从环境中自然产生的趋磁细菌的采集，分离和富集

摘要

我们展示了一个方法，可以应用到天然水域中收集的趋磁细菌（MTB）。 MTB可以从沉积物样品，用一个相对简单的设置，利用细菌的天然磁分离和富集。隔离MTB然后可以同时使用光学和电子显微镜详细检查。

摘要

趋磁细菌（MTB）的水生微生物，特别是在美国马萨诸塞州的盐沼的沉积物样品于1975年^1。自那时起已发现的MTB分层水和沉积物列来自世界各地的^2。是，它们含有磁小，这是磁铁矿的细胞内，膜-结合的磁性纳米晶体铁（Fe ₃ O _4）和/或胶黄铁矿铁（Fe ₃ S _4），或两者^3，4的一个共同特征的所有MTB。在北半球，MTB通常吸引到南端的一个条形磁铁，而在南半球，他们通常会吸引到北端的磁铁^3,5。可以利用此属性时，试图从环境样品中分离出MTB。

丰富MTB的最常用的方法之一是使用一个透明的塑料容器收集沉淀物和水的天然来源，如一个淡水池。在北半球，南端的一个条形磁铁放在对外部的容器上面的泥沙沉积物 - 水界面。一段时间后，细菌可以从附近的容器的内部，用移液管的磁铁，然后通过使用毛细管赛马场⁶和磁体进一步丰富。一旦丰富，细菌可以被置于显微镜载片上，使用悬滴法，并在光学显微镜下观察到的，或沉积到铜网格，使用透射型电子显微镜（TEM）观测。

使用这种方法，被隔离MTB可以研究微观特性来确定，例如游泳行为，鞭毛，细胞形态的细胞，磁性的结晶形状，磁数，在每个单元格中的磁链数，组合物的类型和数量的的nanomineral结晶体，与细胞内空泡的存在。

研究方案

1。 MTB收藏

1. 决定在淡水网站收集趋磁细菌（MTB）时，它往往是最好的开始，一个池塘或滞销，有一个软泥质沉积物层流。在这个演示中，我们收集了样品Olentangy河的边缘，在校园里，在哥伦布市俄亥俄州立大学（OSU），俄亥俄州（美国）。虽然这是一个方便的位置，我们的演示，这里所描述的协议是适用于任何水生的位置。在该协议中所使用的材料，在表1中可以发现。查找位置的水的深度是10和100厘米之间。在这样的位置，你应该收集的最上层的沉积物用清晰的，螺旋盖的容器内。舀到容器中的沉淀物和水，直到它被填充有三分之一到二分之一的沉积物和与水的剩余量。保持容器淹没，直到它被装满了水，然后盖紧瓶盖的容器瓦特第i个其螺杆顶盖。这是没有必要的，混合的泥沙。擦拭外容器用毛巾擦干，然后把您的实验室样品。这是没有必要急于样品，您的实验室。我们已经离开MTB样品的前几天把他们带回我们的实验室在该领域的塑料容器。 ，MTB应该是可行的，为几个星期到几个月，只要为您储存在阴凉，阴凉的地方，在该领域的样品。
2. 一旦样品是在您的实验室，松开帽和离开它覆盖容器，以减少的蒸发量。存储容器，在室温下，在黑暗的房间，抽屉，或完全覆盖的容器用铝箔。允许的沉积物和细颗粒，以完全沉淀到容器的底部离开样品静置几个小时至几天。这是没有必要混合沉积物，MTB宁愿不受干扰的环境。清晰的塑料容器壁将让你确认，颗粒稳定的底部。 MTB可以根据您的样品，仍然活着，在许多个月的样本。

2。 MTB隔离

1. 当您准备好隔离MTB，地点磁铁的塑料容器的两侧约1厘米以上的沉积物-水界面（ 图1A）。要小心，不要打扰在容器底部的沉积物。一侧上的相对侧上（ 图1A）的容器和另一个条形磁铁的北侧放置条形磁铁的南极。几乎任何磁铁都可以使用，例如一个磁性搅拌棒或大冰箱磁铁。可以使用任何支持的磁铁在上面的沉积物 - 水界面正确的高度。我们发现，休息的纸板或塑料盒的顶部上的磁铁是最好的，然而，磁体也可以贴在塑料容器的外部。等待30分钟到几个小时的细菌游泳的磁铁。
2. 用无菌吸管仔细收集水的容器内（ 图1A）位置附近的东南极的条形磁铁（在北半球收集的样本）。这水应该包含MTB都被吸引到南极条形磁铁。接着，毛细管赛道应被用来进一步丰富的MTB。

3。山地车赛道

1. 为了丰富您的趋磁细菌的样品，毛细管的赛道是必要的（ 图1B和1C）。这些都需要在之前的透明塑料容器分离的细胞。
2. 使用5.75英寸（146毫米）的玻璃巴斯德吸管跑马场。使用金​​刚石笔或文件切断的移液管的顶部，吸移管的长度是不关键的，但它应该是能够包含约1-2毫升的水。接下来，使用本生灯融化的小费，所以它变得密封（ 图1C）。将得到的移液管，应具有一个开口端和一个密封端。
3. 请几个这些赛道，然后高压灭菌器。此外，您将需要进行高压灭菌棉和几个长的金属针。
4. 将过滤后的样品水，收集从图1A中所示的泥沙水界面附近，使用一个长的金属针连接到过滤注射器蒸压赛马场。过滤器的孔径大小应为0.22毫米至消除碎屑和杂质从水中。这是重要的，必须绝对确定，没有气泡的玻璃毛细管中。
5. 将底部的赛道上用无菌棉（ 图1B）。使用金属针推棉花朝向密封端的赛道，所以它是0.5 - 1 cm的距离，从密封的尖端（ 图1C）。
6. 使用无菌移液管，添加的MTB含水（从第2.2节）到样品ŕeservoir（开口），准备好的山地车赛道（ 图1B）。

