RNA İzolasyonu Pseudomonas aeruginosa Murin Gastrointestinal Yolu koloniler

Özet

RNA izolasyonu için güvenilir bir yöntem Pseudomonas aeruginosa Fare cecums kurtarıldı açıklanmıştır. Kurtarıldı RNA sonraki qPCR, transkripsiyon profilleme ve RNA Seq deneyler için yeterli nicelik ve nitelik taşımaktadır. Bu teknik diğer bağırsak mikropların RNA izolasyonu için adapte edilebilir.

Özet

Lösemili hastalarda, ağır yanık yaraları, veya organ nakli ¹ gibi bağışıklık sistemleri ile ev sahipliği yapan önemli bir morbidite ve mortalite Pseudomonas aeruginosa (PA) enfeksiyonları sonucu. PA kan dolaşımı enfeksiyonu geliştirme için yüksek riskli hastalarda, gastrointestinal (Gİ) sistem ² kolonizasyon için ana rezervuar, ancak mekanizmaları olan asemptomatik kolonize mikrop invaziv, ve genellikle ölümcül PA geçişler, patojen belirsizdir. Daha önce, konağın bağışıklık durumu değişiklikler sırasında bakteriyel gen ekspresyonu değişiklikleri belirlemek amacıyla fareler ³ kolonize cecums yaşayan bakteri hücrelerinin PA mRNA kurtarma in vivo transkripsiyon profili deneyleri yapıldı.

Herhangi bir transkripsiyon profil deneyde olduğu gibi, hız sınırlayıcı adım yeterli miktarda yüksek kaliteli mRNA izolasyonu. Enzimler, moloz, gıda artıkları ve GI kanalda partikül madde bolluğu göz önüne alındığında, RNA izolasyonu meydan yıldırıcı. Burada, biz, güvenilir ve tekrarlanabilir fare GI sistem kurtarıldı bakteriyel RNA izolasyonu için bir yöntem mevcut. Bu yöntem, PA gastrointestinal kolonizasyon ve nötropeni indüklenen yayılması ⁴ köklü bir fare modeli kullanmaktadır. PA ile bir kez gastrointestinal kolonizasyon doğruladı, fareler, ötenazi ve çekal içeriğini kurtarıldı ve flash dondurulur. RNA sonra kaynar bozulması, mekanik, fenol / kloroform ekstraksiyon, DNaz tedavi ve afinite kromatografisi bir kombinasyonu kullanılarak elde edilir. Miktar ve saflık spektrofotometri (Nanodrop Teknolojileri) ve bioanalyzer (Agilent Technologies) (Şekil 1) tarafından teyit edilir. GI mikrobiyal RNA izolasyonu Bu yöntem yanı sıra diğer bakteri ve mantarlar kolayca adapte edilebilir.

Protokol

1. P. murin Modeli aeruginosa GI Kolonizasyon ve Yaygınlaştırma

1. Komensal florası tüketmek ve daha sonra daha önce ⁴ açıklandığı gibi mono-PA ile kolonize C3H/HeN fareler (6-8 hafta eski kadın, Harlan) oral antibiyotik ile tedavi edilir.

2. Murin Çekal Luminal İçeriği Hasat

1. Sıvı azot banyo temizlenir paslanmaz çelik harcı bırakın.
2. Karbondioksit boğulma tarafından fareler Euthanize.
3. Strafor kurulu ve% 95 etanol ile duş Güvenli fare karkas. Sternum perine deri yoluyla orta hat longitudinal kesi olun. Deri ve periton karın boşluğunda maruz yansıtmaktadır.
4. Tüm çekum rezeke. Çekum paslanmaz çelik harç üzerinde forseps ile tutun. Çekum diseksiyon makas ile her iki ucunda Snip.
5. Çekum proksimal ucunu çekal flushate tamponu (10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA ve 200 mM NaCl) ⁵ 1 ml ile dolu bir P1000 pipet ucu takın. Paslanmaz çelik harç çekal flushate tampon ve çekal luminal içeriği yıkayın. 1 ml çekal flushate tampon çekal içeriğinin tüm ateş basması için yeterli olacaktır. Çekal flushate içeriğini harç ile temas halinde hemen donar.
6. Steril bir havaneli çekal flushate içeriğini Grind.
7. Yeri zemin kuru buz / etanol banyosu içinde batık bir 50 ml polipropilen konik tüp içine çekal luminal içeriğini donmuş.
8. Her ek fare için 2.7 üzerinden 2.2 adımları tekrarlayın.
9. -80 ° C saklayınız

