RNA的分离绿脓杆菌殖民小鼠胃肠道

摘要

RNA提取的一种可靠的方法绿脓杆菌

摘要

铜绿假单胞菌 （PA）感染导致显著的发病率和死亡率与免疫系统受损，如白血病患者，严重的烧伤创面，或^器官移植1，的主机。开发PA血液感染的高危患者，胃肠道（GI）的主要水库^定植 2，但机制PA的转换，从无症状的殖民微生物侵入性，而且往往是致命的的，病原体也不清楚。在此之前，我们进行了恢复从细菌细胞中的cecums居住的PA mRNA的^殖民小鼠3，以确定在宿主的免疫状态的改变细菌基因表达的变化在体内的转录分析实验。

任何转录分析实验，限速步骤是在足够数量的高质量的mRNA隔离。鉴于大量的酶，碎片，食物残渣，消化道颗粒物，RNA提取的挑战是艰巨的。在这里，我们提出了一个可靠和可重复性的方法从小鼠胃肠道细菌RNA的隔离。这种方法利用了PA胃肠道的定植和中性粒细胞减少症引起的^传播 4的行之有效的小鼠模型。一旦胃肠与PA定植证实，老鼠是安乐死和盲肠内容是恢复和速冻。 RNA，然后采用机械破碎，沸点，酚/氯仿抽提，DNA酶处理，和亲和层析结合提取。数量和纯度均证实光度法（Nanodrop技术）和生物分析仪（安捷伦科技）（图1）。这对胃肠道微生物的RNA分离方法可以很容易地适应以及其他细菌和真菌。

研究方案

1。 P 的小鼠模型铜绿胃肠道的定植和传播

1. 口服抗生素治疗C3H/HeN小鼠（6-8周岁，女，哈伦）消耗共生菌群，然后与PA单殖民如前所述^4。

2。收获小鼠盲肠管腔内容

1. 浸入液氮浴清洁的不锈钢砂浆。
2. 安乐死的二氧化碳窒息的小鼠。
3. 鼠标胴体上的发泡胶板和淋浴用95％乙醇的安全。通过从胸骨到会阴部的皮肤中线的纵形切口。反映皮肤和腹膜，暴露腹腔。
4. 切除整个盲肠。保持在不锈钢砂浆钳盲肠。盲肠清扫剪刀剪断两端。
5. 插入P1000的枪头充满盲肠flushate缓冲液（10毫米TrisHCl，1毫米EDTA和200毫米氯化钠）进入盲肠的近端1毫升。冲入不锈钢砂浆的盲肠flushate缓冲区和盲肠管腔内容。盲肠flushate液1毫升，将足以冲洗所有的盲肠内容。盲肠flushate内容将与砂浆接触后，立即冻结。
6. 用无菌杵研磨盲肠flushate内容。
7. 广场地面冻结到50毫升的聚丙烯锥形管淹没在干冰/乙醇浴盲肠管腔内容。
8. 重复步骤2.7 2.2每一个额外的鼠标。
9. 储存在-80 ° C。

3。细菌RNA分离

1. 暖1卷（基于两个管腔盲肠内容的最终体积，约3毫升）酸酚/氯仿（5:1，V / V）所载封口膜固定在一个65的第50毫升橡树岭离心管° C水浴。
2. 煮0.5体积的裂解缓冲液（2％SDS，16 mM的EDTA和200毫米氯化钠^）6 5分钟在50毫升聚丙烯锥形管中。
3. 煮沸裂解缓冲液中添加盲肠管腔内容。均质。煮沸5分钟周期性振荡。
4. 添加在100℃盲肠内容/ 65 ° C酸酚/氯仿在橡树岭离心管中裂解样品。用封口膜密封帽。
5. 在65℃孵育周期振荡（每2分钟）10分钟。
6. 在2500克离心15分钟，在4 °的样本。
7. 小心将水相（避免任何的白色接口）50毫升到一个新的橡树岭离心机。水相的体积将盲肠内容，裂解液，酚/氯仿总量的约50％。添加酸等体积酚/氯仿。
8. 用封口膜密封帽，拌匀高速震荡。
9. 在2500克离心15分钟，在4 °的样本。
10. 重复步骤3.7至3.9，直到有水相和有机相之间无可见的白色接口。
11. 小心水相转移到一个新的50毫升橡树岭离心。加入等体积的氯仿/异戊醇（24:1，V / V）。
12. 密封帽和混合以及震荡。
13. 在2500克离心15分钟，在4 °的样本。取出水相（体积将反应总体积约50％）15毫升聚丙烯锥形管和添加等体积的异丙醇。
14. 在-20℃放置至少2小时或过夜。
15. 在2500克离心45分钟，在4 °的样本。一个颗粒般的凝胶，在试管底部形成。去除上清液。
16. 冰冷的70％的乙醇与1毫升的洗涤沉淀。涡街流量计。离心5分钟，在4 °在万克样品。
17. 去除上清液，倒置在室温下10分钟让颗粒干管。
18. 无RNase水在200μL重悬的RNA沉淀。

