   表2：1 ^的第二轮PCR反应所需试剂卷。
   每个第二轮PCR反应需要以下几招：
   • 13.45μL，DEPC处理水
   • 2μL60％蔗糖，0.08％甲酚红混合
   • 2μL罗氏高保真系统缓冲区2
   • 0.8μLMgCl _2的 25毫米
   • 0.16μL，25毫米的dNTP
   • 0.15μL，两者的正向和反向PCR引物
   • 0.29微升展开高保真酶
   总额的19％μL反应。
2. 在后放大室，采用8通道多道移液器，转移到第二轮PCR缓冲液1μLRT - PCR的模板。更改彼此之间另外的提示。
3. PCR地带帽盖井和第二轮PCR板转移到热循环。
4. 设置热循环与下面的程序运行：2分钟94 ° C 35个周期（15秒94℃，30秒，在55℃，1分钟72 ° C）7分钟，在72 ° C
5. 删除板从热循环后的温度已恢复到25 ° C。

4。凝胶电泳：

为了确认，V3区已成功地扩增，凝胶电泳的步骤执行。

1. 准备琼脂糖凝胶琼脂糖粉0.8克，50毫升的1X TAE缓冲。搅拌融化〜1分钟或微波，直到琼脂糖完全溶解。
2. 加入6μL安全的SYBR凝胶染色和漩涡混合。
3. 倒入凝胶托盘的解决方案，并补充足够的凝胶梳子，以适应PCR检测井的数量。
4. 一旦凝胶干燥，取出梳子和地方凝胶，凝胶仪器，以确保它是完全淹没在1X TAE缓冲。
5. 使用10μL多道移液器，加其在自己的凝胶以及每个PCR样品8μL。盖PCR板，扩增后的凝胶已被添加到。
6. 加入6μL的DNA阶梯，每行至少有一个。
7. 运行〜100V〜10分钟的凝胶仪器，确保，带不跑凝胶。
8. 到紫外线的反式照明灯凝胶和凝胶的图片。
   PCR扩增的DNA井会出现亮，说明一个成功的放大。
9. 请注意：所有样品的三个扩增成功。如有必要，重复这些样本少于3扩增RT - PCR检测。

进行测序

5。测序：

病毒基因扩增后，样品可以准备进行测序。测序反应，应在一个放大后室地方。

1. 从冰箱和测序引物，从冰箱中取出BigDye。让BigDye在室温下解冻，不超过1小时。
2. 计算运行的样本数量所需的试剂用量。按照下面的说明1反应试剂卷表。
   

   试剂	量（μl） （1X反应）
   BigDye	0.3
   BigDye缓冲区	2.1
   底漆	2.6
   共有	5.0

   表3。试剂卷1测序反应。
   *注：准备为每个​​引物单独组合。
   **注：BigDye缓冲区用于测序反应，可作如下准备：混合17.5毫升Trizma盐酸缓冲溶液（pH9.0）（1米）和氯化镁0.125毫升（1米）。把100毫升的试剂级水终体积。这应该是存储在2-8 ° C。
3. 从3.3中使用的计算，准备为每个​​引物和不超过5秒的旋涡混合的测序反应。分装成悬液0.2ml地带管。
4. 分装5μL测序反应混合到适当的板采用多道移液器井。罩板（S），其中包含一个Kimwipe测序反应混合，待用。
5. 准备加入180μL无菌水巴克斯特，其余的PCR产物的扩增PCR产物1:15稀释。
6. 加入1μL稀释后的样品，以适当的板井底部，改变枪头。
7. 当完成转移样品，密封带帽子和涡板1秒
8. 放置在离心机板。 145克，当旋转速度达到145克设置速度，停止旋转。
9. 板放置在下面的程序设置为一个热循环仪（S）：25个循环（10秒@ 96 ° C，5秒，50℃，55秒@ 60 ° C。）量应至少6μL 。这个周期应该采取大约1.2小时。