3. Bakteriyel RNA İzolasyon

1. 65 parafilm güvenli bir şekilde kapak ile 50 ml Oak Ridge santrifüj tüpüne bulunan asit kloroform / fenol Sıcak 1 hacmi (yaklaşık 3 ml, iki çekal luminal içeriği son hacmi dayalı) (5:1, v / v) ° C su banyosu.
2. 5 dakika için 50 ml polipropilen konik tüp bulunan lizis tamponu 0.5 hacmi (2% SDS, 16 mM EDTA ve 200 mM NaCl) ⁶ kaynatın.
3. Çekal luminal içeriğine kaynar lizis tamponu ekleyin. Homojenize edilir. Periyodik vorteks ile 5 dakika boyunca kaynatın.
4. Ekle 100 ° C ila 65 ° C Oak Ridge santrifüj tüpüne asit kloroform / fenol çekal içeriğini / lizis örnek. Parafilm ile Seal kap.
5. 65 ° C'de 10 dakika boyunca periyodik olarak vorteks (her 2 dakika).
6. 4 ° de 15 dakika boyunca 2.500 g örnek santrifüjleyin.
7. 50 ml taze bir Oak Ridge santrifüj dikkatlice sulu faz (beyaz arabirimi herhangi bir kaçınarak) aktarın. Sulu fazın hacmi çekal içeriği, lizis tamponu, asit ve kloroform / fenol toplam hacminin yaklaşık% 50 olacaktır. Eşit miktarda asit kloroform / fenol ekleyin.
8. Seal parafilm kapağı ve yüksek hızda karıştırın iyice karıştırın.
9. 4 ° de 15 dakika boyunca 2.500 g örnek santrifüjleyin.
10. 3,9 için 3,7 Adımlar görünür beyaz, sulu ve organik fazlar arasında arayüz kalmayıncaya kadar tekrarlayın.
11. Sulu faz 50 ml taze bir Oak Ridge santrifüj dikkatlice aktarın. Kloroform / izoamil alkol (24:1, v / v) eşit miktarda ekleyin.
12. Mühür kapak ve vorteks ile iyice karıştırın.
13. 4 ° de 15 dakika boyunca 2.500 g örnek santrifüjleyin. 15 ml polipropilen konik tüp sulu faz (hacmi toplam reaksiyon hacmi yaklaşık% 50 olacak) çıkarın ve eşit hacimde izopropanol ekleyin.
14. -20 ° 'de en az 2 saat veya gece boyunca inkübe edin.
15. 2.500 g örnek için 45 dakika 4 ° santrifüjleyin. Jel gibi pelet bir tüpün dibinde oluşturacaktır. Süpernatantı.
16. Pelet 1 ml% 70 etanol buz ile yıkayın. Vorteks. 5 dakika boyunca 4 ° 10,000 g örnek Santrifüj.
17. Süpernatantı alın ve 10 dakika boyunca oda sıcaklığında pelet kuruması için tüp ters.
18. RNaz içermeyen su 200 ul RNA pelletini tekrar.

