一种实用的新的方法来提取基因组DNA保存血浆蛋白从血液采集套件

摘要

我们所描述的从全血收集的血浆/血清中分离基因组DNA的新方法。血浆采集后，压实血通常是被丢弃。我们的新方法较现有方法相比，一个显着的改善，使得DNA，不要求额外的血液和血浆可以从一个单一的集合。

摘要

实验室测试，可以做到对细胞或血液的流体部分。不同的血液收集管的使用确定的部分可以被分析的血液（全血，血浆或血清）。实验室参与研究人类疾病的遗传基础，依靠抗凝全血收集在含EDTA真空采血管作为源DNA遗传/基因组分析。因为大多数临床实验室进行生化，血清学和病毒的​​检测表型的结果调查作为第一步，也收集在含肝素管（等离子管）抗凝血。因此，当DNA和等离子所需的同时并行分析的基因组和蛋白质组数据，这是习惯EDTA和肝素管中收集血液。如果血液可以在单管中收集作为血浆和脱氧核糖核酸的源，该方法将被认为是提高现有的甲基消耗臭氧层物质。使用压实血提取血浆后表示的另外来源的基因组DNA，从而减少了处理的血液样本量，并减少从每个病人所需的样本的数量。这将最终节省时间和资源。

创建BD P100血液收集系统保存血浆蛋白作为一种改进方法比以前的血浆或血清收集管^1，稳定血液中的蛋白质含量，从而更好的蛋白质生物标志物的发现和蛋白质组学实验从人血。 BD P100的管内含有15.8毫升K2EDTA喷雾干燥和冻干的专有广谱蛋白酶抑制剂鸡尾酒，以防止凝血和稳定的血浆蛋白。它们还包括机械分离器，它提供了离心后的血浆和细胞颗粒之间的物理屏障。已经制订了一些方法提取DNA血块SA收集旧的等离子管mples ^2-4。这些方法的挑战主要与隔板内部管（凝胶分离器）的类型，包括恢复血液凝块的困难，不便过于分散或分散的血块，血块阻塞提取分离凝胶。

我们提出的第一个方法，在新的BD P100管抽血，基因组DNA的提取和净化。我们的DNA样品的质量进行比较，从P100管从EDTA管。我们的做法是简单而有效的。它包括四个主要步骤如下：1）使用的等离子体BD（BD诊断，火花，马里兰州，美国）P100管机械分离器的采血，2）机械分离器除去使用蔗糖的组合和无菌的曲别针的金属钩，3）的血沉棕黄层的层含有白细胞和4的分离）从基因组DNA的分离白膜使用一个普通的商业DNA提取试剂盒或类似的标准协议。

研究方案

1。样品采集

1. 抽取血液样本，从个人与适当的知情同意。对于每一个人来说，绘制成P100管（BD诊断，富兰克林湖，NY，USA）的4〜5毫升血液。为了便于比较，同时收集血液EDTA管。
2. BD P100管含有15.8毫升的喷雾干燥K2EDTA和冻干专利广谱蛋白酶抑制剂的鸡尾酒，以防止凝血和稳定的血浆蛋白。它们还包含一个机械分离器。采集全血后，保持在室温下放置60分钟至过夜，直到两个管子处理发生。
3. BD P100管离心15分钟，在室温下在2,500克。转移到微离心管上方的机械分离器收集的血浆。
4. P100管存储，含有血液分离器下方的压实，在-80°C，直到你准备开始DNA转raction。

2.1从血液P100管（P100_DNA）

1. P100的管保存在-80°C后血浆提取。在3至4个月，检索P100的管中，压实的血液从冷冻和解冻，在37℃的水浴中5分钟（ 图1A）。删除任何残留的血浆分离坐在上面。加入2毫升17％的蔗糖溶液（梯度溶液内部测试-未发表的数据）以上P100管分离（ 图1B）。离心管在室温下搅拌20分钟，在2,500克;这个过程中推压机械分离器管的顶部，产生的血沉棕黄层（ 图1C）的解决方案，包括三层。手动提取使用steriled钩状金属回形针（ 图1D）分隔。
2. 检索从每个管中（ 图1D）的机械分离器后，取出和抛弃它d为顶蔗糖层。转移到无菌的15毫升锥形管的中间层，代表的血沉棕黄层（BC）层。加入磷酸盐缓冲液（PBS），血沉棕黄层体积增加至3ml。按照制造商的建议，使用试剂从Qiagen公司Puregene的血包从白膜中提取的DNA除外的2,500克（而不是2000克）的离心速度。
3. 以溶解和去除红血细胞（RBC），加入9毫升红细胞裂解3毫升的血沉棕黄层。每个管倒置几次，并在室温下孵育10分钟，偶尔在温育过程中反相。向下旋转每种混合物在2,500克5分钟，弃上清。治疗其它颗粒在每个管中，用3毫升的细胞裂解缓冲液和旋涡，持续15秒。治疗的溶胞产物的蛋白沉淀溶液，用1毫升，在15秒的涡流。
4. 2,500 g下离心5分钟，将上清转移到一个新的15毫升锥形管中3毫升100％的异丙醇。反转的新管10倍和离心机在2,500 G为3分钟。弃上清，加入1毫升70％的乙醇。倒置的锥形管打跑了几次，洗DNA沉淀。离心1分钟2500克。允许沉淀3分钟（颠倒放置管），在室温下干燥，然后暂停的的水化溶液用250ml的DNA在37℃下10分钟，并转移至预先标记的1.7毫升的微管。存储管在-80℃直到使用。

