Inferencia genotípica del VIH-1 tropismo utilizando la población basada en la secuencia de V3

Resumen

Tropismo del VIH se puede deducir de la región V3 de la envoltura viral. V3 es amplificada por PCR en triplicado, utilizando RT-PCR, secuencia, e interpretados mediante el software bioinformático. Las muestras con con la secuencia de 1 o más (s) con calificaciones bajas G2P son clasificados como no-R5 virus.

Resumen

Antecedentes: Antes de recibir un medicamento de la clase antagonista CCR5 en la terapia del VIH, el paciente debe someterse a una prueba de tropismo del VIH para confirmar que la población de su virus utiliza el correceptor CCR5 para entrar celulares, y no un correceptor alternativo. Una aproximación a las pruebas de tropismo es examinar la secuencia de la región V3 de la envoltura del VIH, que interactúa con el co-receptor.

Métodos: El ARN viral se extrae del plasma sanguíneo. La región V3 es amplificado por triplicado con anidado de la transcriptasa inversa-PCR. Las amplificaciones son luego secuenciados y analizados utilizando el software, RE_Call. Las secuencias son sometidas a un algoritmo de bioinformática, como geno2pheno inferir tropismo viral de la región V3. Las secuencias se infiere que no R5 si su geno2pheno tasa de falsos positivos es inferior 5,75%. Si cualquiera de las tres secuencias de una muestra se infiere que no-R5, el paciente no responde a un antagonista CCR5.

Protocolo

Procedimiento:

1. Extracción:

Al menos 500 l de plasma de la sangre que se necesita como entrada de la muestra para esta prueba de tropismo genotípica del VIH.

1. Extracto de ARN del VIH de 500μL de plasma con un easyMAG (bioMérieux) extractor automático, o el método de extracción preferido de su laboratorio.
   Eluir el RNA extraído viral en una alícuota de 60 mL. Almacenar a -20 grados Celsius o comenzar la transcriptasa inversa-PCR inmediatamente después de la extracción.

2. RT-PCR:

4μL del extracto de la muestra será amplificado por triplicado utilizando RT-PCR métodos. La reacción de RT-PCR se debe configurar en una sala de PCR limpio.

1. Calcular la cantidad de reactivo necesario para el número de muestras a amplificar. Siga la siguiente tabla indica los volúmenes de reactivos para una reacción.
   

   Reactivo	Volumen (l) (1X reacción)
   DEPC agua tratada	10.56
   Tampón de reacción 2x	20
   50% de sacarosa y 0,04% de mezcla de azul de bromofenol	4
   Cebador directo dirigidas a la región V3 del VIH	0.32
   Cebador inverso	0.32
   Enzima - superíndice III One-Step RT-PCR System de la polimerasa de ADN Taq Platino	0.8
   Total	36

   Tabla 1. Volúmenes de reactivos necesarios para una reacción de RT PCR de un solo paso.
   Cada una etapa de RT-PCR reacción requiere la siguiente receta:
   • 10,56 l de agua tratada con DEPC
   • 20 l de tampón de reacción 2x
   • 4μL del 50% de sacarosa y 0,04% de mezcla de azul de bromofenol
   • 0,32 l de interés el primer objetivo de la región V3 del VIH
   • 0,32 l de la primer inversa
   • 0,8 l de enzima
   Para un total de reacción por 36μL.
2. Alinee los tubos de extracción de la muestra en una fila al lado de un vacío, etiquetados de 96 y placa de PCR.
3. Con una pipeta repetidora, añadir 36 l de la mezcla de muestra a cada pocillo de la placa de PCR, de tal manera que hay 3 pozos preparados para cada extracto de muestra.
   * Nota: Este procedimiento debe realizarse por triplicado, como mínimo, para asegurar un muestreo adecuado de la población viral.
4. Utilizando una pipeta multicanal de 8 canales, agregar 4μL de extracto de muestra a cada uno de los tres pozos. Cambiar las puntas de cada adición.
5. Cubrir los pocillos con tapas de PCR tira.
6. Cuando la transferencia se comlete, coloque la placa de PCR en un termociclador. Establecer el termociclador para funcionar con el siguiente programa: 30 minutos a 52 ° C 2 minutos a 94 ° C 40 ciclos de (15 segundos a 94 ° C, 30 segundos a 55 ° C y 1,5 minutos a 68 ° C) 5 minutos a 68 ° C
7. Retire la placa de PCR de termociclador. Placa puede ser almacenado a temperatura ambiente.

