Сбор, выделение и обогащение природного происхождения магнитотактических бактерий из окружающей среды

Резюме

Мы демонстрируем метод сбора магнитотактических бактерий (MTB), которые могут быть применены к природной воды. MTB могут быть выделены и обогащенный из проб донных осадков с помощью сравнительно простой установки, которая использует природный магнетизм бактерий. Изолированные MTB могут быть подробно рассмотрены, используя как световой и электронной микроскопии.

Аннотация

Магнитотактических бактерий (МТБ) являются водными микроорганизмами, которые впервые были описаны в частности 1975 ¹ из проб донных осадков, собранных в солончаки штата Массачусетс (США). С тех пор MTB были обнаружены в стратифицированную воды и осадка колонн со всего мира ^2. Одной из особенностей, общих для всех MTB является то, что они содержат магнитосом, которые являются внутриклеточными, мембраносвязанных магнитных нанокристаллов магнетита (Fe ₃ O ₄₎ и / или грейгит (Fe ₃ S ₄₎ или как ^{3, 4.} В Северном полушарии, MTB, как правило, привлекают к юго конца стержневого магнита, в то время как в южном полушарии они, как правило, привлекают к северному концу магнита ^3,5. Это свойство может быть использовано при попытке изолировать MTB из проб окружающей среды.

Одним из наиболее распространенных способов обогащения MTB является использование прозрачных пластиковых контейнеров для сбора осадка и воды из природного источника,таких как пресноводный пруд. В Северном полушарии, в южной части стержневого магнита помещается в отношении внешней поверхности контейнера чуть выше осадок в осадок-вода. Через некоторое время, бактерии могут быть удалены из внутри контейнера рядом с магнитом с помощью пипетки, а затем обогащенный дальнейшем с помощью капиллярной ипподроме ⁶ и магнита. Как только обогащается, бактерии могут быть размещены на предметное стекло микроскопа использовании висячей капли метод и наблюдать в световой микроскоп или наносится на медную сетку и наблюдать с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ).

Используя этот метод, изолированные MTB могут быть изучены при помощи микроскопа, чтобы определить характеристики, такие как плавание поведения, тип и количество жгутиков, клеточной морфологии клеток, форма магнитных кристаллов, количество магнитосом, количество магнетосом сети в каждой ячейке, состав nanomineral кристаллов, а наличие внутриклеточных вакуолей.

протокол

1. Коллекция MTB

1. При принятии решения о пресноводных сайт для сбора магнитотактических бактерий (MTB), часто лучше всего начать с прудом или медленно движущийся поток, который имеет мягкий мутный слой осадка. В этой демонстрации мы собрали образцы на краю Olentangy реки на территории студенческого городка Университета штата Огайо (OSU) в Колумбусе, штат Огайо (США). В то время это было удобное место для нашей демонстрации, протокол, описанный здесь применимо к любой водной месте. Материалы, используемые в настоящем протоколе можно найти в таблице 1. Найти место, где глубина воды составляет от 10 до 100 см. В таком месте, вы должны собрать самый верхний слой осадка использованием ясно, с завинчивающейся крышкой контейнера. Совок отложений и воды в контейнере, пока не будет заполнена одной трети до половины осадка и оставшийся объем воды. Держите контейнер погружения, пока не будет заполнена водой, а затем жестко ограничить контейнер сого ее завинчивающейся крышкой. Это не следует смешивать осадка. Протрите снаружи контейнера сухим полотенцем, а затем взять образец вашей лаборатории. В этом нет необходимости спешить образца обратно в лабораторию. Мы оставили MTB образцы в пластиковых контейнерах в поле за несколько дней до возвращения их в нашу лабораторию. MTB должны быть жизнеспособными в течение нескольких недель до нескольких месяцев, пока вы храните образцы в сухом, прохладном месте в области.
2. Как только образец находится в вашей лаборатории, ослабьте крышку и оставить его покрытие контейнера, чтобы уменьшить количество испарения. Храните контейнер при комнатной температуре в темном помещении, ящик или полностью покрывать контейнер с алюминиевой фольгой. Разрешить осадка и мелкие частицы полностью оседают на дне контейнера, оставляя нетронутыми образцы в течение нескольких часов до нескольких дней. Это не следует смешивать осадков, MTB предпочитаете спокойное проживание. Ясно стенах пластиковом контейнерепозволит вам убедиться, что частицы осели на дно. В зависимости от вашего образца, MTB могут оставаться живыми в образце в течение многих месяцев.

