Inférence génotypique de tropisme du VIH-1 en utilisant la population basée séquençage du V3

Résumé

VIH tropisme peut être déduite de la région V3 de l'enveloppe virale. V3 est amplifié par PCR en triple en utilisant RT-PCR nichée, séquencé, et interprétées en utilisant un logiciel de bioinformatique. Les échantillons ayant des séquences 1 ou plusieurs (s) avec des scores faibles G2P sont classés comme non-virus R5.

Résumé

Contexte: Avant de recevoir un médicament à partir du CCR5 antagoniste classe dans le traitement du VIH, le patient doit subir un test de tropisme du VIH pour confirmer que la population de son virale utilise le corécepteur CCR5 pour entrer cellulaire, et non pas un corécepteur alternatif. Une approche de test de tropisme est d'examiner la séquence de la région V3 de l'enveloppe du VIH, qui interagit avec le corécepteur.

Méthodes: ARN viral est extrait du plasma sanguin. La région V3 est amplifié en triple avec imbriquées de la transcriptase inverse-PCR. Les amplifications sont ensuite séquencé et analysé en utilisant le logiciel, RE_Call. Les séquences sont ensuite soumises à un algorithme de bioinformatiques tels que geno2pheno d'inférer tropisme viral à partir de la région V3. Les séquences sont présumées être non-R5 si leur geno2pheno taux de faux positifs est inférieur à 5,75%. Si l'un des trois séquences à partir d'un échantillon est déduite d'être non-R5, le patient est peu probable pour répondre à une CCR5 antagoniste.

Protocole

Procédure:

1. Extraction:

Au moins 500 pi de plasma sanguin est nécessaire que l'entrée de l'échantillon pour ce test de tropisme du VIH génotypiques.

1. Extrait de l'ARN du VIH 500μL de plasma utilisant une easyMAG (bioMérieux) automatisé d'extraction, ou de la méthode d'extraction préférée de votre laboratoire.
   Éluer l'ARN extrait viral dans une aliquote de 60 uL. Conserver à -20 degrés Celsius ou commencer Reverse Transcriptase-PCR immédiatement après l'extraction.

2. RT-PCR:

4μL d'extrait d'échantillon sera amplifié, en trois exemplaires à l'aide RT-PCR nichée méthodes. La réaction de RT-PCR doit être mis en place dans une salle de PCR-propre.

1. Calculer la quantité de réactif nécessaire pour le nombre d'échantillons à amplifier. Suivez le tableau ci-dessous indique les volumes de réactif pour une réaction.
   

   Réactifs	Volume (uL) (1X réaction)
   L'eau traitée au DEPC	10,56
   Tampon de réaction 2x	20
   50% de saccharose et 0,04% bleu de bromophénol mélangez	4
   Amorces sens ciblant la région du VIH V3	0,32
   Amorce antisens	0,32
   Enzyme - SuperScript III One-Step RT-PCR System avec l'ADN polymérase Taq Platinum	0.8
   Total des	36

   Tableau des volumes Réactif 1. Requis pour une réaction de One-Step RT-PCR.
   Chaque One Step RT-PCR requiert la recette suivante:
   • 10,56 uL d'eau DEPC traitées
   • 20 pl de tampon de réaction 2x
   • 4μL de saccharose 50% et 0,04% bleu de bromophénol mélangez
   • 0,32 uL de l'amorce sens ciblant la région du VIH V3
   • 0,32 uL de l'amorce antisens
   • 0,8 uL d'enzyme
   Pour un total de réaction par 36μL.
2. Alignez les tubes d'extrait d'échantillon dans une rangée à côté d'un vide, étiquetés plaque de 96 puits PCR.
3. Avec une pipette à répétition, ajouter 36 ul de mélange échantillon dans chaque puits de la plaque PCR, tels qu'il ya trois puits préparé pour chaque extrait d'échantillon.
   * Note: Cette procédure doit être effectuée en trois exemplaires, au minimum, pour assurer un échantillonnage adéquat de la population virale.
4. En utilisant une pipette multicanaux à 8 canaux, ajouter 4μL d'extrait d'échantillon à chacun de ses trois puits. Changer d'embout entre chaque addition.
5. Couvrir les puits avec des bouchons de bande PCR.
6. Lorsque le transfert a été remplie, placer la plaque PCR dans un thermocycleur. Réglez le thermocycleur pour fonctionner avec le programme suivant: 30 minutes à 52 ° C 2 minutes à 94 ° C 40 cycles de (15 secondes à 94 ° C, 30 secondes à 55 ° C et 1,5 minutes à 68 ° C) 5 minutes à 68 ° C
7. Retirer la plaque PCR à partir thermocycleur. Plaque peut être conservé à température ambiante.