Continúe con el paso de segunda ronda de PCR

3. Segunda ronda de PCR:

1. Calcular la cantidad de reactivo necesario para el número de muestras a amplificar. Siga la siguiente tabla indica los volúmenes de reactivos para una reacción.
   

   Reactivo	Volumen (l) (1X reacción)
   DEPC agua tratada	13.45
   60% de sacarosa, 0,08% de mezcla de color rojo cresol	2
   Roche HiFi Tampón 2	2
   MgCl2	0.8
   dNTP	0.16
   Adelante PCR primer	0.15
   Revertir cebador de PCR	0.15
   Ampliar HiFi enzima	0.29
   Total	19

   Tabla 2. Volúmenes de reactivos necesarios para una reacción de PCR 2 ^ª ronda.
   Cada reacción de la segunda ronda de PCR requiere la siguiente receta:
   • 13,45 l de agua tratada con DEPC
   • 2 l de sacarosa 60%, 0,08% de mezcla de color rojo cresol
   • 2 l de Roche alta fidelidad de búfer del sistema 2
   • 0,8 l de 25 mM MgCl ₂
   • 0,16 l de dNTP 25 mM
   • 0,15 l tanto del avance y retroceso de PCR
   • 0,29 l Ampliar HiFi enzima
   Para un total de 19 l por reacción.
2. En una sala limpia-PCR, utilizando una pipeta repetidora, añadir 19 l de tampón de reacción por pocillo a una placa de PCR limpio.
3. En una sala de amplificación posterior, utilizando una pipeta multicanal de 8 canales, la transferencia de 1 L de la plantilla de RT-PCR en el buffer de la segunda ronda de PCR. Cambiar las puntas de cada adición.
4. Cubrir los pocillos con tapas de PCR banda y la transferencia de la placa de la segunda ronda de PCR en un termociclador.
5. Establecer el termociclador para funcionar con el siguiente programa: 2 minutos a 94 ° C de 35 ciclos de (15 segundos a 94 ° C, 30 segundos a 55 ° C, 1 minuto a 72 ° C) 7 minutos a 72 ° C
6. Retire la placa de termociclador después de que la temperatura sea de 25 ° C.

4. Electroforesis en gel:

Con el fin de confirmar que la región V3 ha sido amplificado con éxito, a un paso de electroforesis en gel se lleva a cabo.

1. Preparar un gel de agarosa con 0,8 g de polvo de agarosa en 50 ml de 1X Buffer TAE. Revuelva y fundir en el microondas por aproximadamente 1 minuto o hasta que agarosa se disuelva por completo.
2. Añadir 6 L de gel SYBR seguro mancha y agitar para mezclar.
3. Vierta en una bandeja de gel, y añadir una cantidad suficiente de gel de peines para acomodar el número de pozos de PCR.
4. Una vez que el gel se seque, retire los peines y colocar el gel en el aparato de gel, asegurándose de que está completamente sumergido en buffer TAE 1X.
5. Con una pipeta multicanal 10 l, añadir 8μL de cada muestra de PCR para su propio pozo en el gel. Cubrir la placa PCR después de las ampliaciones se han añadido al gel.
6. Añadir 6 L de escalera del ADN de al menos un pozo por cada fila.
7. Ejecute el aparato de gel a 100V ~ de ~ 10 minutos, asegurándose de que las bandas no correr el gel.
8. Colocar el gel en una trans-iluminador UV y tomar una fotografía del gel.
   Wells con ADN amplificado por PCR aparece la luz, lo que indica una ampliación con éxito.
9. Tome nota de todas las muestras en tres amplificaciones fueron éxito. Si es necesario, repita el RT-PCR para las muestras con menos de tres ampliaciones.

