Практические и новый метод для извлечения геномной ДНК из крови Комплекты Коллекция по сохранению белков плазмы

Резюме

Мы описываем новый метод выделения геномной ДНК из цельной крови, собранной для плазменных / серологический. После сбора плазмы крови уплотненного обычно выбрасывают. Наш новый метод представляет собой значительное улучшение по сравнению с существующими методами и делает ДНК и плазменными из одной коллекции, не требуя дополнительного крови.

Аннотация

Laboratory tests can be done on the cellular or fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes determines the portion of the blood that can be analyzed (whole blood, plasma or serum). Laboratories involved in studying the genetic basis of human disorders rely on anticoagulated whole blood collected in EDTA-containing vacutainer as the source of DNA for genetic / genomic analysis. Because most clinical laboratories perform biochemical, serologic and viral testing as a first step in phenotypic outcome investigation, anticoagulated blood is also collected in heparin-containing tube (plasma tube). Therefore when DNA and plasma are needed for simultaneous and parallel analyses of both genomic and proteomic data, it is customary to collect blood in both EDTA and heparin tubes. If blood could be collected in a single tube and serve as a source for both plasma and DNA, that method would be considered an advancement to existing methods. The use of the compacted blood after plasma extraction represents an alternative source for genomic DNA, thus minimizing the amount of blood samples processed and reducing the number of samples required from each patient. This would ultimately save time and resources.

The BD P100 blood collection system for plasma protein preservation were created as an improved method over previous plasma or serum collection tubes¹, to stabilize the protein content of blood, enabling better protein biomarker discovery and proteomics experimentation from human blood. The BD P100 tubes contain 15.8 ml of spray-dried K2EDTA and a lyophilized proprietary broad spectrum cocktail of protease inhibitors to prevent coagulation and stabilize the plasma proteins. They also include a mechanical separator, which provides a physical barrier between plasma and cell pellets after centrifugation. Few methods have been devised to extract DNA from clotted blood samples collected in old plasma tubes^2-4. Challenges from these methods were mainly associated with the type of separator inside the tubes (gel separator) and included difficulty in recovering the clotted blood, the inconvenience of fragmenting or dispersing the clot, and obstruction of the clot extraction by the separation gel.

We present the first method that extracts and purifies genomic DNA from blood drawn in the new BD P100 tubes. We compare the quality of the DNA sample from P100 tubes to that from EDTA tubes. Our approach is simple and efficient. It involves four major steps as follows: 1) the use of a plasma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) tube with mechanical separator for blood collection, 2) the removal of the mechanical separator using a combination of sucrose and a sterile paperclip metallic hook, 3) the separation of the buffy coat layer containing the white cells and 4) the isolation of the genomic DNA from the buffy coat using a regular commercial DNA extraction kit or a similar standard protocol.

протокол

1. Сбора проб

1. Соберите образцы крови у лиц с надлежащей информированного согласия. Для каждого человека, привлечь от 4 до 5 мл крови в трубке P100 (BD Diagnostics, Франклин озеро, Нью-Йорк, США). Для целей сравнения одновременно собирать крови в пробирку ЭДТА.
2. BD P100 трубы содержат 15,8 мл высушенного распылением K2EDTA и лиофилизированных собственной широкий спектр коктейлем ингибиторов протеаз для предотвращения коагуляции и стабилизации белков плазмы. Они также содержат механические сепаратора. После сбора цельной крови, держать обе трубки при комнатной температуре в течение 60 минут на ночь, пока обработка не выполняется.
3. Центрифуга BD P100 пробирки при 2500 г в течение пятнадцати минут при комнатной температуре. Передача плазмы, собранной выше механический сепаратор на микро пробирки.
4. Храните P100 трубы, содержащие кровь уплотняется ниже сепаратора, при -80 ° С, пока вы не будете готовы начать ДНК добraction.

2,1 из крови P100 трубку (P100_DNA)

1. P100 трубы хранили при -80 ° C после экстракции плазмы. В течение 3 до 4 месяцев, извлекать P100 пробирку, содержащую уплотненный крови из морозильной камеры и оттаивания при 37 ° на водяной бане в течение 5 мин (рис. 1А). Удаления остаточной плазмой, которая сидит над сепаратором. Добавить 2 мл 17% раствора сахарозы (градиент решения испытано в доме - неопубликованные данные) в P100 трубы над сепаратором (рис. 1В). Центрифуга труб при комнатной температуре в течение 20 мин при 2500 г; этот процесс толкает механического сепаратора в верхней части трубки и дает три слоя раствора, включающего лейкомассы (рис. 1в). Вручную извлечь сепаратор использованием steriled крючковатым скрепки металла (рис. 1D).
2. После получения механический сепаратор из каждой пробирки (рис. 1D), удалять и discarг верхний слой сахарозы. Передача средний слой, представляющий лейкомассы (BC) слой, в стерильные 15 мл коническую трубку. Добавить фосфатом солевой буфер (PBS), чтобы увеличить громкость лейкомассы до 3 мл. Извлечение ДНК из лейкоцитарной пленки с использованием реагентов из крови Kit Qiagen Puregene в соответствии с рекомендацией изготовителя; кроме центрифугирования скоростью 2500 г (вместо 2000 г).
3. Для лизиса и удалить красных кровяных телец (эритроцитов), добавить 9 мл лизис РБК к 3 мл лейкоцитарной пленки. Инверсия каждой трубки несколько раз, и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин с периодическим обращением во время инкубации. Спин каждой смеси вниз на 2500 г в течение 5 мин и отбросить супернатант. Лечение оставшихся гранул в каждую пробирку с 3 мл клеточной лизирующего раствора и вихрь на 15 сек. Лечить лизата с 1 мл раствора белка и вихревые осадков на 15 сек.
4. Центрифуга при 2500 г в течение 5 мин и надосадочную жидкость передавать в свежем 15 мл коническую пробирку, содержащую3 мл 100% изопропанола. Инверсия новой трубы 10 раз и центрифуге при 2500 г в течение 3 мин. Удалите супернатант и добавляют 1 мл 70% этанола. Переверните конические пробирки несколько раз, чтобы выбить и мыть осадок ДНК. Центрифуга при 2500 г в течение 1 мин. Разрешить гранулы сушат в течение 3 мин (поместить трубку вверх дном) при комнатной температуре, а затем приостановить ДНК с 250 мл регидратации раствор при 37 ° С в течение 10 минут и переносят в предварительно меченных 1,7 мл микропробирки. Хранить трубы при -80 ° С до использования.