4。 DNA酶处理（涡轮增压无DNA，应用生物系统公司）

1. 10X涡轮DNA酶缓冲和涡轮DNA酶2μL加入20μL，轻轻混匀。
2. 孵育20分钟，37 °。
3. 加入20μL悬浮DNA酶失活的试剂，并拌匀。
4. 在室温下孵育5分钟，偶尔搅拌。
5. 在室温下以10,000克1.5分钟离心，将上清转移到一个新的离心管。
6. 添加一个体积冷（4℃）酸酚/氯仿，调匀，1分钟震荡。
7. 在室温下在12500克离心2分钟。
8. 水相转移到一个新的管加1体积氯仿/异戊醇（49:1 / V），涡。
9. 在室温下在12500克离心2分钟。
10. 转移到一个新的管水相（反应总体积约50％）。
11. 添加0.1体积的3M醋酸钠，pH值5.52.5卷冰冷的100％的乙醇。涡街流量计。
12. 孵育至少2个小时或30分钟，在-80 ° -20 °。
13. 离心30分钟，在12000克在4 °
14. 去除上清液。
15. 万克在4℃离心5分钟1毫升的冰冷的70％乙醇洗涤沉淀。
16. 10分钟，取出上清，空气干燥。
17. 100μL无RNase水重悬沉淀。可能需要在65℃水浴中放置重悬浮和溶解沉淀。
18. 要测试的DNA酶治疗的疗效，一个标准的RT - PCR检测一个核糖体蛋白（或其他参考基因）的扩增反应可以进行处理和未经处理的样品，不使用RT控制。

5。 RNA清理步骤（Qiagen公司的RNeasy试剂​​盒）

1. 参照Qiagen公司的RNeasy迷你手册（ ^第 4版，2006年4月）页56-57。按照如上。

6。代表性的成果

恢复使用此协议的细菌总RNA的量是从两个cecums大约2-3微克。回收的RNA是足够的数量和质量，为后续的qPCR，转录分析和RNA序列的实验。 RNA的纯度是通过测量260nm/280nm比例的样品⁷例行评估，但这种方法没有提供有关RNA的完整性的信息。安捷伦生物分析仪是一种大小，量化和质量控制的DNA，RNA，蛋白质和细胞微流体为基础的平台，并利用RNA的完整性度量称为RNA的完整性号码^（RIN）8 。 RNA提取与本议定书​​所产生的260/280比率，范围从1.7到2.0的RIN值≥7.0。安捷伦生物分析仪分析此协议收回的细菌RNA的一个例子是如图1所示。

图1。安捷伦生物分析仪电泳和凝胶体状的形象绿脓杆菌总RNA样品中分离，并从小鼠盲肠内容恢复。 RIN的8.0。

讨论

这里描述的RNA提取方法，可以回收足够数量的高品质的绿脓杆菌总RNA从小鼠胃肠道的收获。这种方法不仅限于体育假单胞菌和有可能被应用到其他细菌。足够从肠道微生物的恢复会有所不同显著有机体。在我们的小鼠模型， 体育绿脓杆菌通常寄生水平的小鼠胃肠道5 × ¹⁰ 7 5 × 10 ⁸ CFU /克^粪便 4 。由于回收的盲肠内容是大约0.5克，P的估计数目从两个cecums收回假单胞菌是5 × 10 ⁷ 5 × 10 ⁸ CFU之间。如果使用其他微生物，这将是审慎的做法来验证消化道定植的水平，然后计算出需要恢复CFU针对性cecums的数量。同样重要的是要注意，当使用这个特殊的小鼠模型，与PA感染的抗生素治疗的老鼠有没有量化的数额从盲肠内容分离的RNA。

我们的小鼠模型绿脓杆菌胃肠道的定植和传播试图效仿 P的发病绿脓杆菌菌血症在癌症和干细胞移植的患者。在这个病患族群，共生菌群失调往往是耗尽继发抗生素或化疗治疗（如GI共生菌群的抗生素消耗），导致病原微生物的过度生长（ 如单与绿脓杆菌），那么随后的传播后的免疫抑制。这个小鼠模型的优点和局限性已经得到解决以前^4。目前的研究的目的是提供一种方法，从消化道隔离微生物总RNA。该协议可以很容易地适应其他小鼠模型，研究在胃肠道微生物的发病机制等方面（即共生菌群的相互作用，炎症性肠病等细菌的影响）。

这种方法的优点之一是多个裂解步骤，包括冻结/解冻，机械破碎（粉碎砂浆/杵，同质化），沸点，化学裂解（如SDS），注册成立。尽管众多的裂解步骤，一些微生物（特别是革兰氏阳性细菌和真菌/酵母菌）可能需要额外的机械破坏。热裂解/酸酚-氯仿孵化（步骤3.5），珠除了细菌，酵母和/或0.5-0.7毫米（0.1毫米）和随后珠 ​​打一步后，应足以裂解^{这些生物体} 9， ^10。

由于小鼠盲肠，反复感冒acid-phenol/chloroform提取（3.7至3.9步）的回收材料的复杂性是绝对必要的，以达到可以接受的RNA的质量和完整性作进一步的下游反应。 3-5冷acid-phenol/chloroform拔牙前必须消除白色水相和有机相之间的界面。最后，双方的DNA酶处理（步骤4）的RNeasy清理协议（步骤5）相结合的方式，去除污染的DNA和小非的mRNA（5S和tRNA）是必不可少的。如前所述，利用该协议回收的RNA随后的转录分析，定量PCR（未出版），和RNA序列（未发表）实验的足够数量和质量。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号
研钵	费舍尔	12-947-1
均质机	全方位	TM - 125
橡树岭离心管（50毫升）	NALGENE	3119-0050
酚/氯仿	Ambion公司	AM9720
氯仿	Sigma - Aldrich公司	C2432
异戊醇	Sigma - Aldrich公司	W205702
异丙醇	Sigma - Aldrich公司	190764
焦碳酸二乙酯（DEPC）	Sigma - Aldrich公司	40718
DNA酶	Ambion公司	AM2238
的RNeasy试剂​​盒	Qiagen公司	74104
3M醋酸钠	Ambion公司	AM9740
100％的乙醇	Sigma - Aldrich公司	E7023