Passez à l'étape seconde PCR rondes

3. Deuxième tour de PCR:

1. Calculer la quantité de réactif nécessaire pour le nombre d'échantillons à amplifier. Suivez le tableau ci-dessous indique les volumes de réactif pour une réaction.
   

   Réactifs	Volume (uL) (1X réaction)
   L'eau traitée au DEPC	13,45
   60% de saccharose, 0,08% de crésol rouge mix	2
   Roche HiFi système tampon 2	2
   MgCl 2	0.8
   dNTP	0,16
   Amorce de PCR	0,15
   Inverse d'amorces PCR	0,15
   Développer HiFi enzymatiques	0,29
   Total des	19

   Tableau 2. Volumes de réactifs nécessaires à une réaction de 2 ^ème PCR ronde.
   Chaque seconde de réaction PCR nécessite rondes la recette suivante:
   • 13,45 uL d'eau DEPC traitées
   • 2 uL de saccharose 60%, 0,08% de crésol rouge mix
   • 2 pi de Roche Hifi système tampon 2
   • 0,8 ul de 25 mM MgCl ₂
   • 0,16 ul de 25 mM de dNTP
   • 0,15 uL les deux avant et arrière amorces PCR
   • 0,29 uL Développer l'enzyme HiFi
   Pour un total de 19 ul par réaction.
2. Dans une salle de PCR-propre, en utilisant une pipette à répétition, ajouter 19 uL de tampon de réaction par puits d'une plaque propre PCR.
3. Dans une salle de post-amplification, utilisant une pipette multicanaux à 8 canaux, le transfert 1 ul du modèle RT-PCR dans le tampon de deuxième ronde de PCR. Changer d'embout entre chaque addition.
4. Couvrir les puits avec des bouchons de bande PCR et le transfert de la plaque de deuxième ronde PCR pour un thermocycleur.
5. Réglez le thermocycleur pour fonctionner avec le programme suivant: 2 minutes à 94 ° C 35 cycles de (15 secondes à 94 ° C, 30 secondes à 55 ° C, 1 minute à 72 ° C) 7 minutes à 72 ° C
6. Retirer la plaque du thermocycleur après que la température est revenue à 25 ° C.

4. Électrophorèse sur gel:

Afin de confirmer que la région V3 a été amplifié avec succès, une étape d'électrophorèse sur gel est réalisée.

1. Préparer un gel d'agarose à 0,8 g de poudre d'agarose dans 50 ml de tampon TAE 1X. Remuer et faire fondre au micro-ondes pendant environ 1 minute ou jusqu'à ce que l'agarose est complètement dissous.
2. Ajouter 6 uL d'un gel SYBR sûre tache et faire tourbillonner pour mélanger.
3. Verser la solution dans un plateau de gel, et ajouter assez de gel de peignes pour accueillir le nombre de puits de PCR.
4. Une fois que le gel est sec, enlever les peignes et placer le gel dans l'appareil de gel, en s'assurant qu'il est complètement immergé dans du tampon TAE 1X.
5. En utilisant une pipette multicanaux 10 uL, ajouter 8μL de chaque échantillon de PCR pour son propre puits dans le gel. Recouvrir la plaque PCR après les amplifications ont été ajoutés au gel.
6. Ajouter 6 uL d'échelle d'ADN d'au moins un puits par rangée.
7. Exécutez l'appareil gel à ~ 100V pour ~ 10 minutes, en s'assurant que les bandes ne fonctionnent pas hors gel.
8. Placer le gel sur une UV trans-illuminateur et prendre une photo du gel.
   Wells avec amplifiée par PCR ADN apparaîtra, indiquant une amplification réussie.
9. Prenez note de tous les échantillons où trois amplifications ont été succès. Si nécessaire, répétez la RT-PCR pour les échantillons de moins de trois amplifications.