2,2 из крови ЭДТА Ttube (EDTA_DNA)

1. Цельной крови для обычного тестирования иммуногематологии собирают в пластиковые пробирки vaccutainer распыления покрытый 10,8 мг К ₂ EDTA и хранили при -80 ° С. Поскольку трубы не содержат механические сепаратора экстракции ДНК не включать в себя этапы, связанные с механическим сепаратором (2.1.1 и 2.1.2).
2. В течение 3-х до 4 месяцев хранения крови, DNИзвлекали с помощью KingFisher Flex (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Это экстракции ДНК автоматизации системы, основанной на технологии магнитной частицей и состоит из лизиса клеток / ДНК-связывающий несколько стадий промывки и элюции ДНК.
3. Набор, используемый в экстракции ДНК является KingFisher Flex 24 ДНК крови (Qiagen, Германия).

3. Количество ДНК и оценка качества

Количество, качество и целостность геномной ДНК оценивали комбинацию метода, который включает в себя PicoGreen, спектроскопии и электрофореза.

1. Концентрация геномной ДНК определяется Nanodrop и PicoGreen количественной оценки.
2. Чистота определяется из 260/280 Измерение коэффициента на Nanodrop спектрофотометра.
3. Образец (500 нг) также загружаются на 1% агарозный гель для оценки целостности (деградация) ДНК.

4. Genotypinг анализы и контроль качества

1. Пять P100_DNA и соответствующие образцы EDTA_DNA случайно отобраны для дальнейшего анализа с использованием пользовательских иммуночипа (Иммуно Анализ ДНК BeadChip). Иммуночипа это микросхема Infinium генотипирования полиморфизмов содержащий 196524 и предназначен для исследования иммуногенетическими ^5.
2. Для каждого образца 200 нг ДНК амплифицируют, разобщены, осаждали и ресуспендировали в соответствующем буфере гибридизации.
3. Денатурированные образцы гибридизуют на Immunochips при 48 ° C в течение минимум 16 часов.
4. После гибридизации Immunochips обрабатываются для одной базы расширения реакций и запятнанным.
5. Immunochips затем отображаемого использованием Illumina Hiscan бисера читатель решетки и нормированного шарик данные интенсивность загружается в программное обеспечение Illumina GenomeStudio и преобразуется в генотипами. Генотипы вызываются с помощью алгоритма autocalling GenomeStudio. Контроля качества вvolves исключение одиночных нуклеотидных полиморфизмов (SNP) с призывом скорости <95%.
6. Скорость SNP вызова используется как мера эффективности анализа иммуночипа. Он рассчитывается как процент от общего количества анализов на чипе (196524 SNP, закодированных на каждом чипе), которые обеспечивают достижение достаточной интенсивности и качества сигнала для получения автоматизированной назначение генотипа. Высокое качество ДНК (260/280 Отношение 1,8 или выше, и отсутствие деградации) как ожидается, достигнет по крайней мере, с той же скоростью звонок, так как ДНК HapMap управления включены в анализ иммуночипа. Контроль качества включает в себя исключение ОНП с призывом скорости <95% в каждом наборе данных.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

ДНК оценки качества и измерение концентрации

Выходы P100_DNAs были значительно ниже, чем у EDTA_DNAs (табл. 1 и 2). ДНК чистота лице 260/280 Значение коэффициента одинакова для обоих P100_DNA и EDTA_DNA выборочной совокупности (табл. 1 и 2). Качество ДНК достат?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Многие человеческие болезни имеют генетические причины и изучения генетической основы заболевания человека требует увеличения высокое качество ДНК. Наиболее распространенным источником ДНК используется в генетических исследованиях антикоагулированной цельной крови. Поскольку бо...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD P100 tubes	BD Diagnostics	366448
EDTA tubes	BD Diagnostics	367863
Sucrose	Sigma	S9378
Paper clip	Office product
15 ml tube	Corning	430052
Red blood cells (RBC)	Qiagen	158389 (kit)
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Thermo Scientific	SH30256.01
BioSprint 96 DNA Blood Kit (48)	Qiagen	940054
1.7 ml microtubes	Axygen	MCT-175-C
Human Immuno DNA Analysis BeadChip Kit	Illumina	WG-352-1001
Bead array reader	Illumina	NA
GenomeStudio Software	Illumina	N/A