2.2从血液的EDTA Ttube（EDTA_DNA）

1. 喷雾涂有10.8毫克K ₂ EDTA，并储存在-80℃下，全血被收集在用于常规免疫血液学测试塑料vaccutainer管由于显像管不包含机械分离器，提取DNA不包括涉及机械分离器（2.1.1和2.1.2）的步骤。
2. 在3至4个月的储血，DNA被提取使用翠鸟的Flex（赛默飞世尔科技，沃尔瑟姆，MA，USA）。这是基于磁性颗粒技术，由细胞裂解/ DNA结合，一些洗涤步骤和DNA洗脱的自动化DNA提取系统。
3. DNA提取中使用的试剂盒是：翠鸟Flex 24的DNA血液试剂盒（Qiagen，德国）。

3。 DNA数量与质量评价

基因组DNA的数量，质量和完整性进行评估相结合的方法，包括picogreen，光谱仪和电泳。

1. 的基因组DNA的浓度来确定的NanoDrop和picogreen定量。
2. Nanodrop分光光度计上测量从260/280的比例来确定的纯度。
3. 样品（500毫微克）还装载在1％琼脂糖凝胶中的DNA的完整性进行评估（退化）。

4。 Genotypin克分析和质量控制

1. 五P100_DNA其相应的EDTA_DNA样本是随机选择使用定制的免疫芯片（DNA分析BeadChip芯片免疫）作进一步的分析。免疫芯片的Infinium含196,524多态性基因分型芯片是专为免疫遗传学研究^5。
2. 对于每个样品，200 ng的DNA被扩增，分散，沉淀和重新悬浮在适当的杂交缓冲液中。
3. 免疫芯片上杂交变性的样品在48℃下至少16小时。
4. 杂交后，免疫芯片单碱基延伸反应和彩色处理。
5. 免疫芯片，然后成像利用Illumina Hiscan的磁珠阵列阅读器和归一化的钢丝强度的数据加载到Illumina公司GenomeStudio软件转换成基因型。基因型使用GenomeStudio自动调用算法被称为。质量控制volves的呼叫率<95％的单核苷酸多态性（SNPs）的排除。
6. 的SNP的呼叫率是用来作为衡量免疫芯片检测的效率。算方法，是检测在芯片上（196524个SNP位点编码的，每个芯片上），达到足够的信号强度和质量，接收一个自动化的基因型分配的总数的百分比。 HapMap的对照DNA免疫芯片检测包括在至少相同的呼叫率预计能实现高品质的DNA（260/280比率为1.8或更高，和不存在下的降解）。质量控制涉及排斥的SNPs与呼叫率<95％，在每个数据集。

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结果

DNA质量评估和浓度测量

的产率P100_DNAs明显低于那些的EDTA_DNAs（ 表1和2）。 260/280的比值所表示的DNA的纯度都P100_DNA EDTA_DNA样品组（ 表1和2）类似。虽然一些退化看到在EDTA_DNA样本，如由光线浸润（ 图2）的各组样本内的DNA的质量是相当均匀的。更多退化的迹象表明EDTA_DNAs也表明DNA浓度降低。

基因分...

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讨论

许多人类疾病的遗传原因和探索人类疾病的遗传基础，要求越来越高品质的DNA。遗传研究中使用的最常见的来源的DNA抗凝全血。因为大多数临床实验室进行生化，血清学，病毒检测表型结果调查中，作为第一步，血液被收集在一个等离子管。后收集血浆，压实的血液经常被丢弃。因此，当需要的DNA进行基因的研究或测试时，需要一个额外的抽血来自同一病人。丢弃的压实血指DNA的一个潜在来源，?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD P100 tubes	BD Diagnostics	366448
EDTA tubes	BD Diagnostics	367863
Sucrose	Sigma	S9378
Paper clip	Office product
15 ml tube	Corning	430052
Red blood cells (RBC)	Qiagen	158389 (kit)
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Thermo Scientific	SH30256.01
BioSprint 96 DNA Blood Kit (48)	Qiagen	940054
1.7 ml microtubes	Axygen	MCT-175-C
Human Immuno DNA Analysis BeadChip Kit	Illumina	WG-352-1001
Bead array reader	Illumina	NA
GenomeStudio Software	Illumina	N/A