Procéder à un séquençage

5. Séquençage:

Après avoir amplifié ADNc viral, les échantillons peuvent être préparés pour le séquençage. La réaction de séquençage devrait avoir lieu dans une salle de post-amplification.

1. Retirer BigDye du congélateur et amorces de séquençage du réfrigérateur. Laissez le dégel BigDye à température ambiante, pour pas plus de 1 heure.
2. Calculer la quantité de réactif nécessaire pour le nombre d'échantillons doit être exécuté. Suivez le tableau ci-dessous indique les volumes de réactif pour une réaction.
   

   Réactifs	Volume (uL) (1X réaction)
   BigDye	0.3
   BigDye Tampon	2.1
   Apprêt	2.6
   Total des	5,0

   Tableau des volumes Réactif 3. Requis pour une réaction de séquençage.
   * Note: Préparer un mélange séparé pour chaque amorce.
   ** Remarque: Le tampon BigDye utilisé dans la réaction de séquençage peuvent être préparés comme suit: Mix 17,5 mL de solution tampon Trizma chlorhydrate (1 M) (pH9.0) et 0,125 ml de chlorure de magnésium (1 M). Amener le volume final à 100 ml avec de l'eau de qualité réactif. Ce doit être stocké à 2-8 ° C.
3. En utilisant les calculs de 3,3, de préparer la réaction de séquençage des mélanges pour chaque amorce et vortex pour pas plus de 5 secondes. Aliquoter dans des tubes de 0.2ml bande.
4. Aliquote de 5 ul de séquençage mélange réactionnel dans les puits des plaques appropriées en utilisant une pipette multicanaux. Recouvrir la plaque (s) contenant le mélange réactif avec un séquençage Kimwipe et mis de côté.
5. Préparer une dilution 1:15 de produit amplifié par PCR en ajoutant 180 ul d'eau stérile pour Baxter le produit restant PCR.
6. Pipeter 1 pl de l'échantillon dilué au fond du puits de la plaque échéant, le changement des embouts de pipette.
7. Lorsque vous avez terminé le transfert de l'échantillon, le joint de la plaque avec des bouchons de bande et le vortex pendant 1 seconde
8. Placer la plaque dans une centrifugeuse. Réglez la vitesse de 145g, lorsque la vitesse d'essorage atteint 145g, arrêter le spin.
9. Placer la plaque dans un thermocycleur (s) mis au programme suivant: 25 cycles de (10 sec @ 96 ° C, 5 sec @ 50 ° C, 55 sec @ 60 ° C...) Le volume doit être au moins 6μL . Le cycle doit prendre environ 1,2 heures.

Procéder à des précipitations

6. Précipitations:

Pour «nettoyer» l'ADNc viral après la réaction de séquençage, effectuer précipitation à l'éthanol à l'aide d'éthanol à 95%.