4。 MTB富集

1. 一旦在赛道充满了流体样品，奠定它在其一侧的水平表面上（ 例如 ，台式），并把条形磁铁的南极（在北半球）下一个密封的尖端赛车场（ 图1B和图1C）。
2. 等待5到30分钟的MTB迁移通过棉花。然后，你应该收集赛道上的尖端附近的流体。等待的时间太长，可以引入污染物，如其他的活动细菌，在毛细管的前端。或者，您也可以使用光学显微镜的赛道上，以查看提示和观看的的MTB收集在赛道上的尖端。这将允许您确定需要多长时间的山地迁移到棉塞。
3. 轻轻地用钻石刀做一点点划痕附近的棉塞和折断的赛道结束。
<李>使用一个狭窄的针（规格为25或27）1毫升注射器从尖端的赛道上卸下流体。这种液体样品应含有丰富的MTB。

5。 MTB通过光学显微镜观察

1. 将下降（10-20微升）的盖玻片上的丰富MTB样品。
2. 快速翻转盖玻片下拉朝下和盖玻片上挂着。
3. 盖玻片放置到放置在载玻片上的O形环。的O形环应具有稍小的直径然后盖玻片（大约1厘米， 图2）。
4. 把这个挂下降到光学显微镜阶段，集中在一个边缘的下降。一个60X干目标非常好，因为最具有较高的数值孔径（NA， 例如 ，0.93），但不需要油，这是很难用悬滴法（ 图2）。
5. 将酒吧磁铁靠近南端的悬挂ðROP和MTB将开始移向边缘最近的磁铁（ 图3）的下拉。在几分钟之内，许多MTB应的下拉式菜单中的边缘处（ 图3）。证明自己细菌通过扭转的磁铁的磁极是磁性的，然后在相反的方向观察细菌游泳。

6。 MTB观察，用透射电子显微镜（TEM）

1. 放置到一个铜网的富集MTB下降（〜20微升），并允许在10分钟细菌定居。
2. 威克把多余的水用一块干净的滤纸。
3. 任选地，可以负染网格与2％乙酸双氧铀，2％磷钨酸的pH 7.2，或2.5％的钼酸钠^7，8，9。这是通过放置在铜网格到一滴色斑立即孵育后的网格与富集MTB。孵育网格与负染色，时间将有所不同，这取决于在st上艾因使用，然后灯芯关闭流体用一块干净的滤纸。
4. 观察使用透射电子显微镜（TEM， 图4）的MTB。对于这里所描述的工作MTB吸附福尔瓦稳定和碳包覆200目铜网格（特德·佩拉＃01800）。在网格置于与碳侧向下下降的细胞悬浮液达10分钟，然后立即洗涤一次，由放置在网格上的一滴水，持续30秒。染色，电网下降2％的醋酸铀（特德·佩拉＃19481）30秒〜5分钟，然后完全干燥的滤纸采用了一块。通过TEM使用FEI TECNAI精神在80KV或FEI TECNAI F20的使用高角度环形暗场干200KV电网进行了分析。

结果

一块磁铁是一种有效的工具，它可以被用来隔离磁细菌（MTB）的环境样品中（ 图1A）所载。的毛细管赛马场（ 图1B）使用的磁特性的MTB吸引他们通过棉塞在那里他们可以从非趋磁也包含在环境样品的微生物分离。

图1。一个透明的塑料瓶，含泥沙和水样采集?...

讨论

趋磁细菌不一定在每一个水生环境，但是当他们这样做时，他们可以找到为100 - 1000细胞每毫升^2。为了观察到的的MTB使用光学显微镜，你将需要大约50个细菌/ ml在您的样品^8。如果没有或很少MTB在你的样品，然后你需要选择一个新的环境网站收集您的样品或你需要尝试的一个或多个在下一节中讨论的技术。

首先，你应该尝试从环境中收集更多的泥沙用一个大塑?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
产品名称	公司	目录编号	评论（可选）
载玻片	Fisher Scientific则	S95933
玻璃巴斯德移液管	Fisher Scientific则	13-678-6A
O-环	五金店
盖玻片	Fisher Scientific则	12-542B
条形磁铁	Fisher Scientific则	S95957
容器	任何		任何PLAST集成电路或玻璃容器中，可容纳至少为0.5 L和可以被密封
棉	任何
显微镜60X干镜头	蔡司		60X干镜头是完全没有必要的，但不使用石油，这提供了非常高的NA
钻石笔	Fisher Scientific则	08-675
0.22毫米滤光器	Fisher Scientific则	09-719C
1ml注射器	Fisher Scientific则	NC9788564
微量离心管	Fisher Scientific则	02-681-320
福尔瓦/碳200目铜网上	特德·佩拉公司	01800
醋酸铀	特德·佩拉公司	19481
TECNAI精神TEM	FEI
TECNAI F20 S / TEM	FEI