4. DNaz Tedavi (Turbo DNA-Free, Uygulamalı Biyosistem)

1. 10X Turbo DNaz tampon ve 2 ul Turbo DNaz 20 ul ekleyin ve hafifçe karıştırın.
2. 37 ° de 20 dakika inkübe edin.
3. 20 ul yeniden süspanse DNaz inaktivasyon reaktif ekleyin ve iyice karıştırın.
4. Ara sıra karıştırarak oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
5. 1.5 dakika boyunca oda sıcaklığında 10.000 g de santrifüj ve yeni bir mikrofuge'ye boru süpernatantı transfer.
6. Bir hacim fenol / kloroform soğuk (4 °) asit ekleyin ve 1 dakika için vorteks ile iyice karıştırın.
7. 12.500 g oda sıcaklığında 2 dakika boyunca santrifüjleyin.
8. Sulu faz yeni bir tüpe transfer ve 1 hacim kloroform / izoamil alkol (49:1 v / v), girdap ekleyin.
9. 12.500 g oda sıcaklığında 2 dakika boyunca santrifüjleyin.
10. (Toplam reaksiyon hacminin yaklaşık% 50) sulu faz yeni bir tüpe aktarın.
11. 3M sodyum asetat, pH 5.5 0.1 hacim ekleBuz gibi% 100 etanol 2.5 hacimleri. Vorteks.
12. En az 2 saat veya -20 ° -80 ° 'de 30 dakika inkübe edin.
13. 12.000 gr santrifüjleyin az 30 dakika süreyle 4 °
14. Süpernatantı.
15. 10.000 g 4 ° 'de 5 dakika santrifüj pelet 1 ml% 70 etanol buz ile yıkayın.
16. 10 dakika boyunca supernatant ve kuru hava çıkarın.
17. RNaz ücretsiz su 100 ul pelletini tekrar. Tekrar süspansiyon 65 ° su banyosu yeri ve pelet çözülür gerekebilir.
18. DNaz tedavinin etkinliğini test etmek için, ribozomal protein (veya başka bir referans gen) amplifikasyonu için bir standart RT-PCR reaksiyonu hiçbir RT kontrollerini kullanarak arıtılmış ve arıtılmamış örnekleri olabilir.

5. RNA Temizleme Adım (Qiagen, RNeasy Kiti)

1. Qiagen RNeasy Mini El Kitabı ^(4. Edition, Nisan 2006) sayfa 56-57 bakın. Gösterildiği gibi uygulayın.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Bu protokolü kullanarak ele bakteriyel toplam RNA miktarını iki cecums yaklaşık 2-3 mg. Kurtarıldı RNA sonraki qPCR, transkripsiyon profilleme ve RNA Seq deneyler için yeterli nicelik ve nitelik taşımaktadır. RNA saflık rutin 260nm/280nm oranı ⁷ numunenin ölçümü ile değerlendirilen, henüz bu yöntem hakkında hiçbir bilgi RNA bütünlüğünü sağlar. Agilent Bioanalyzer boyutlandırma, ölçme ve kalite kontrol, DNA, RNA, proteinler ve hücreler için bir Mikroakiskan tabanlı bir platform ve RNA Bütünlük sayısı ^(RIN) 8 olarak bilinen bir RNA bütünlüğünü metrik kullanır . Bu protokol 260/280 1.7 'den 2.0' ye ve RIN değerleri ≥ 7.0 arasında değişen oranlar üretir RNA ayıklanır. Bu protokol tarafından kurtarıldı bakteriyel RNA Agilent Bioanalyzer analizi bir örnek Şekil 1'de gösterilmiştir.

Şekil 1: Agilent Bioanalyzer Elektroferogram ve Pseudomonas aeruginosa toplam RNA örnek jel gibi görüntü izole ve fare çekal içeriği kurtarıldı. RIN 8.0.

Tartışmalar

RNA ekstraksiyon yöntemi, burada açıklanan kurtarma için fare GI yolu hasat yüksek kaliteli Pseudomonas aeruginosa toplam RNA yeterli miktarda sağlar . Bu yöntem, P. ile sınırlı değildir aeruginosa ve diğer bakterilerin potansiyel olarak uygulanabilir. Yeterli mikrobik organizmaların bağırsak kurtarma organizmadan organizmaya önemli ölçüde değişecektir. Bizim fare modeli, P. aeruginosa genellikle 5 x 10 ⁷ 5 x 10 ⁸ kob / g feçes ⁴ arasındaki seviyelerde fare gastrointestinal sistem kolonize. Kurtarılan çekal içeriği kabaca 0.5 gram, P. tahmini sayısı olduğundan iki cecums kurtarıldı aeruginosa 5 x 10 ⁷ 5 x 10 ⁸ kob arasında. Diğer mikroorganizmaların kullanılması halinde, gastrointestinal kolonizasyon seviyesini doğrulamak ve daha sonra hedeflenen sayıda kob kurtarmak için gerekli cecums sayısını hesaplamak için ihtiyatlı bir davranış olacaktır. Bu özel fare modeli kullanırken, PA ile enfekte olmayan antibiyotik ile tedavi edilen farelerde çekal içeriğini izole edilen RNA ölçülebilir miktarda olduğunu da not etmek önemlidir.