继续降水

6。降水：

“清理”病毒的基因测序反应，进行乙醇沉淀，用95％乙醇。

1. 从热循环检索板块，并带来一个后放大器fication房间。
2. 删除地带的上限和地点，以便他们在一个干净的纸巾或Kimwipe。
3. 移液器4μL工作EDTA的醋酸钠溶液每个样品的一面。塔盘轻轻EDTA钠溶液下降到井底。可以使用同样的技巧，只要不接触样品在井底。
   *注：工作EDTA的醋酸钠溶液可作如下准备：
   1. 准备246.1克醋酸钠溶解于1 L试剂级水3M醋酸钠。 0.45微过滤器的过滤解决方案，并准备50毫升分装。
   2. 准备库存EDTA -乙酸钠溶液（1.5米NaOAc，250毫米EDTA）混合等量的醋酸钠（3米）和EDTA溶液（500毫米），pH值8.0。
   3. 准备工作EDTA - 醋酸钠溶液混合EDTA - 醋酸钠溶液与试剂级水（10毫升+ 30毫升）三部分组成的一个部分股票。
4. 移取40μL到对面的样品井，并冷冻95％的乙醇取代地带帽。
5. 密封帽和旋涡10秒板。点触板，驱逐任何气泡。
6. 放置至少30分钟，最多2小时冷冻在-20 ° C的板块。
7. 1. 一旦发生降水，从冰箱和一个20分钟3700转离心中删除的板块。
   2. 从冰箱中取出适量的高迪甲酰胺（美国应用生物系统公司），使其能够解冻之前变性。
   *注：一个完​​整​​的96孔板变性要求960μL希迪甲酰胺，因此它有利于事先准备〜1.1mL等分。
8. 在纺织板块中，删除和丢弃的条形帽。反转盘在废物容器（如垃圾箱），倒出上清液。任何剩余的上清摆脱印迹纸巾倒板。
9. 折板面2张纸巾和地点。在离心机和旋转板面朝下放置在145克，停止旋转，当它到达145克。
10. 从离心机中取出的钢板和检查，以确保井空。移液器155μL冷冻入井95％的乙醇。
11. 丢弃到废物的容器和纸巾的污点上清，重复离心4.10。
12. 从离心机中取出盘子后，丢弃用过的纸巾，让板的立场面对2-5分钟，以允许任何剩余的乙醇蒸发。

继续以变性

7。变性

1. 检索到一个容器足够大的多道移液器解冻希迪甲酰胺和倒出，
   *注：如果使用预分装的措施为6.7b指出，一管是要运行的每个96孔板需要。
2. 使用多道移液器，分发到所有的孔10μL希迪甲酰胺盘上，包括那些都是空的。
3. 与隔垫覆盖板，形成一个密封。
4. 2分钟，放置于90 ° C的板在热循环。
5. 变性后，放置在一个盘子持有的板块，然后加载到音序器。上传一个准备测序布局。板可保持在-20 ° C，最多一个星期前执行的测序运行。

8。使用基本电话软件产生的数据分析。

1. 使用召回执行调用，无需人工干预的自动基地，单引物覆盖是可以接受的的。召回是一个自定义的基本电话软件，可以在以下网址找到：http://pssm.cfenet.ubc.ca/
   *注：需要登录的帐户。要建立一个帐户，点击“注册”按钮，在登录页面。一旦帐户已经创建，您可以访问上传页面。
2. 登录后，您可以选择上传样本文件。使用“浏览”选项，您可以找到您的原始序列数据的上传与最大的20MB上传。
   *注：。。网站召回将只接受在一个zip ABI和SCF文件中的数据文件，tar或tar.gz文件
3. 一旦上载的文件已被选中，选择您的参考序列。在这种情况下，可以肯定的参考序列设置为“V3”。现在您可以点击“过程数据。”
4. 处理过的数据会出现“标题下的旧的样本。”页面右侧每个运行或样本集处理，将被放置在标有日期的文件夹。这些可以被重新标记，点击“重命名”按钮。
5. 点击文件夹，将弹出的样本清单。是红色的那些失败，那些都是绿色的已经过去了。通过点击一个特定的样本和“查看”按钮，你可以审查序列。按照页面右侧的指示导航THROUGH序列。
   *注：对于这种方法，是可以接受的出口通过召回（以绿色显示），无需人工干预，自动序列的。
6. 如果您对结果感到满意，你可以选择点击下载通过序列“下载”。一个压缩文件夹中的文件将被下载。
   *注：根据“设置”，您可以选择下载和电子邮件选项，包括文件类型。
7. 未能出示清洁一式三份序列的样品应reamplified摘录一式三份。如果RePCR未能提供一个清洁的顺序，最小的2个序列向性推断是可以接受的。

