El aislamiento de ARN Pseudomonas aeruginosa Que colonizan el tracto gastrointestinal murino

Resumen

Un método fiable para el aislamiento de ARN de Pseudomonas aeruginosa Recuperado de cecums murino se describe. El ARN se recupera de la cantidad y calidad suficientes para qPCR posteriores, perfiles de transcripción, y los experimentos de ARN Seq. Esta técnica se puede adaptar para el aislamiento de ARN de otros microbios intestinales.

Resumen

Pseudomonas aeruginosa (PA), las infecciones como resultado una significativa morbilidad y mortalidad en los hosts con sistemas inmunes comprometidos, como los pacientes con leucemia, quemaduras graves, o ^un trasplante de órganos. En pacientes con alto riesgo de desarrollar infecciones PA torrente sanguíneo, el tracto gastrointestinal (GI) es el principal reservorio para la colonización de ^2, pero los mecanismos por los que las transiciones de la AP desde un microbio colonización asintomática a una invasión, y con frecuencia mortal, el agente patógeno no son claras. Previamente, se realizó en experimentos in vivo mediante la recuperación de la transcripción de perfiles de ARNm PA de las células bacterianas que residían en la cecums de ratones colonizados ³ con el fin de identificar los cambios en la expresión génica bacteriana durante alteraciones en el estado inmunitario del huésped.

Al igual que con cualquier experimento de perfiles de transcripción, el paso limitante de la velocidad es en el aislamiento de la suficiente cantidad de ARNm de alta calidad. Dada la abundancia de enzimas, escombros, residuos de alimentos, y las partículas en el tracto gastrointestinal, el desafío de aislamiento de ARN es de enormes proporciones. A continuación, presentamos un método para el aislamiento fiable y reproducible de ARN bacteriano recuperado de la murino tracto gastrointestinal. Este método utiliza un modelo murino bien establecida de la PA colonización gastrointestinal y la neutropenia inducida por la difusión ^4. Una vez que la colonización gastrointestinal con PA se confirma, los ratones son sacrificados y el contenido cecal se recuperan y congelados flash. ARN se extrae a continuación con una combinación de la alteración mecánica, de ebullición, con fenol / cloroformo extracciones, tratamiento de DNasa, y cromatografía de afinidad. La cantidad y la pureza son confirmados por espectrofotometría (Tecnologías de la Nanodrop) y Bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig. 1). Este método de aislamiento de microorganismos GI ARN se pueden adaptar fácilmente a otras bacterias y hongos.

Protocolo

1. Modelo murino de P. aeruginosa colonización gastrointestinal y Difusión

1. Ratones C3H/HeN (6-8 semanas de edad, mujeres, Harlan) se tratan con antibióticos por vía oral a agotar la flora comensal y mono-colonizados por PA como se describió anteriormente ^4.

2. La recolección murino contenido luminal cecal

1. Sumerja un mortero de limpieza de acero inoxidable en un baño de nitrógeno líquido.
2. La eutanasia a los ratones por asfixia de dióxido de carbono.
3. Carcasa del ratón seguro en un tablero de espuma de poliestireno y ducha, con un 95% de etanol. Haga una incisión longitudinal línea media a través de la piel desde el esternón hasta el perineo. Reflejan en la piel y el peritoneo para exponer la cavidad abdominal.
4. Resecar el ciego entero. Mantenga el ciego con unas pinzas sobre el mortero de acero inoxidable. Cortar los dos extremos del ciego con tijeras de disección.
5. Inserte una punta de pipeta P1000 lleno de 1 ml de solución tampón flushate cecal (10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA y 200 mM de NaCl) ⁵ en el extremo proximal del ciego. Vaciar el búfer de flushate cecal y cecal contenido luminal en el mortero de acero inoxidable. 1 ml de solución tampón flushate cecal será suficiente para el lavado de todo el contenido cecal. Cecal contenidos flushate se congela inmediatamente después de entrar en contacto con el mortero.
6. Triturar el contenido cecal flushate con un mortero estéril.
7. Suelo congelado lugar cecal contenido luminal en un tubo de polipropileno de 50 ml cónico sumergido en un hielo seco / etanol baño.
8. Repita los pasos 2.2 a 2.7 por cada ratón adicional.
9. Almacenar a -80 ° C.