Proceder a la secuenciación

5. La secuencia:

Después de haber amplificado ADNc viral, las muestras pueden ser preparados para la secuenciación. La reacción de secuenciación se llevará a cabo en una sala de post-amplificación.

1. Quitar BigDye del congelador y cebadores de secuenciación de la nevera. Deje que el deshielo BigDye a temperatura ambiente, por no más de 1 hora.
2. Calcular la cantidad de reactivo necesario para el número de muestras que se ejecute. Siga la siguiente tabla indica los volúmenes de reactivos para una reacción.
   

   Reactivo	Volumen (l) (1X reacción)
   BigDye	0.3
   BigDye buffer	2.1
   Cartilla	2.6
   Total	5.0

   Tabla 3. Volumen de reactivo necesario para una reacción de secuenciación.
   * Nota: preparar una mezcla diferente para cada cebador.
   ** Nota: el buffer BigDye utilizado en la reacción de secuenciación se puede preparar de la siguiente manera: Mezclar 17,5 ml de solución tampón Trizma clorhidrato (1 M) (pH9.0) y 0,125 ml de cloruro de magnesio (1 M). Llevar el volumen final de 100 ml con agua grado reactivo. Esto se debe almacenar a 2-8 º C.
3. Utilizando los cálculos de 3,3, preparar la reacción de secuenciación se mezcla para cada cebador y agitar durante no más de 5 segundos. Alícuota de 0,2 ml en los tubos de la tira.
4. Alícuota de 5 l de la secuenciación de mezcla de reacción en los pozos de la placa apropiada utilizando una pipeta multicanal. Cubrir la placa (s) que contiene la mezcla de reacción con una secuencia Kimwipe y dejar de lado.
5. Prepare una dilución 1:15 del producto amplificado por PCR añadiendo 180 l de agua estéril Baxter para el resto de producto de PCR.
6. Pipeta de 1 l de la muestra diluida en el fondo de los pozos de la placa de su caso, cambie la punta de la pipeta.
7. Cuando termine la transferencia de la muestra, sellar la placa con los casquillos tira y agitar durante 1 segundo
8. Colocar la placa en una centrifugadora. Establecer la velocidad a 145 g, cuando la velocidad de rotación llega a 145g, detener el giro.
9. Colocar la placa en un termociclador (s) establecido en el siguiente programa: 25 ciclos de (10 sec @ 96 ° C, 5 segundos a 50 ° C, 55 seg a 60 ° C...) El volumen debe ser de al menos 6μL . El ciclo debe tomar aproximadamente 1.2 horas.

Proceder a la precipitación

6. Precipitación:

Para "limpiar" el ADNc viral después de la reacción de secuenciación, lleve a cabo la precipitación en etanol utilizando etanol al 95%.