1. Récupérer la plaque du thermocycleur et porter à un post-amplificateursalle de cation.
2. Retirer les bouchons de bande et les placer dans l'ordre sur une serviette en papier propre ou Kimwipe.
3. Pipeter 4μL de solution de travail Acétate EDTA de sodium sur le côté de chaque échantillon. Appuyez sur le plateau délicatement afin que la solution d'EDTA de sodium tombe au fond du puits. Les conseils peuvent être utilisées, tant qu'ils n'entrent pas en contact l'échantillon au fond du puits.
   * Remarque: La solution de travail Acétate EDTA de sodium peut être préparé comme suit:
   1. Préparer acétate de sodium 3M en dissolvant 246,1 g d'acétate de sodium dans 1 L d'eau de qualité réactif. Filtrer la solution à travers un filtre de 0,45 micro et préparer 50 ml aliquotes.
   2. Préparer la solution stock Acétate EDTA de sodium (1,5 M NaOAc, EDTA 250 mM) en mélangeant des volumes égaux d'acétate de sodium (3 M) et une solution d'EDTA (500 mM) pH 8,0.
   3. Préparer la solution d'acétate de sodium EDTA en mélangeant une solution d'acétate stock de pièces EDTA de sodium avec trois parties d'eau de qualité réactif (10 ml + 30 ml).
4. 40μL pipette d'éthanol à 95% refroidie sur le côté opposé du puits d'échantillon et de remplacer les bouchons de bande.
5. Scellez les bouchons et les tourbillons de la plaque pendant 10 secondes. Appuyez sur le plateau pour déloger les bulles.
6. Placer la plaque dans le congélateur à -20 ° C pendant un minimum de 30 minutes et un maximum de 2 heures.
7. 1. Une fois que les précipitations ont eu lieu, enlever la plaque du congélateur et le placer dans une centrifugeuse pendant 20 minutes à 3700 rpm.
   2. Retirer la quantité appropriée de Salut-Di formamide (Applied Biosystems) du congélateur pour lui permettre de dégeler avant dénaturation.
   * Note: La dénaturation d'une assiette pleine de 96 puits nécessite 960μL de formamide Hidi et il est donc avantageux de préparer ~ 1.1mL aliquotes au préalable.
8. Après filer la plaque enlever et jeter les bouchons de bande. Retourner la plaque sur le conteneur à déchets (poubelles, par exemple) et décanter le surnageant. Débarrasser de tout surnageant restant en tamponnant les plaques inversées sur du papier absorbant.
9. Plier 2 feuilles de papier absorbant et placer sur la surface de la plaque. Placez la plaque de face cachée dans la centrifugeuse et centrifuger à 145g, s'arrêtant le spin quand il atteint 145g.
10. Retirer la plaque de la centrifugeuse et vérifiez les puits sont vides. 155μL pipette d'éthanol à 95% refroidi dans les puits.
11. Jeter le surnageant dans le conteneur à déchets et éponger sur du papier absorbant et répéter la centrifugation en 4.10.
12. En enlevant la plaque de la centrifugeuse, jeter une serviette de papier utilisé et de laisser la plaque se faire face pendant 2-5 minutes pour permettre à tout l'éthanol restant à s'évaporer.

Procéder à la dénaturation

7. La dénaturation

1. Récupérer le formamide Hidi décongelés et transvaser dans un récipient assez grand pour une pipette multicanaux,
   * Note: Si vous utilisez de pré-aliquotés mesures comme indiqué dans 6.7b, un tube est nécessaire pour chaque plaque de 96 puits pour être exécuté.
2. En utilisant une pipette multicanaux, distribuer 10 ul de formamide Hidi dans tous les puits sur la plaque, y compris ceux qui sont vides.
3. Recouvrir la plaque avec un tapis de cloisons pour former un joint.
4. Placer la plaque dans un thermocycleur à 90 ° C pendant 2 minutes.
5. Après dénaturation, placer la plaque dans un support de plaque puis les charger dans le séquenceur. Ajouter une mise en page séquençage préparé. Les plaques peuvent être conservés à -20 ° C pendant jusqu'à une semaine avant d'effectuer la course de séquençage.