3. Bacteriana de aislamiento de ARN

1. Caliente un volumen (en función del volumen final de dos contenidos luminal cecal, de aproximadamente 3 ml) de ácido fenol / cloroformo (5:1, v / v) contenida en un tubo de 50 ml centrífuga Oak Ridge con la tapa asegurada en parafina en un 65 ° C baño de agua.
2. Hervir 0,5 volumen de tampón de lisis (2% SDS, 16 mM EDTA y 200 mM de NaCl) ⁶ contenido en un tubo de polipropileno de 50 ml cónicos durante 5 minutos.
3. Añadir tampón de lisis de ebullición a cecal contenido luminal. Homogeneizar. Hervir durante 5 minutos con agitación periódica.
4. Añadir los 100 ° C el contenido cecal / muestra lisis de la 65 ° C el ácido fenol / cloroformo en el tubo de centrífuga de Oak Ridge. Sello de la tapa con parafilm.
5. Se incuba a 65 ° C durante 10 minutos con agitación periódica (cada 2 minutos).
6. Centrifugar la muestra a 2500 g a 4 ° durante 15 minutos.
7. Cuidado de transferencia de fase acuosa (evitando la interfaz de blanco) a un nuevo 50 ml de centrífuga Ridge, Oak. El volumen de la fase acuosa será de aproximadamente el 50% del volumen total del contenido cecal, tampón de lisis, y ácido fenol / cloroformo. Añadir un volumen igual de fenol / cloroformo.
8. Sello de la tapa con parafilm y mezclar bien por agitación a alta velocidad.
9. Centrifugar la muestra a 2500 g a 4 ° durante 15 minutos.
10. Repita los pasos 3,7 a 3,9 hasta que no haya interfaz blanca visible entre las fases acuosa y orgánica.
11. Cuidado de transferencia de fase acuosa a un nuevo 50 ml de centrífuga Ridge, Oak. Añadir un volumen igual de cloroformo / alcohol isoamílico (24:1, v / v).
12. Sello de la tapa y mezclar bien por agitación.
13. Centrifugar la muestra a 2500 g a 4 ° durante 15 minutos. Eliminar la fase acuosa (el volumen será de aproximadamente el 50% del volumen total de reacción) al tubo de polipropileno de 15 ml y añadir un volumen igual de isopropanol.
14. Incubar a -20 º durante al menos 2 horas o durante la noche.
15. Centrifugar la muestra a 2500 g a 4 ° durante 45 minutos. Un gel de pellets se forman en la parte inferior del tubo. Eliminar el sobrenadante.
16. Lavar el pellet con 1 ml de helado de etanol al 70%. Vortex. Centrifugar la muestra a 10.000 en g a 4 º durante 5 minutos.
17. Eliminar el sobrenadante e invierta el tubo para que el sedimento seco a temperatura ambiente durante 10 minutos.
18. Resuspender el precipitado de ARN en 200 l de agua libre de RNasa.

4. DNasa tratamiento (Turbo sin ADN, Applied Biosystems)

1. Añadir 20 l de tampón 10X Turbo DNasa y 2 l DNasa Turbo y mezclar suavemente.
2. Se incuba a 37 º durante 20 minutos.
3. Añadir 20 l de reactivo resuspendido inactivación DNasa y mezclar bien.
4. Incubar 5 minutos a temperatura ambiente, mezclando de vez en cuando.
5. Centrifugar a 10.000 g, a temperatura ambiente durante 1,5 minutos y transferir el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga nuevo.
6. Añadir un volumen de frío (4 º) El ácido fenol / cloroformo y mezclar bien por agitación durante 1 minuto.
7. Centrifugar a 12.500 g a temperatura ambiente durante 2 minutos.
8. Pasar la fase acuosa a un tubo nuevo y añadir un volumen de cloroformo / alcohol isoamílico (49:1 v / v) y agitar.
9. Centrifugar a 12.500 g a temperatura ambiente durante 2 minutos.
10. Pasar la fase acuosa (aproximadamente el 50% del volumen total de reacción) a un tubo nuevo.
11. Añadir 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3M, pH 5,5 y2.5 volúmenes de etanol helado al 100%. Vortex.
12. Incubar a -20 º durante al menos 2 horas o menos -80 º durante 30 minutos.
13. Centrifugar a 12.000 g durante 30 minutos a 4 °
14. Eliminar el sobrenadante.
15. Lavar el pellet con 1 ml de helado de etanol al 70% por centrifugación durante 5 minutos a 10.000 ga 4 °.
16. Retire el sobrenadante y secar el aire durante 10 minutos.
17. Resuspender el precipitado en 100 l de agua libre de RNasa. Puede necesitar para poner en baño de agua 65 ° a volver a suspender y disolver el precipitado.
18. Para probar la eficacia del tratamiento con DNasa, una norma de reacción de RT-PCR para la amplificación de una proteína ribosomal (o el gen de referencia) se puede realizar en las muestras tratadas y no tratadas, sin utilizar los controles de RT.

5. ARN Paso de limpieza (Qiagen, RNeasy Kit)

1. Consulte las páginas 56-57 de Qiagen RNeasy Mini Manual (4 ^ª edición, abril de 2006). Siga las indicaciones.

6. Resultados representante

La cantidad de bacterias ARN total recuperado mediante el uso de este protocolo es de aproximadamente 3.2 mg de dos cecums. El ARN se recupera de la cantidad y calidad suficientes para qPCR posteriores, perfiles de transcripción, y los experimentos de ARN Seq. La pureza del RNA se evalúan regularmente midiendo la relación 260nm/280nm ⁷ de la muestra, sin embargo, este método no proporciona ninguna información acerca de la integridad del ARN. El Bioanalyzer Agilent es una plataforma de microfluidos basada en el tamaño, la cuantificación y control de calidad de DNA, RNA, proteínas y células, y utiliza una métrica de la integridad del ARN conocidos como ARN Número de Integridad (RIN) ^8. ARN extraído con este protocolo produce 260/280 ratios que van desde 1,7 hasta 2,0 y los valores de RIN ≥ 7,0. Un ejemplo de un análisis de Agilent Bioanalyzer del ARN bacteriano recuperado por este protocolo se muestra en la Figura 1.