1. Recuperar la placa del termociclador y llevar a un post-amplificadorcación habitación.
2. Quite las tapas de la tira y colocarlos en el orden en una toalla de papel o Kimwipe.
3. Pipeta 4μL de solución de trabajo de acetato de sodio-EDTA al lado de cada muestra. Golpear suavemente la placa para que la solución de EDTA-sodio cae al fondo del pozo. Los consejos que se pueden usar siempre y cuando no entren en contacto con la muestra en el fondo del pozo.
   * Nota: El trabajo con EDTA solución de acetato de sodio se puede preparar de la siguiente manera:
   1. Prepare acetato de sodio 3M disolviendo 246,1 g de acetato de sodio en 1 litro de agua de grado reactivo. Filtrar la solución a través de un filtro de 0,45 micro y preparar alícuotas de 50 ml.
   2. Preparar archivo EDTA solución de acetato de sodio (1,5 M NaOAc, 250 mM EDTA) mediante la mezcla de volúmenes iguales de acetato de sodio (3 M) y la solución de EDTA (500 mM) pH 8,0.
   3. Preparar trabajo EDTA solución de acetato de sodio mediante la mezcla de un stock de piezas de sodio-EDTA solución de acetato con tres partes de agua de grado reactivo (10 ml + 30 ml).
4. 40μL pipeta de etanol frío al 95% en el lado opuesto de los pozos de la muestra y vuelva a colocar las tapas de la tira.
5. Selle los tapones y agitar la placa durante 10 segundos. Toque en la placa para eliminar burbujas.
6. Colocar la placa en el congelador a -20 º C durante un mínimo de 30 minutos y un máximo de 2 horas.
7. 1. Una vez que las precipitaciones se ha producido, retire la placa del congelador y coloque en una centrífuga durante 20 minutos a 3700 rpm.
   2. Eliminar la cantidad adecuada de Hi-Di formamida (Applied Biosystems) de la nevera para que se descongele antes de la desnaturalización.
   * Nota: La desnaturalización de un plato lleno de 96 pozos requiere 960μL de formamida Hidi y por lo tanto es conveniente preparar ~ 1.1mL alícuotas de antemano.
8. Después de girar la placa de retirar y desechar las tapas de la tira. Invierta la placa sobre el contenedor de residuos (por ejemplo, cubo de basura) y el sobrenadante se decanta el. Eliminar cualquier resto de sobrenadante por borrar las placas invertida sobre una toalla de papel.
9. Doble 2 hojas de papel absorbente y colocar en la superficie de la placa. Coloque la placa boca abajo en la centrífuga y giran a 145 g, deteniendo el giro cuando se llega a 145g.
10. Retirar la placa de la centrífuga y verifique que los pozos están vacíos. Pipeta 155μL de etanol frío al 95% en los pocillos.
11. Descartar el sobrenadante en el contenedor de residuos y mancha en una toalla de papel y repetir la centrifugación en 4,10.
12. Al remover la placa de la centrífuga, desechar una toalla de papel usado y que la placa de pie hacia arriba por 2-5 minutos para permitir que cualquier resto de etanol se evapore.

Proceder a la desnaturalización

7. Desnaturalización

1. Recuperar la formamida Hidi descongelado, y se decanta en un recipiente lo suficientemente grande para una pipeta multicanal,
   * Nota: Si se utiliza antes de la alícuota medidas como se indica en 6.7B, un tubo se requiere para cada placa de 96 pozos que se ejecutará.
2. Con una pipeta multicanal, distribuir 10μL de formamida Hidi en todos los pocillos de la placa, incluyendo aquellas que están vacías.
3. Cubrir la placa con una alfombra de tabiques para formar un sello.
4. Colocar la placa en un termociclador a 90 ° C durante 2 minutos.
5. Después de la desnaturalización, se coloca la placa en un soporte de la placa se carga en el secuenciador. Subir un diseño de la secuencia preparada. Las placas pueden conservarse a -20 ° C durante hasta una semana antes de realizar la ejecución de la secuencia.