8. L'analyse des données résultantes à l'aide du logiciel de base Calling.

1. L'aide de RECALL exécuter la base d'appel automatique sans intervention humaine, la couverture seule amorce est acceptable. Le rappel est un logiciel de base personnalisé d'appel qui peut être trouvé à l'URL suivante: http://pssm.cfenet.ubc.ca/
   * Remarque: Un compte est nécessaire pour se connecter. Pour configurer un compte, cliquez sur le bouton "S'inscrire" à la page de connexion. Une fois un compte créé, vous pouvez accéder à la page de téléchargement.
2. Une fois connecté, vous pouvez sélectionner les fichiers d'exemple pour le téléchargement. Utilisation de l'option de navigation, vous pouvez localiser vos données brutes de séquençage de télécharger avec un maximum de téléchargement de 20Mo.
   * Note:.. Rappel Web n'accepte que les fichiers de données comme l'ABI et fichiers de l'EFC dans un zip, tar ou tar.gz.
3. Une fois les fichiers pour les télécharger ont été sélectionnés, choisissez votre séquence de référence. Dans ce cas, vérifiez que la séquence de référence est fixé à «V3». Vous êtes maintenant prêt à cliquer sur "Process Data".
4. Les données traitées apparaissent sur le côté droit de la page sous la rubrique "échantillons précédents." Chaque ensemble courir ou échantillon traité sera placé dans un dossier étiqueté avec la date. Ceux-ci peuvent être ré-étiquetés en cliquant sur le bouton "Renommer".
5. En cliquant sur le dossier fera apparaître une liste des échantillons. Ceux qui sont rouges ont échoué, ceux qui sont verts ont passé. En cliquant sur un échantillon spécifique et le bouton "View", vous êtes en mesure d'examiner la séquence. Suivez les instructions sur le côté droit de la page pour naviguer Through la séquence.
   * Remarque: Pour cette méthode, il est acceptable d'exporter des séquences qui passent de rappel (en vert) automatiquement, sans intervention manuelle.
6. Si vous êtes satisfait avec les résultats que vous pouvez choisir de télécharger les séquences de passage en cliquant sur "Télécharger". Les fichiers seront téléchargés dans un dossier compressé.
   * Remarque: sous "Paramètres", vous pouvez sélectionner les options de téléchargement et de messagerie, y compris le type de fichier.
7. Les échantillons ne pas produire des séquences triple propre devrait être réamplifiés en triple à partir d'extrait. Si RePCR ne parvient pas à fournir une séquence propre, un minimum de 2 séquences est acceptable pour utilisation dans l'inférence tropisme.

9. Inférer tropisme viral à partir de séquences générées par la population basée séquençage utilisant le co-récepteur Geno2pheno algorithme.

1. Les séquences peuvent être exécutés par le service geno2pheno corécepteur à l'adresse suivante: http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php.
2. Les échantillons à télécharger peuvent être étiquetés comme étant propres vues. Depuis le menu déroulant de la mise en signification, sélectionnez l'option "seuils optimisé basé sur l'analyse des données cliniques de motiver (2% et 5,75% FPR)"
3. Choisissez de télécharger ou de coller une séquence pour l'analyse, les fichiers fasta sont acceptables.
4. Le FPR geno2pheno peut être interprété comme suit: G2P FPR> 5,75 est représentatif d'une population en utilisant R5-virale; susceptibles de répondre à antagonistes du CCR5 G2P FPR <5,75 est représentatif d'une population non-R5 virale; peu susceptibles de répondre aux antagonistes de CCR5. G2P <2 est très peu probable d'avoir une réponse à des antagonistes du récepteur CCR5. Si l'un des trois séquences à partir d'un échantillon est déduite d'être non-R5, le patient n'est pas susceptible de répondre à une CCR5 antagoniste.

10. Les résultats représentatifs

Lorsque le protocole est réalisé correctement il faut s'attendre à succès séquence 2 ou 3 répétitions pour chaque échantillon. Négatifs longent échantillons devraient avoir aucune indication de l'ARN. La majorité des séquences doit «passer» basecalling par ce rappel.

Basé sur la distribution de R5 et non-R5 dans la population virale la communauté, la majorité des échantillons de patients choisis au hasard pourrait s'attendre à avoir R5 virus utilisant. Donc à moins que la conception du projet suggérer le contraire, on devrait s'attendre à avoir plus que les non-R5 R5 échantillons.

Tableau 1. A) Les volumes de réactifs nécessaires à une réaction de One Step RT-PCR et B) le programme du thermocycleur nécessaires pour réaliser la réaction de RT-PCR.