Figura 1. Agilent Bioanalyzer electroferograma y gel-como la imagen de la muestra Pseudomonas aeruginosa aisladas de ARN total y se recuperó de murino contenido cecal. RIN 8.0.

Discusión

El método de extracción de ARN se describe aquí permite la recuperación de cantidades suficientes de alta calidad del ARN total de Pseudomonas aeruginosa cosecha de la murino tracto gastrointestinal. Este método no se limita a P. aeruginosa y, potencialmente, se puede aplicar a otras bacterias. La recuperación de los organismos microbianos suficiente en el intestino pueden variar significativamente de un organismo a otro. En nuestro modelo murino, P. aeruginosa suelen coloniza el tracto GI murino a niveles entre 5 x 10 ⁷ 5 x 10 ⁸ UFC / g de heces ^4. Dado que el contenido cecal recuperado son más o menos 0.5 gramos, el número estimado de P. aeruginosa se ​​recuperó de dos cecums es de 5 x 10 ⁷ 5 x 10 ⁸ UFC. Si los microorganismos se utilizan otros, sería prudente para verificar los niveles de colonización gastrointestinal y luego calcular el número de cecums necesario para recuperar el número previsto de UFC. También es importante tener en cuenta que al utilizar este modelo murino particular, los ratones tratados con antibióticos no infectados por el PA no tienen cantidades cuantificables de ARN aislado de su contenido cecal.

Nuestro modelo murino de la colonización por Pseudomonas aeruginosa gastrointestinal y los intentos de difusión de emular a la patogénesis de la P. aeruginosa bacteriemia en pacientes con cáncer y trasplantes de células madre. En esta población de pacientes, la flora comensal es a menudo se agotan secundaria al tratamiento con antibióticos o quimioterápicos (por ejemplo, el agotamiento de los antibióticos de la flora comensal GI), resultando en un crecimiento excesivo de microbios patógenos (por ejemplo, mono-asociación con P. aeruginosa) y su posterior difusión después de la supresión inmune. Las ventajas y limitaciones de este modelo murino ya han sido tratados con anterioridad ^4. El propósito de este estudio es proporcionar una metodología para el aislamiento de ARN total microbiana del tracto gastrointestinal. Este protocolo se puede adaptar fácilmente a otros modelos murinos que el estudio de otros aspectos de la patogénesis microbiana en el tracto gastrointestinal (es decir, las interacciones comensales flora, los efectos de bacterias en la enfermedad inflamatoria intestinal, etc.)

Una de las ventajas de este método es la incorporación de medidas múltiples, incluyendo la lisis de congelación / descongelación, la rotura mecánica (pulverización con mortero / mortero homogeneización), hervir, y la lisis químicos (por ejemplo SDS). A pesar de la multitud de pasos de lisis, algunos microorganismos (principalmente bacterias Gram-positivas y hongos / levaduras) pueden requerir la interrupción mecánica adicional. Después de la lisis caliente / ácido fenol-cloroformo incubación (Paso 3.5), la adición de cuentas (0,1 mm para las bacterias y / o 0.5-0.7 mm de levadura) y una fase posterior de cuentas el maltrato debe ser suficiente para lisar las ^{nueve organismos, 10.}

Dada la compleja naturaleza de los materiales recuperados de la murino ciego, las extracciones repetidas frío acid-phenol/chloroform (Paso 3,7 a 3,9) son absolutamente necesarios para lograr una calidad aceptable del ARN y la integridad de las reacciones más abajo. Entre 3.5 frío extracciones acid-phenol/chloroform puede ser requerida antes de la interfaz en blanco entre las fases acuosa y orgánica se elimina. Por último, la combinación de ambos el tratamiento DNasa (paso 4) y el Protocolo de limpieza RNeasy (Paso 5) son esenciales para la eliminación de la contaminación de ADN y los pequeños no ARNm (5 años y tRNA). Como se mencionó anteriormente, el ARN se recuperó mediante la utilización de este protocolo es de cantidad y calidad suficientes para la creación de perfiles de transcripción posterior ^3, qPCR (inédito), y el ARN experimentos Seq (no publicados).

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
Mortero y la maja	Pescador	12-947-1
Homogeneizador	Omni	TM-125
Oak Ridge tubos de centrifugación (50 ml)	Nalgene	3119-0050
Ácido fenol / cloroformo	Ambion	AM9720
Cloroformo	Sigma-Aldrich	C2432
El alcohol isoamílico	Sigma-Aldrich	W205702
Isopropanol	Sigma-Aldrich	190764
Dietil pirocarbonato (DEPC)	Sigma-Aldrich	40718
DNasa	Ambion	AM2238
RNeasy Kit	Qiagen	74104
3M Acetato de Sodio	Ambion	AM9740
100% de etanol	Sigma-Aldrich	E7023