8. El análisis de los datos resultantes con el software de base de llamadas.

1. Utilizando ReCall realizar la base de llamada automática sin intervención humana, la cobertura de un solo cebador es aceptable. Recall es un software de base de llamadas personalizados que se pueden encontrar en la siguiente URL: http://pssm.cfenet.ubc.ca/
   * Nota: Una cuenta tiene la obligación de inicio de sesión. Para configurar una cuenta, haga clic en el botón "Registrarse" en la página de inicio de sesión. Una vez que una cuenta ha sido creada, puede acceder a la página de carga.
2. Al iniciar sesión, puede seleccionar los archivos de ejemplo para la carga. Utilizando la opción de navegación que puede ubicar los datos en bruto de secuenciación para subir con un máximo de carga de 20Mb.
   * Nota:... Recordemos Web sólo acepta archivos de datos como ABI y los archivos de SCF en un zip, tar o tar.gz
3. Una vez que los archivos de carga han sido seleccionados, seleccione la secuencia de referencia. En este caso, asegúrese de que la secuencia de referencia se establece en "V3". Ahora está listo para hacer clic en "datos del proceso."
4. Los datos procesados ​​van a aparecer en la parte derecha de la página bajo el título "Las muestras del pasado." Cada conjunto de ejecución o muestra procesada se coloca en una carpeta con la fecha. Estos pueden ser re-etiquetados haciendo clic en el botón "Renombrar".
5. Al hacer clic en la carpeta aparecerá una lista de las muestras. Los que son de color rojo han fracasado, los que son de color verde han pasado. Al hacer clic en una muestra específica y el botón "View", que son capaces de revisar la secuencia. Siga las instrucciones en la parte derecha de la página para navegar through de la secuencia.
   * Nota: Para este método, es aceptable para exportar secuencias que pasan a retiro (en verde) de forma automática, sin intervención manual.
6. Si está satisfecho con los resultados que usted puede optar por descargar las secuencias de paso, haga clic en "Descargar". Los archivos se pueden descargar en un archivo comprimido.
   * Nota: en "Configuración" se puede seleccionar las opciones de descarga y el correo electrónico, incluyendo el tipo de archivo.
7. Las muestras de no producir secuencias de limpieza por triplicado deben reamplified por triplicado a partir de extracto. Si RePCR no proporciona una secuencia de limpieza, un mínimo de dos secuencias es aceptable para su uso en la inferencia de tropismo.

9. Inferir tropismo viral de secuencias generadas por la población basada en la secuencia utilizando el Geno2pheno co-receptor algoritmo.

1. Las secuencias se pueden ejecutar a través del servicio geno2pheno correceptor en la siguiente URL: http://coreceptor.bioinf.mpi-inf.mpg.de/index.php.
2. Las muestras para subir puede ser etiquetado como ajuste visto. Desde el menú desplegable de la configuración de importancia, seleccione la opción "puntos de corte optimizado basado en el análisis de los datos clínicos de MOTIVAR (2% y el 5,75% FPR)"
3. Optar por subir o pegar una secuencia para el análisis, los archivos FASTA son aceptables.
4. El FPR geno2pheno se puede interpretar de la siguiente manera: G2P FPR> 5,75 es representativa de una población con R5-viral; probabilidad de responder a los antagonistas del CCR5 G2P FPR <5,75 es representativa de una población no-R5 viral; poco probable que respondan a los antagonistas del CCR5. G2P <2 es muy poco probable que tenga la respuesta a los antagonistas del CCR5. Si cualquiera de las tres secuencias de una muestra se infiere que no-R5, el paciente no es probable que responda a un antagonista del CCR5.

10. Resultados representante

Cuando el protocolo se realiza correctamente se debe esperar con éxito la secuencia de 2 o 3 repeticiones para cada muestra. Negativos correr al lado de las muestras no debe tener ningún indicio de ARN. La mayoría de las secuencias debe "pasar" basecalling mediante el recuerdo.

Con base en la distribución de los R5 y R5-no dentro de la población de la comunidad viral, la mayoría de las muestras de los pacientes seleccionados al azar se espera que tenga R5-utilizando virus. Por lo tanto, a menos que el diseño del proyecto sugieren lo contrario, se debe esperar a tener más que los no-R5 R5 muestras.

Tabla 1. A) Los volúmenes del reactivo necesario para una reacción de un paso RT-PCR y B) el programa de termociclador necesario para llevar a cabo la reacción de RT-PCR.