A)

Réactifs	Volume (uL) (1X réaction)
L'eau traitée au DEPC	10,56
Tampon de réaction 2x	20
50% de saccharose et 0,04% bleu de bromophénol mélangez	4
Amorce SQV3F1	0,32
Inverse apprêt CO602	0,32
Enzyme - SuperScript III One-Step RT-PCR System avec l'ADN polymérase Taq Platinum	0.8
Total des	36

* Note:
SQV3F1 séquence de l'amorce: 5 'GAG CCA ATT CCC ATA CAT TAT TGT 3'
CO602 séquence de l'amorce: 5 'de GCC CAT GCT AGT TCC TGC TGC TCC CAA GAA CC 3'

B)

Nombre de cycles	Temps	Température
1	30 minutes	52 ° C
1	2 minutes	94 ° C
40	15 secondes	94 ° C
	30 secondes	55 ° C
	1,5 minutes	68 ° C
1	5 minutes	68 ° C

Tableau 2. A) Les volumes de réactifs nécessaires à une réaction de second tour de PCR et B) le programme du thermocycleur nécessaires pour réaliser la deuxième réaction PCR rondes.

A)

Réactifs	Volume (uL) (1X réaction)
L'eau traitée au DEPC	13,45
60% de saccharose, 0,08% de crésol rouge mix	2
Roche HiFi système tampon 2	2
MgCl 2	0.8
dNTP	0,16
Amorce SQV3F2	0,15
CD4R amorce réverse	0,15
Développer HiFi enzymatiques	0,29
Total des	19

* Note:
SQV3F2 séquence de l'amorce: 5 'TGT GCC ACC GCT GGT TTT GCG à 3'
Séquence de l'amorce CD4R: 5 'TAT AAT TCA CTT CCT CAA TTG TCC 3'

B)

Nombre de cycles	Temps	Température
1	2 minutes	94 ° C
35	15 secondes	94 ° C
30 secondes	55 ° C
1 minute	72 ° C
1	7 minutes	72 ° C

Tableau 3. A) Les volumes de réactifs nécessaires à une réaction de séquençage et B) le thermocycleur programme nécessaire pour mener à bien la réaction de séquençage.

A)

Réactifs	Volume (uL) (1X réaction)
BigDye	0.3
BigDye Tampon	2.1
Apprêt Forward V3FO2F Inverse SQV3R1	2.6
Total des	5,0

* Note: Ne pas combiner amorces; un mélange distinct devrait être préparé pour chaque amorce
Séquence de l'amorce V3O2F: 5 'AAT GTC AGY ACA GTA CAA TGT ACA C 3'
SQV3R1 séquence de l'amorce: 5 'GAA AAA TTC TDC TCC ACA ATT AAA 3'

B)

Nombre de cycles	Temps	Température
25	10 secondes	96 ° C
5 secondes	50 ° C
55 secondes	60 ° C

Discussion

La méthode présentée ici est une méthode de séquençage norme appliquée à des tests de tropisme. L'application clinique de la boucle V3 du VIH enveloppe séquençage de prédire tropisme viral a été limitée jusqu'à la fin. Cette méthode a été montré, dans des analyses rétrospectives de l'maraviroc (ViiV Healthcare) les essais cliniques, pour être au minimum égale mesure de prédire le tropisme viral en comparaison à d'autres essais validés utilisés en clinique.

Il ya plusieurs avantages à effectuer une analyse génotypique de la boucle V3 pour la prédiction de tropisme. Tout d'abord, cette procédure peut être effectuée à toute installation d'équipements opérationnels séquençage, augmentant considérablement l'accessibilité et de réduire les délais d'exécution des tests de tropisme. En comparaison, le dosage phénotypique Enhanced Trofile Sensibilité (ESTA) (Monogram Biosciences), qui a servi comme l'étalon-or pour le test de tropisme, est effectué à un centre en Californie du Sud. Les autres avantages incluent l'exigence d'une matière première moins et une charge virale plasmatique minimale requise des 500copies/mL. En outre, les coûts opérationnels de fonctionnement de l'analyse génotypique sont relativement faibles en comparaison à celles d'un test phénotypique. L'utilisation du logiciel souviens en particulier d'éliminer l'exigence d'examen séquence manuelle, ce qui tend à être une partie du travail intensif des analyses génotype.