Pseudomonas aeruginosa gastrointestinal kolonizasyon ve yaygınlaştırma girişimleri P. patogenezinde taklit etmek için fare modeli kanser ve kök hücre nakli yapılan hastaları bakteriyemi aeruginosa . Bu hasta popülasyonunda, ortakçı florasının genellikle antibiyotik veya kemoterapötik tedavi (GI ortakçı floranın antibiyotik tükenmesi gibi) patojen mikropların (örneğin P. aeruginosa ile mono-dernek) aşırı üremesine neden tükenmiş ve bağışıklık baskılanması sonra sonraki yayılması. Bu fare modelinin avantajları ve sınırlamaları zaten daha önce ⁴ olarak ele alınmıştır . Bu çalışmanın amacı, GI yolu mikrobik total RNA izole etmek için bir metodoloji sunmaktır. Bu protokol, gastrointestinal sistem (yani ortakçı flora etkileşimleri, inflamatuvar barsak hastalığı gibi bakteriyel etkileri) mikrobiyal patogenez diğer yönlerini incelemek diğer fare modelleri kolayca adapte edilebilir.

Bu yöntemin bir avantajı, donma / çözülme, mekanik parçalama (harç / havaneli, homojenizasyon ile ezerek), kaynama, kimyasal ve lizis (örneğin SDS) de dahil olmak üzere birden fazla lizis adımları birleşme olduğunu. Lizis adımları çokluğuna rağmen, bazı mikroorganizmaların (özellikle Gram-pozitif bakteri ve mantar / maya) ilave mekanik bozulması gerekebilir. Sıcak lizis / asit, fenol-kloroform inkübasyon (Adım 3.5), boncuk ek (bakteri ve maya / veya 0.5-0.7 mm 0,1 mm) ve bir sonraki boncuk atan adım ^sonra, bu ^organizmalar 9 lyse için yeterli olmalıdır ¹⁰

Fare çekum, tekrarlayan soğuk acid-phenol/chloroform ekstraksiyon (Adım 3,7-3,9) kurtarıldı malzemelerin karmaşık doğası gereği kesinlikle daha aşağı reaksiyonlar için kabul edilebilir RNA kalitesini ve bütünlüğünü sağlamak için gerekli. 3-5 soğuk acid-phenol/chloroform ekstraksiyon arasında elimine edilir, sulu ve organik fazlar arasında beyaz bir arayüz önce gerekli olabilir. Son olarak, DNaz tedavi (Adım 4) ve RNeasy Temizleme Protokolü (Adım 5) kombinasyonu kirlenmesine neden olan DNA ve mRNA küçük olmayan (5s ve tRNA) kaldırmak için gereklidir. Daha önce de belirtildiği gibi, bu protokol kullanan tarafından kurtarıldı RNA sonraki ^{transkripsiyon profil} 3, qPCR (yayımlanmamış), ve RNA Seq (yayımlanmamış) deneyler için yeterli miktar ve kalitede.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifin Adı	Şirket	Katalog numarası
Havanda	Balıkçı	12-947-1
Homojenizatör	Omni	TM-125
Oak Ridge santrifüj tüplerine (50 ml)	Nalgene	3119-0050
Asit Fenol / Kloroform	Ambion	AM9720
Kloroform	Sigma-Aldrich	C2432
Izoamil Alkol	Sigma-Aldrich	W205702
Isopropanol	Sigma-Aldrich	190764
Dietil pyrocarbonate (DEPC)	Sigma-Aldrich	40718
DNaz	Ambion	AM2238
RNeasy Seti	Qiagen	74104
3M Sodyum Asetat	Ambion	AM9740
% 100 Etanol	Sigma-Aldrich	E7023