<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</subATP酶微囊的制备和表演膜片钳记录的Submitochondrial泡膜技术

摘要

一种方法隔离submitochondrial的富集大鼠脑F1FO ATP合酶复合囊泡。这些囊泡允许F1FO ATP酶的活性配合物及其调制使用膜片钳记录技术的研究。

摘要

线粒体都参与许多重要的细胞功能，包括新陈代谢，生存，发展和钙信号^2。的两个最重要的线粒体功能相关的高效生产的ATP，通过氧化磷酸化作用，细胞的能量货币，以及调解的程序性细胞死亡的信号^3。

主要负责产生ATP的酶F1FO ATP合成酶，也称为ATP合酶^4-5。近年来，线粒体的凋亡细胞和坏死细胞死亡的作用已经受到人们的关注。细胞凋亡，如Bax的BCL-2家族蛋白进入线粒体外膜，低聚和通透的外膜，促凋亡因子释放到细胞质^6。在经典的坏死性细胞死亡中，例如，所产生的局部缺血或神经元的兴奋性毒性，LARGE，监管不力，在基体中的钙有助于增加内膜毛孔，线粒体通透性转换孔或mPTP的开放。此去极化内膜，促进外膜破裂，释放促凋亡因子和代谢功能紊乱，导致渗透压的变化。许多蛋白质，包括了Bcl-xL ⁷与F1FO ATP合成酶，调节其功能。 Bcl-xL的直接交互的F1FO ATP合酶β亚基，这种相互作用降低泄漏电导在F1FOATPasecomplex内的，增加的H +净运输期间F1FO F1FO ATPase活性^8，从而增加线粒体效率。要研究ATP合成酶的活性和调制，我们孤立从啮齿动物脑submitochondrial囊泡（SMVS）含有F1FO ATP酶的。 SMVS保留F1FO ATP酶的结构和功能完整性所示在Alavian 等 。在这里，我们描述了一种方法，我们已经成功地用于隔离SMVS大鼠脑和我们划定膜片钳技术分析通道活性（离子泄漏电导）SMVS。

研究方案

1。脑线粒体隔离（ 改编自布朗MR等^。9）

1. 牺牲大鼠批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的使用方法。
2. 切头斩首的动物，切开皮肤，暴露颅骨。
3. 轻轻地打开颅骨切割用剪刀或咬骨钳。取出大脑。
4. 百果精细小脑脑无隔离缓冲（ 见表1），并将其转移到5毫升的玻璃/聚四氟乙烯匀浆器（设备列表）。
5. 轻轻均质组织10次（无气泡），约5分钟。
6. 在1500×g离心样品10分钟，在4°C在台式离心机。
7. （线粒体和突触体）保存上清，弃沉淀（核材料和细胞碎片）。在16,000×g离心10分钟，在4°C，在台式离心机。
8. 丢弃上清，重新悬浮颗粒在500微升的隔离缓冲。破坏与细胞破坏容器（设备列表）突触。施加压力为1,200 psi 10分钟，随后迅速减压。
9. 到聚蔗糖梯度层的混合物（ 见表2），SW-50.1转子和离心的地方126,500×g为20分钟，在4°C在超速离心机（设备列表）。沉淀纯化的线粒体中，层之间的不同密度的聚蔗糖是不间断的突触体。
10. 洗净颗粒隔离缓冲离心16,000×g为10分钟，在4°C在台式离心机。

2。 Submitochondrial囊泡（SMV）隔离（改编自陈等^10）

1. 重悬在200μl结合，用等体积的1％毛地黄皂苷的隔离缓冲线粒体允许坐在在冰上放置15分钟。
2. 添加更多的隔离浅黄色er和离心机在16000×g为10分钟，在4°C在台式离心机。两次做到这一点。
3. 重新悬浮颗粒在200微升隔离缓冲和10％芦布若尔PX（C12E​​9）加入2μl。混合，并允许坐在冰上15分钟。
4. 层混合物加入到隔离缓冲，在SW-50.1转子和离心机在182,000×g在4℃1小时。
5. 洗净最终沉淀在台式离心机隔离缓冲16,000×G离心10分钟，在4°C

3。电生理记录

1. 一个典型的的电生理钻机包括一个放大器，一个Digidata 1440A的模拟 - 数字转换器接口，在与操纵器软件pClamp10.0，显微镜，振动隔离表，法拉第笼配备一台PC电脑。
2. 硼硅玻璃毛细管插入火焰/褐色微管拖轮型号P-87。吸管拉马程序进行了优化，产生与80〜100MΩ的电阻之间的吸液管。
3. SMVS被放置在细胞内的生理溶液（在录制过程中在适当的时间被添加ATP）（ 表3）。膜片钳移液器都充满了相同的解决方案（ATP）。的记录，则通过形成千兆欧姆SMVS密封件置于在室温下。尼康或蔡司倒置显微镜相衬显微镜囊泡的可视化。
4. 膜电位保持在电压范围从-100 mV +100 mV为10秒的期间。录音被过滤在5 kHz使用放大器电路。杂散电或非特异性噪声小于1 PA水平是可取的成功记录。
5. 与的10.0 Clampfit软件例如，以确定的频率和幅度的单信道事件数据进行分析。电压依赖性决定绘制电流电压关系。

结果

我们的协议的第一步骤中可以分离纯化的线粒体，如在图1中所示的Western印迹。在图2中示出一个脑源性submitochondrial的囊泡补丁记录的一个例子。使用内而外的补丁配置，我们展示了调制由ATP通道的活性。控制（CTL）录音（左）显示多导通道活动的平均电导为600 PS的峰值。立刻被减少后1毫米ATP洗澡。三磷酸腺苷的整体效果是SMVS的补丁以浓度依赖的方式减少的电导。要测量...

讨论

描述的方法，本文纯线粒体使隔离结束时，步骤1和步骤的submitochondrial囊泡（SMVS）在步骤2之后从全脑的细胞此方法phenotypes.SMVspurified的没有区别，基本上不含污染的其它亚细胞器所示图1和我们以前的工作（Alavian KN 等 ^。8），并保留其结构和功能的完整性，在冷冻之前。冻融后，分离线粒体或SMVS用于录音和生化检测，但没有呼吸的研究。

此外，此?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle	Krackeler Scientific, Inc.	1-7725T-5
Eppendorf Centrifuge 5424	Eppendorf	5424 000.410
4639 Cell Disruption Vessel	Parr Instrument Company	4639
Ficoll	Sigma-Aldrich	F5415
Polycarbonate centrifuge tubes	Beckman Coulter	P20314
SW-50.1 rotor	Beckman Coulter
L8-70M Ultracentrifuge	Beckman Coulter
Digitonin	Sigma-Aldrich	D5628
Lubrol PX (C12E9)	Calbiochem	205534
Axopatch 200B	Axon Instruments
Digidata 1440A	Molecular Device
pClamp10.0	Molecular Device
Manipulator	Sutter Instrument
Borosilicate glass capillary	World Precision Instruments	1308325
Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87	Sutter Instrument