La méthode présentée ici est assez simple, sans aucune étape particulière emportant une autre importance. Nous ne vous suggérons de lancer PCR et séquençage en trois exemplaires à augmenter les chances de capturer des espèces minoritaires au sein de la population virale d'un échantillon. Réplique de plus de trois peut être effectuée, cependant nous avons trouvé trois exemplaires à la fois efficace et fiable. Nous suggérons également d'utiliser le One-Step Reverse Transcriptase PCR Kit (Qiagen) qui effectue à la fois par RT-PCR et PCR au premier tour dans la même réaction tout en conservant une sensibilité et une spécificité élevées.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNA extraction using NucliSens easyMAG version 1.0
NucliSens easyMAG Magnetic Silica	bioMerieux	cat. # 280133	(48 x 0.6 ml)
NucliSens easyMAG Lysis Buffer	bioMerieux	cat. # 280134	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 1	bioMerieux	cat. # 280130	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 2	bioMerieux	cat. # 280131	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 3	bioMerieux	cat. # 280132	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG version 1.0	bioMerieux
Class II A2 biological safety cabinet
One-Step Reverse Transcriptase PCR and Second Round PCR
DEPC-treated water	Ambion	cat. # 9922
SuperScrip III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq High Fidelty	Invitrogen	cat#12574-035	Kit components used: - SuperScript III RT/ Platinum Taq High Fidelty Enzyme Mix - 2X Reaction Mix (a buffer containing 0.4mM of each dNTP, 2.4mM MgSO4)
Expand High Fidelity PCR System	Roche Group	cat. # 1 759 078	Kit components used:- Expand High Fidelity Buffer 10X conc. with 15 mM MgCl2 (lids labelled 2)- Expand HF PCR Enzyme Mix (3.5U/μl)- MgCl2 Stock Solution (25mM) (lids labelled 4)
dNTPs: dATP, dGTP, dCTP, dTTP	Roche Group	cat. # 11969064001	(100 mM)
Sucrose	Sigma-Aldrich	cat. # S0389-500G
Bromophenol blue sodium salt	Sigma-Aldrich	cat.# B5525
Cresol Red	Sigma-Aldrich	cat.# 114472-5G	indicator grade
Thermocycler
Gel Electrophoresis
50X TAE buffer	Invitrogen	cat. # 24710030	(1000 ml)
SYBR Safe DNA gel stain	Invitrogen	cat. # S33102
Agarose (ultra pure)	Invitrogen	cat. # 15510-027
E-Gel Low Range Quantitative DNA Ladder	Invitrogen	cat. # 12373-031
Reagent Grade Type II water
Gel apparatus
Sequencing
ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit	Applied Biosciences	cat. # 4337458	(25000 reactions)
Hi-Di Formamide	Applied Biosciences	cat. # 4311320
Sodium Acetate (NaOAc)	Sigma-Aldrich	cat. # S-2889
EDTA	Sigma-Aldrich	Cat.# 03690-100ML	0.5M, pH=8.0
TRIZMA Hydrochloride Buffer Solution	Sigma-Aldrich	cat. # T-2819	1 M, pH 9.0
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	cat. # M-1028	1 M
95% Ethanol
Running Buffer (10X) with EDTA	Applied Biosystems	cat. # 4335613	500 mL
Polymer Pop-7 (25mL) Or Polymer Pop-7 (10mL)	Applied Biosystems	cat. # 44363929 or cat. # 4352759
3700/3730 BigDye Terminator v3.1 Sequencing Standard Kit	Applied Biosciences	Cat# 4336943
Thermocycler
Centrifuge with plate holders
3730xl DNA Analyzer	Applied Biosciences