<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; ATPasi Vesicle Preparazione e tecnica per permettere Bloccare Registrazioni patch di membrane delle vescicole submitocondriali

Riepilogo

Un metodo per isolare vescicole submitocondriali arricchiti in F1FO ATP sintasi complessi da cervello di ratto è descritto. Queste vescicole permettono lo studio dell'attività del complesso F1FO ATPasi e la sua modulazione utilizzando la tecnica di patch clamp di.

Abstract

I mitocondri sono coinvolti in molte importanti funzioni cellulari tra cui il metabolismo, la sopravvivenza a ^1, di sviluppo e, di segnalazione di calcio ^2. Due delle più importanti funzioni mitocondriali sono legati alla produzione efficiente di ATP, la moneta energetica della cellula, dalla fosforilazione ossidativa e la mediazione di segnali per morte cellulare programmata ^3.

L'enzima principale responsabile della produzione di ATP sintasi è il F1FO-ATP, chiamato anche ATP sintasi ^4-5. Negli ultimi anni, il ruolo dei mitocondri nella morte cellulare per apoptosi e necrotiche ha ricevuto notevole attenzione. In morte cellulare per apoptosi, Bcl-2 proteine ​​della famiglia come Bax entrare la membrana mitocondriale esterna, oligomerize e permeabile la membrana esterna, rilasciando fattori pro-apoptotici nel citosol ^6. In classico necrosi cellulare, come quello prodotto da ischemia o eccitotossicità nei neuroni, un large, aumento insufficiente regolazione in matrice calcio contribuisce all'apertura di un poro membrana interna, la permeabilità mitocondriale poro di transizione o mPTP. Questo depolarizza la membrana interna e provoca cambiamenti osmotici, contribuendo alla rottura della membrana esterna, rilascio di fattori pro-apoptotici, e disfunzione metabolica. Molte proteine ​​tra cui Bcl-xL ⁷ interagiscono con F1FO ATP sintasi, modulando la sua funzione. Bcl-xL interagisce direttamente con la subunità beta della F1FO ATP sintasi, e questa interazione decresce una conduttanza di perdita entro il F1FOATPasecomplex, aumentando il trasporto netto di H + da F1FO durante F1FO ATPasi ⁸ e aumentando quindi l'efficienza mitocondriale. Per studiare l'attività e la modulazione della ATP sintasi, abbiamo isolato dal cervello di roditori submitocondriali vescicole (SMVs) contenenti F1FO ATPasi. Le SMVs mantengono l'integrità strutturale e funzionale del F1FO ATPasi come mostrato in Alavian et al. Qui, descriviamo un metodoche abbiamo usato con successo per l'isolamento di SMVs da cervello di ratto e noi delineare la tecnica patch clamp per analizzare l'attività del canale (conduttanza perdita ion) delle SMVs.

Protocollo

1. Cervello mitocondriale Isolamento (Adattato da Brown MR et al. ⁹⁾

1. Sacrifica il topo utilizzando metodi approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa (IACUC).
2. Tagliare la testa dell'animale per decapitazione, tagliare la pelle ed esporre il cranio.
3. Aprire delicatamente il cranio, tagliando con una forbice o rongeur. Rimuovere il cervello.
4. Tritate finemente il cervello senza cervelletto in isolamento Buffer (vedi tabella 1) e trasferirlo in un ml di vetro / teflon omogeneizzatore 5 (vedi elenco attrezzature).
5. Omogeneizzare tessuti delicatamente 10 volte (senza bollicine), circa 5 min.
6. Centrifugare campione a 1500 xg per 10 min a 4 ° C in una centrifuga da banco.
7. Salvare il surnatante (mitocondriale e sinaptosomi) e scartare il pellet (materiale nucleare e detriti cellulari). Centrifugare a 16.000 xg per 10 min a 4 ° C in una centrifuga da banco.
8. Scartaresurnatante e risospendere pellet in 500 ml di tampone di isolamento. Disrupt sinaptosomi con una nave distruzione cellulare (vedere inventario). Applicare una pressione di 1200 psi per 10 minuti, seguita da una rapida decompressione.
9. Strato il composto su Ficoll gradienti (vedi Tabella 2), posto in SW-50.1 rotore e centrifugare a 126.500 g per 20 minuti a 4 ° C in un ultracentrifuga (vedi elenco attrezzature). Il pellet è mitocondri purificato, lo strato tra le diverse densità Ficoll è sinaptosomi undisrupted.
10. Lavare pellet mediante centrifugazione in isolamento Tampone a 16.000 xg per 10 min a 4 ° C in una centrifuga da banco.