9。使用Geno2pheno合作受体算法人口为基础的测序序列推断病毒嗜性。

1. 序列可以在以下网址：http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php geno2pheno辅助受体服务贯穿。
2. 要上传的样品可以被标注为挺直腰杆。从降下来的意​​义设置菜单，选择“从临床数据分析为基础的优化截断激励（2％和5.75％，FPR）”
3. 选择上传或粘贴序列进行分析，FASTA文件是可以接受的的。
4. geno2pheno FPR可以作如下解释：G2P FPR> 5.75代表一个R5的使用病毒的人口可能回应CCR5的拮抗剂G2P FPR <5.75代表非R5病毒的人口;不大可能回应CCR5的拮抗剂。 G2P <2是不太可能有任何CCR5拮抗剂的反应。如果从样品中的三个序列中的任何一个推断非R5，病人是没有可能回应到CCR5的拮抗剂。

10。代表性的成果

正确执行协议时，不要指望成功序列2个或3个，每个样品重复。样品一起运行的底片应该没有任何指示的R​​NA。大多数的序列的“通行证”召回basecalling。

基于R5和非R5社区内的病毒人口的分布，大多数的随机选择的病人样本，预计将有R5，使用病毒。因此，除非该项目的设计建议，否则，不要指望有超过非R5样品R5。

表1：A）1反应的一步法RT - PCR和B）的热循环程序要进行RT - PCR反应所需的试剂卷。

一）

试剂	量（μl） （1X反应）
DEPC处理水	10.56
2倍的反应缓冲液	20
50％的蔗糖和0.04％溴酚蓝混合	4
正向引物SQV3F1	0.32
反向引物CO602	0.32
酶 - 标​​第三步白金Taq DNA聚合酶RT - PCR系统	0.8
共有	36

*注意：
SQV3F1引物序列：5'GAG文建会ATT CCC认证的ATA CAT达TGT的3'
CO602引物序列：5'GCC CAT AGT GCT TCC TGC TGC TCC民航局GAA CC 3“

二）

循环号	时间	温度
1	30分钟	52℃
1	2分钟	94℃
40	15秒	94℃
	30秒	55℃
	1.5分钟	68℃
1	5分钟	68℃

表2 A）第二轮PCR反应1和B）的热循环程序要进行第二轮PCR反应所需的试剂卷。

一）

试剂	量（μl） （1X反应）
DEPC处理水	13.45
60％的蔗糖，0.08％甲酚红混合	2
罗氏公司的HiFi系统缓冲区2	2
氯化镁 2	0.8
的dNTP	0.16
正向引物SQV3F2	0.15
反向引物CD4R	0.15
展开高保真酶	0.29
共有	19

*注意：
SQV3F2引物序列：5'TGT的海湾合作​​委员会共同国家评估GCT GGT TTT GCG在3'
CD4R引物序列：5'达亚洲空运中心TCA铁通反恐委员会民航局TTG TCC的3'

二）

循环号	时间	温度
1	2分钟	94℃
35	15秒	94℃
30秒	55℃
1分钟	72℃
1	7分钟	72℃

表3 A）1测序反应和二）热循环程序要进行测序反应所需的试剂卷。

一）

试剂	量（μl） （1X反应）
BigDye	0.3
BigDye缓冲区	2.1
底漆 远期V3FO2F 反向SQV3R1	2.6
共有	5.0

*注意：不要将引物，引物各准备一个单独的组合应
V3O2F引物序列：5'亚洲空运中心GTC的AGY ACA的多伦多民航局的TGT ACA的C 3“
SQV3R1引物序列：5'GAA TTC AAA级CCT TCC ACA的AT＆T AAA级3“

二）

循环号	时间	温度
25	10秒	96℃
5秒	50℃
55秒	60℃

讨论

这里介绍的方法是一个标准的测序方法应用于向性测试。 HIV包膜V3循环测序预测病毒嗜性的临床应用，直到深夜被限制。 maraviroc（欢跃医疗）临床试验的回顾性分析，此方法已被证明至少同样能够预测病毒嗜性，在临床上常用的其他验证分析比较。