2. MTB изоляции

1. Когда вы будете готовы, чтобы изолировать MTB, магниты места по бокам пластиковый контейнер примерно на 1 см выше осадок-вода (рис. 1А). Будьте осторожны, чтобы не потревожить осадок на дне емкости. Поместите южного полюса стержневого магнита на одной стороне контейнера и северной стороны другого стержневого магнита на противоположную сторону (рис. 1А). Практически любой магнит может быть использован, например, магнитной мешалкой или большой магнит холодильника. Все может быть использован для поддержки магниты на нужной высоте над осадком воде интерфейс. Мы обнаружили, что отдыхает магниты на вершине картонные или пластиковые окна лучше всего, однако, магниты также могут быть приклеенный к внешней стороне пластикового контейнера. Подождите 30 минут до несколькихчасы для бактерий, чтобы плыть к магниту.
2. С помощью стерильной пипеткой тщательно собирать воду внутри контейнера (рис. 1А) около положения южного полюса стержневого магнита (для образцов, собранных в Северном полушарии). Эта вода должна содержать MTB, которые были привлечены к юго-полюс магнита. Далее, капиллярный ипподроме должны быть использованы для дальнейшего обогащения MTB.

3. MTB Racetrack

1. Для того, чтобы обогатить ваш пример с магнитотактических бактерий, капиллярный ипподроме необходимости (рис. 1В и 1С). Они должны быть сделаны до выделения клеток из ясного пластиковый контейнер.
2. Используйте 5,75 дюймовый (146 мм) стекло пипетки Пастера, чтобы ипподроме. Используйте перо алмаза или файл, чтобы отрезать верхнюю часть пипетки, длина пипетки не критично, но она должна быть в состоянии содержать примерно 1-2 мл воды. Затем с помощью газовой горелки, чтобы расплавить кончик так, чтобыона становится запечатанные (рис. 1С). В результате пипетки должны иметь открытый конец и запечатанный конец.
3. Сделайте несколько таких гоночных трассах, а затем автоклав. Кроме того, вы должны будете автоклав хлопка и несколькими длинными металлическими иглами.
4. Добавить фильтруется проб воды, собранных из вблизи границы осадка воды показано на рисунке 1а, чтобы автоклавного ипподроме помощью длинной иглы металла прикреплена к фильтруется шприц. Размер пор фильтра должен быть 0,22 мм для устранения мусора и загрязняющих веществ из воды. Важно быть абсолютно уверены, что нет никаких пузырьков воздуха в стеклянный капилляр.
5. Вставьте нижнюю часть ипподрома с стерильной ватой (рис. 1б). С помощью металлической иглы нажать на хлопок на запечатанный конец трека, так что 0,5 - 1 см от кончика запечатанный (рис. 1С).
6. С помощью стерильной пипеткой, добавляют MTB содержащих воду (из раздела 2.2) к образцу гeservoir (открытый конец) подготовленного ипподрома MTB (рис. 1б).

4. MTB обогащению

1. После ипподроме наполнен образец жидкости, положите его на бок на горизонтальную поверхность (например, настольные) и поместить южного полюса стержневого магнита (в Северном полушарии) рядом с запечатанной кончик ипподроме (рис. 1B и 1С).
2. Подождите 5 до 30 мин для MTB мигрировать через хлопка. Тогда вы должны собирать жидкости вблизи вершины ипподроме. Ожидание слишком долго может ввести загрязняющих веществ, таких как другие подвижные бактерии, до кончика капилляра. При желании можно использовать световой микроскоп, чтобы посмотреть кончиком ипподром и смотреть MTB собирать на верхушке ипподроме в. Это позволит вам определить, как долго он принимает MTB мигрировать через ватный тампон.
3. Осторожно использовать алмазный нож, чтобы сделать небольшой царапины около ватный тампон и обрывать конце ипподрома.
4. Используйте 1 мл шприц с узкой иглы (25 или 27 калибра), чтобы удалить жидкость из кончика ипподроме. Эта жидкость образца теперь должен содержать обогащенного MTB.