2. Submitocondriali vescicole (SMV) Isolamento (Adattato da Chan et al. ¹⁰⁾

1. Risospendere mitocondri in 200 microlitri di buffer di isolamento combinato con un uguale volume di 1% digitonina e lasciar riposare in ghiaccio per 15 min.
2. Aggiungere più Isolamento Buffer e centrifugare a 16.000 xg per 10 min a 4 ° C in una centrifuga da banco. Fate questo due volte.
3. Risospendere pellet in 200 microlitri di buffer di isolamento e aggiungere 2 ml di 10% Lubrol PX (C12E9). Mescolare e lasciar riposare in ghiaccio per 15 min.
4. Miscela strato sul buffer di isolamento, posto in SW-50.1 rotore e centrifugare a 182.000 xg a 4 ° C per 1 ora.
5. Lavare pellet finale mediante centrifugazione in una centrifuga da tavolo in isolamento Tampone a 16.000 xg per 10 min a 4 ° C.

3. Registrazione elettrofisiologica

1. Un tipico impianto di elettrofisiologia include un amplificatore, un computer PC dotato di un Digidata 1440A interfaccia convertitore analogico-digitale in combinazione con il software pClamp10.0, manipolatori, un microscopio, un tavolo isolamento dalle vibrazioni, gabbia di Faraday.
2. Borosilicato capillari di vetro sono inserite in un Flaming / Brown Micropipetta Puller modello P-87. Un programma di pipetta-estrattore è ottimizzato pergenerare pipette con resistenze tra 80 a 100 MW.
3. SMVs vengono poste in una soluzione fisiologica intracellulare (ATP viene aggiunto al momento opportuno durante la registrazione) (Tabella 3). Patch pipette clamp sono riempite con la stessa soluzione (senza ATP). Le registrazioni sono fatte da formare una guarnizione giga-ohm sul SMVs a temperatura ambiente. Le vescicole sono visualizzabili al microscopio a contrasto di fase con un microscopio invertito Nikon o Zeiss.
4. Il potenziale di membrana è mantenuta una tensione da -100 mV a + 100 mV per periodi di 10 secondi. Registrazioni vengono filtrati a 5 kHz utilizzando il circuito dell'amplificatore. Livelli di rumore elettrico o non specifici stray inferiore a 1 pA sono desiderabili per la registrazione di successo.
5. Dati vengono analizzati con il software Clampfit 10,0 per esempio per determinare la frequenza e l'ampiezza di eventi singolo canale. Dipendenza di tensione è determinato tracciando un rapporto di tensione di corrente.

Risultati

Il primo passo del nostro protocollo consente l'isolamento di mitocondri purificati come mostrato mediante Western blot in Figura 1. In figura 2 è mostrato un esempio di un derivato dal cervello submitocondriali registrazione cerotto vescicola. Utilizzando la configurazione di patch dentro-fuori dimostriamo attività del canale modulato da ATP. Il controllo (CTL) di registrazione (a sinistra) mostra l'attività del canale multi-conduttanza con una conducibilità massima di 600 ...

Discussione

I metodi qui descritti permettono l'isolamento di puro mitocondri alla fine del passaggio 1 e vescicole submitocondriali (SMVs) dopo il passo 2 dal cervello intero senza distinzione di cella phenotypes.SMVspurified da questo metodo sono essenzialmente esente da contaminazione da altri organelli subcellulari come mostrato nella figura 1 e nostro precedente lavoro (Alavian KN et al. ⁸⁾ e mantengono la loro integrità strutturale e funzionale prima del congelamento. Dopo il congelam...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Potter-Elvehjem Tissue Grinder withPTFEPestle	Krackeler Scientific, Inc.	1-7725T-5
Eppendorf Centrifuge 5424	Eppendorf	5424 000.410
4639 Cell Disruption Vessel	Parr Instrument Company	4639
Ficoll	Sigma-Aldrich	F5415
Polycarbonate centrifuge tubes	Beckman Coulter	P20314
SW-50.1 rotor	Beckman Coulter
L8-70M Ultracentrifuge	Beckman Coulter
Digitonin	Sigma-Aldrich	D5628
Lubrol PX (C12E9)	Calbiochem	205534
Axopatch 200B	Axon Instruments
Digidata 1440A	Molecular Device
pClamp10.0	Molecular Device
Manipulator	Sutter Instrument
Borosilicate glass capillary	World Precision Instruments	1308325
Flaming/Brown Micropipette Puller Model P-87	Sutter Instrument