A)

Reactivo	Volumen (l) (1X reacción)
DEPC agua tratada	10.56
Tampón de reacción 2x	20
50% de sacarosa y 0,04% de mezcla de azul de bromofenol	4
Cebador SQV3F1	0.32
Cebador inverso CO602	0.32
Enzima - superíndice III One-Step RT-PCR System de la polimerasa de ADN Taq Platino	0.8
Total	36

* Nota:
SQV3F1 imprimación secuencia: 5 'GAG CCA ATT CCC ATA CAT TAT TGT 3'
CO602 imprimación secuencia: 5 'CAT AGT GCC GCT TCC TGC TGC TCC CAA GAA CC 3'

B)

N º de Ciclos	Tiempo	Temperatura
1	30 minutos	52 ° C
1	2 minutos	94 ° C
40	15 segundos	94 ° C
	30 segundos	55 ° C
	1,5 minutos	68 ° C
1	5 minutos	68 ° C

Tabla 2. A) Los volúmenes del reactivo necesario para una reacción de la segunda ronda de PCR y B) el programa de termociclador necesario para llevar a cabo la reacción de la segunda ronda de PCR.

A)

Reactivo	Volumen (l) (1X reacción)
DEPC agua tratada	13.45
60% de sacarosa, 0,08% de mezcla de color rojo cresol	2
Roche HiFi Tampón 2	2
De MgCl 2	0.8
dNTP	0.16
Cebador SQV3F2	0.15
CD4R cebador inverso	0.15
Ampliar HiFi enzima	0.29
Total	19

* Nota:
SQV3F2 imprimación secuencia: 5 'TGT GCC CCA GCT GGT TTT GCG en 3'
CD4R primer secuencia: 5 'TAT CTT AAT TCA CTC AAC TTG TCC 3'

B)

N º de Ciclos	Tiempo	Temperatura
1	2 minutos	94 ° C
35	15 segundos	94 ° C
30 segundos	55 ° C
1 minuto	72 ° C
1	7 minutos	72 ° C

Tabla 3. A) Los volúmenes del reactivo necesario para una reacción de secuenciación y B) el programa de termociclador necesario para llevar a cabo la reacción de secuenciación.

A)

Reactivo	Volumen (l) (1X reacción)
BigDye	0.3
BigDye buffer	2.1
Cartilla Adelante V3FO2F Invertir SQV3R1	2.6
Total	5.0

* Nota: No combine primers, una mezcla separada debe estar preparado para cada cebador
V3O2F primer secuencia: 5 'AAT GTC AGY ACA GTA CAA TGT ACA C 3'
SQV3R1 imprimación secuencia: 5 'GAA TTC AAA CCT TCC ACA ATT AAA 3'

B)

N º de Ciclos	Tiempo	Temperatura
25	10 segundos	96 ° C
5 segundos	50 ° C
55 segundos	60 ° C

Discusión

El método presentado aquí es un método de secuenciación estándar se aplica a las pruebas de tropismo. La aplicación clínica de lazo V3 del VIH sobre la secuencia de predecir el tropismo viral ha sido hasta finales limitada. Este método se ha demostrado, en análisis retrospectivos de la maraviroc (ViiV Healthcare) los ensayos clínicos, para ser como mínimo igual de capaces de predecir el tropismo viral en comparación con otros ensayos validados utilizado clínicamente.

Hay muchos beneficios de llevar a cabo el análisis genotípico de la V3 para la predicción de tropismo. En primer lugar, este procedimiento se puede realizar en cualquier instalación con un equipo de secuenciación de funcionamiento, aumentando la accesibilidad y la reducción del tiempo de respuesta de las pruebas de tropismo. En comparación, las características fenotípicas de ensayo mejorado Trofile Sensibilidad (ESTA) (Monogram Biosciences), que ha servido como el estándar de oro para las pruebas de tropismo, se lleva a cabo en un centro en el sur de California. Los beneficios adicionales incluyen la exigencia de menos material de partida y un mínimo de carga viral en plasma requiere de 500copies/mL. Además, los costes operativos de la ejecución del ensayo genotípico son relativamente bajos en comparación con los de un ensayo fenotípico. El uso del software de recordar en particular elimina la necesidad de revisar la secuencia manual, que tiende a ser una parte de mano de obra de los análisis de genotipo.