5. MTB наблюдения с помощью световой микроскопии

1. Поместите каплю (10-20 мкл) образца обогащенного MTB на покровное.
2. Быстро переверните покровное над тем, падение в настоящее время сталкивается вниз и свисают с покровным.
3. Поместите покровное на уплотнительное кольцо, которое покоится на стекле. Уплотнительное кольцо должно быть немного меньше диаметра затем покровное (около 1 см; рис. 2).
4. Разместите эту висячей капли на свет столик микроскопа и сосредоточить внимание на одном краю капли. 60X сухой цели работает очень хорошо, потому что большинство из них имеют высокую числовую апертуру (NA, например, 0,93), но не требуют масла, которые трудно использовать для висячей капли метода (рис. 2).
5. Поместите в южной части стержневого магнита близко к висящей гROP и MTB начнет мигрировать к краю капли ближе к магниту (рис. 3). Через несколько минут многие MTB должна быть на краю капли (рис. 3). Докажите себе, что бактерии обладают магнитными свойствами путем изменения полюсом магнита, а затем наблюдать бактерии плавают в противоположном направлении.

6. MTB наблюдения методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ)

1. Место падения (~ 20 мкл) обогащенного MTB на медную сетку и позволяют бактериям урегулировать в течение 10 мин.
2. Вика лишнюю воду с кусочком чистой фильтровальной бумаги.
3. Необязательно, сетка может быть негативно окрашенных 2% уранилацетата, 2% фосфорно-кислый 7,2, или 2,5% раствор натрия молибдат ^{7, 8, 9.} Это делается путем размещения медную сетку на каплю пятно сразу же после инкубации сетки с обогащенным MTB. Инкубируйте сетки с отрицательной окраски, раз будет меняться в зависимости от улАйн использовать, а затем фитиль от жидкости с куском чистой фильтровальной бумаги.
4. Соблюдайте MTB использованием просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ, рисунок 4). Для работы описаны здесь MTB были адсорбированных на формвар стабилизированный и углерода покрытием 200 меш медной сетки (Ted Pella # 01800). Сети были размещены с углеродом стороной вниз на каплю суспензии клеток в течение 10 мин, затем сразу же промывают один раз путем размещения сетки на каплю воды на 30 сек. Для окрашивания, сетки были размещены на капли 2% уранилацетата (Ted Pella # 19481) за 30 сек до 5 мин, а затем полностью высушить с помощью куска фильтровальной бумаги. Решетки были проанализированы с помощью ПЭМ, используя либо Дух FEI Tecnai на 80kV или FEI Tecnai F20 с использованием высоких темных углов кольцевой STEM поле на 200 кВ.

Результаты

Магнит является эффективным инструментом, который может быть использован для выделения магнитотактических бактерий (MTB), содержащихся в пробах окружающей среды (рис. 1А). Капиллярной ипподроме (рис. 1б) использует магнитные свойства MTB, чтобы привлечь их через ватный та...

Обсуждение

Магнитотактических бактерии не обязательно имеются в каждом водную среду ^8, но когда они происходят, они могут быть найдены порядка 100 - 1000 клеток на миллилитр ^2. Для того чтобы наблюдать MTB с помощью оптической микроскопии, необходимо около 50 бактерий / мл в образце ^8. Есл...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Наименование	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (по желанию)
Стеклах	Fisher Scientific	S95933
Стекло Пастера пипец	Fisher Scientific	13-678-6A
О-образное кольцо	Оборудование магазинов
Обложка квитанции	Fisher Scientific	12-542B
Стержневой магнит	Fisher Scientific	S95957
Контейнер	Любой		Любой пластIC или стеклянный контейнер, который может содержать по меньшей мере 0,5 л и может быть опломбирована
Хлопок	Любой
Микроскоп с объективом 60X сухой	Zeiss		60X сухой объектив не является абсолютно необходимым, но это дает высокую НС без использования масла
Алмазный пера	Fisher Scientific	08-675
0,22 мм фильтр	Fisher Scientific	09-719C
1 мл шприца	Fisher Scientific	NC9788564
Микроцентрифуга труб	Fisher Scientific	02-681-320
Формвар / Carbon200 меш, медные сетки	Тед Пелла Инк	01800
Уранилацетата	Тед Пелла Инк	19481
Tecnai Дух TEM	FEI
Tecnai F20 S / TEM	FEI