有许多好处执行向性预测V3环的基因型分析。首先，这个程序可以在任何设施进行经营的测序设备，大大增加了获取和减少周转时间向性测试。相比较而言，表型增强敏感性Trofile含量（ESTA）（的Monogram Biosciences公司），其中有向性测试的黄金标准，是在南加州的一个中心。其他好处包括要求的起始原料和最低要求的血浆病毒载量的500copies/mL。同时，运行的基因型检测的营运成本相对较低的表型检测的比较。召回的软件的使用，特别是消除了手动顺序审查的要求，这往往是一个劳动力密集的基因型分析。

这里介绍的方法非常简单，没有特别的又一步骤抵销的重要性。我们建议运行PCR和测序，一式三份，以增加病毒样本人口内捕捉少数物种的可能性。可进行复制大于3，但是我们已经发现一式三份，高效，可靠的。我们也建议采用一步到位逆转录PCR试剂盒（QIAGEN）执行同样的反应，同时保持高灵敏度和特异性都RT - PCR和第一轮PCR。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNA extraction using NucliSens easyMAG version 1.0
NucliSens easyMAG Magnetic Silica	bioMerieux	cat. # 280133	(48 x 0.6 ml)
NucliSens easyMAG Lysis Buffer	bioMerieux	cat. # 280134	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 1	bioMerieux	cat. # 280130	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 2	bioMerieux	cat. # 280131	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 3	bioMerieux	cat. # 280132	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG version 1.0	bioMerieux
Class II A2 biological safety cabinet
One-Step Reverse Transcriptase PCR and Second Round PCR
DEPC-treated water	Ambion	cat. # 9922
SuperScrip III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq High Fidelty	Invitrogen	cat#12574-035	Kit components used: - SuperScript III RT/ Platinum Taq High Fidelty Enzyme Mix - 2X Reaction Mix (a buffer containing 0.4mM of each dNTP, 2.4mM MgSO4)
Expand High Fidelity PCR System	Roche Group	cat. # 1 759 078	Kit components used:- Expand High Fidelity Buffer 10X conc. with 15 mM MgCl2 (lids labelled 2)- Expand HF PCR Enzyme Mix (3.5U/μl)- MgCl2 Stock Solution (25mM) (lids labelled 4)
dNTPs: dATP, dGTP, dCTP, dTTP	Roche Group	cat. # 11969064001	(100 mM)
Sucrose	Sigma-Aldrich	cat. # S0389-500G
Bromophenol blue sodium salt	Sigma-Aldrich	cat.# B5525
Cresol Red	Sigma-Aldrich	cat.# 114472-5G	indicator grade
Thermocycler
Gel Electrophoresis
50X TAE buffer	Invitrogen	cat. # 24710030	(1000 ml)
SYBR Safe DNA gel stain	Invitrogen	cat. # S33102
Agarose (ultra pure)	Invitrogen	cat. # 15510-027
E-Gel Low Range Quantitative DNA Ladder	Invitrogen	cat. # 12373-031
Reagent Grade Type II water
Gel apparatus
Sequencing
ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit	Applied Biosciences	cat. # 4337458	(25000 reactions)
Hi-Di Formamide	Applied Biosciences	cat. # 4311320
Sodium Acetate (NaOAc)	Sigma-Aldrich	cat. # S-2889
EDTA	Sigma-Aldrich	Cat.# 03690-100ML	0.5M, pH=8.0
TRIZMA Hydrochloride Buffer Solution	Sigma-Aldrich	cat. # T-2819	1 M, pH 9.0
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	cat. # M-1028	1 M
95% Ethanol
Running Buffer (10X) with EDTA	Applied Biosystems	cat. # 4335613	500 mL
Polymer Pop-7 (25mL) Or Polymer Pop-7 (10mL)	Applied Biosystems	cat. # 44363929 or cat. # 4352759
3700/3730 BigDye Terminator v3.1 Sequencing Standard Kit	Applied Biosciences	Cat# 4336943
Thermocycler
Centrifuge with plate holders
3730xl DNA Analyzer	Applied Biosciences