El método presentado aquí es bastante sencillo, sin otro paso en particular prevalezca en importancia. Sugerimos funcionando PCR y secuenciación por triplicado para aumentar las probabilidades de las especies de la captura de las minorías dentro de la población viral de una muestra. Réplicas de más de tres se pueden realizar, sin embargo hemos encontrado triplica a ser eficiente y confiable. También se sugiere el uso de un paso de la transcriptasa inversa PCR Kit (Qiagen), que realiza tanto la RT-PCR y PCR en primera ronda en la misma reacción, manteniendo una alta sensibilidad y especificidad.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
RNA extraction using NucliSens easyMAG version 1.0
NucliSens easyMAG Magnetic Silica	bioMerieux	cat. # 280133	(48 x 0.6 ml)
NucliSens easyMAG Lysis Buffer	bioMerieux	cat. # 280134	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 1	bioMerieux	cat. # 280130	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 2	bioMerieux	cat. # 280131	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG Extraction Buffer 3	bioMerieux	cat. # 280132	(4 x 1000 ml)
NucliSens easyMAG version 1.0	bioMerieux
Class II A2 biological safety cabinet
One-Step Reverse Transcriptase PCR and Second Round PCR
DEPC-treated water	Ambion	cat. # 9922
SuperScrip III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq High Fidelty	Invitrogen	cat#12574-035	Kit components used: - SuperScript III RT/ Platinum Taq High Fidelty Enzyme Mix - 2X Reaction Mix (a buffer containing 0.4mM of each dNTP, 2.4mM MgSO4)
Expand High Fidelity PCR System	Roche Group	cat. # 1 759 078	Kit components used:- Expand High Fidelity Buffer 10X conc. with 15 mM MgCl2 (lids labelled 2)- Expand HF PCR Enzyme Mix (3.5U/μl)- MgCl2 Stock Solution (25mM) (lids labelled 4)
dNTPs: dATP, dGTP, dCTP, dTTP	Roche Group	cat. # 11969064001	(100 mM)
Sucrose	Sigma-Aldrich	cat. # S0389-500G
Bromophenol blue sodium salt	Sigma-Aldrich	cat.# B5525
Cresol Red	Sigma-Aldrich	cat.# 114472-5G	indicator grade
Thermocycler
Gel Electrophoresis
50X TAE buffer	Invitrogen	cat. # 24710030	(1000 ml)
SYBR Safe DNA gel stain	Invitrogen	cat. # S33102
Agarose (ultra pure)	Invitrogen	cat. # 15510-027
E-Gel Low Range Quantitative DNA Ladder	Invitrogen	cat. # 12373-031
Reagent Grade Type II water
Gel apparatus
Sequencing
ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit	Applied Biosciences	cat. # 4337458	(25000 reactions)
Hi-Di Formamide	Applied Biosciences	cat. # 4311320
Sodium Acetate (NaOAc)	Sigma-Aldrich	cat. # S-2889
EDTA	Sigma-Aldrich	Cat.# 03690-100ML	0.5M, pH=8.0
TRIZMA Hydrochloride Buffer Solution	Sigma-Aldrich	cat. # T-2819	1 M, pH 9.0
Magnesium Chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	cat. # M-1028	1 M
95% Ethanol
Running Buffer (10X) with EDTA	Applied Biosystems	cat. # 4335613	500 mL
Polymer Pop-7 (25mL) Or Polymer Pop-7 (10mL)	Applied Biosystems	cat. # 44363929 or cat. # 4352759
3700/3730 BigDye Terminator v3.1 Sequencing Standard Kit	Applied Biosciences	Cat# 4336943
Thermocycler
Centrifuge with plate holders
3730xl DNA Analyzer	Applied Biosciences