显微吗啉代寡核苷酸脑室微量注射成年斑马鱼大脑中的基因表达

摘要

在这篇文章中，我们展示了一个使用吗啉反义寡核苷酸的成年斑马鱼端脑心室肌细胞的基因表达的方法操纵。我们将此方法作为一个高效，快速的协议，该协议可用于在成年脊椎动物脑的功能性研究。

摘要

操纵基因表达的组织需要进行功能研究。在本文中，我们证明脑室微量注射（CVMI）的技术作为一种手段来调节基因表达的成年斑马鱼脑。物质通过使用CVMI，可以施用到脑室流体和彻底分布沿rostrocaudal的轴的大脑。我们尤其侧重于使用的吗啉代反义寡核苷酸，是强有力的工具，撞倒体内基因表达。在我们的方法中，当应用，吗啉分子采取了由内壁细胞的心室面。这些细胞的放射状胶质细胞，神经源性祖细胞作为。因此，撞倒放射状胶质细胞的基因表达是最重要的分析斑马鱼的的广泛神经发生反应，也将提供洞察脊椎动物如何维持成人neurogen的ESIS响应。这样的理解，也将有助于在人类神经退行性疾病的临床应用和中枢神经系统的再生的努力。因此，我们提出了一种快速而有效的方式来改变基因的表达在成年斑马鱼的前脑和神经反应的脑室微量注射的方法。我们还提供故障排除提示和其他有用的信息，如何开展的CVMI程序。

引言

成年神经发生的脊椎动物是一个共同的特点，但其患病率和效率程度不同与系统发育^{1,2,3,4,5,6。}例如，成年哺乳动物的大脑中含有干细胞区域，很大程度上制约了前脑^7,8，而硬骨鱼斑马鱼含有16个不同的干细胞领域和相关的神经源性区在其整个大脑^4,5,9,10。这种变化可能反映了哺乳动物和斑马鱼之间的差距在维持干细胞和神经源性祖细胞的能力的机制。斑马鱼大脑中的神经元的终身能力也可以对斑马鱼脑的分子机制可能被利用为治疗中的应用，以解决人类神经退行性疾病的临床后果。

几种干细胞区的成年斑马鱼的大脑已经加以分析，它已被证明这些地区的心室面衬细胞作为祖细胞^9,11-20。在斑马鱼端脑的详细分析，例如，确定了径向神经胶质细胞，划定该脑区域的心室表面神经源性祖细胞^19，20。这也是如此，对其他地区，如小脑和视顶盖，心室位于神经上皮细胞神经源性输入^16,21。为此，了解成年斑马鱼脑广泛神经源性能力的分子机制，需要操纵中的祖细胞的基因表达。

以前各种方法调节基因的功能在斑马鱼。这些措施包括生成条件的转基因株系，表达一个单一的蛋白质，质粒注射焦点耦合电或化学治疗所需的变种。我们之前设计了一个管理各种物质，包括吗啉代寡核苷酸或蛋白作为一种快速而有效的方式调节基因的功能在心室肌细胞的成年斑马鱼的前脑²²使用脑室的显微注射到成年斑马鱼脑的方法。在我们的研究中，体内吗啉代被使用，因为他们的化学涉及吗啉分子共价连接到精氨酸丰富交纳的肽，从而可以有效的传递到感兴趣的细胞，而不需要额外的通透性，如电穿孔^23。这将使一个彻底的定位所需的组织注射后，就像我们所观察到的成年斑马鱼端脑^22。的体内吗啉使用，因此优于已有的方法，如电或局部注射DNA分子组织靶向。

在这里，我们直观地显示出我们如何执行此操作，并提供了一步一步的协议。我们先从解释准备注射液和鱼被注入，进行示范如何注射装置设置。我们提供描述脑室注射的方法，它涉及产生切口的吗啉代，用微量注射器在颅骨和注射。我们也阐述一个关键点需要通过优化或故障排除指南，说明他们在整个过程中要谨慎。

研究方案

1。注射液的制备

1. 使用细胞内在他们更有效地比正常的吗啉分子的体内吗啉。请参见制造商的信息资料（ 表1:试剂和材料）。
2. 用荧光示踪染料（ 如 CellTracker红CMTPX，Invitrogen公司）的可视化注射的准确性。这种染料在细胞代谢，并仅在细胞摄取后成为荧光。因此，这一步是至关重要的，以确定细胞，有效地由脑室微量注射对象。
3. 准备磷酸盐缓冲盐水（PBS）稀释吗啉溶液（137 mM氯化钠，2.7 mM的氯化钾，10mM的_磷酸氢二钠，2 mM的KH ₂ PO _4，pH值:7.4）。如果啉溶液稀释时，请务必使用PBS。
4. 准备注射10μl的混合，加入9微升的吗啉溶液和1μl的第ê细胞追踪染料（稀释或不稀释。股票啉溶液浓度为500微米。我们先前的研究表明^，22几个不同剂量的吗啉-从50微米到500微米不等-从高效击倒在不同层次的结果击倒低表现量的表型）。 1微升溶液注射到斑马鱼脑都不够理想。
5. 搅拌均匀，存放在室温下，直到注射。

2。注射的装置的下游

1. 准备玻璃注射毛细血管的使用针拉马。使用以下参数:供暖周期值:463，拉周期值:230，速度:1.5秒，时间:75毫秒。
2. 打开压力源，压力设置和调整到50磅或3.5酒吧。
3. 微量的设置调整如下:保持压力20磅，10磅弹出压力，周期值2.5和100毫秒范围内浇注。
4. 转环形照明和定位环在显微镜阶段。
5. 毛细管支架放置到适当的位置旁边的显微镜。
6. 插入到保持器的玻璃毛细管。调整喷射角度为45度。
7. 折断的玻璃毛细管的前端，用细镊子从孔校准的压力输出。所以必须进行测试成鱼水浸渍的针尖，并给予一个连续的压力脉冲。的所产生的气泡，应该只有一个行，这是最佳的压力的指示/孔口尺寸。请参阅该校准示范视频。
8. 装入玻璃毛细管注射溶液，无气泡的产生。
9. 施加压力，以除去玻璃毛细管的尖端和加载的注射液之间的空气。

3。麻醉

1. 准备麻醉剂原液（0.1％MESAB - 乙基-米 - 氨基苯甲酸甲酯甲磺酸盐）。
2. 从坦克到塑料鼠笼与足够量的水或其他运输容器中取出所需数量的鱼。
3. 准备药物麻醉的解决方案，在一个小的塑料框中，然后通过鱼200毫升水混合，用5毫升的麻醉剂原液。麻醉剂的最终浓度为:0.0025％（体积/体积）。
4. 半麻醉剂填补了塑料培养皿。使用此注射菜。
5. 孵育麻醉药的鱼，直到鱼制胜。

4。切口和脑室微量注射

1. 用鱼网从包装盒中取出的鱼，并把它放到培养皿。
2. 镊子和头部的方向轻轻按住鱼的方式，稍向下倾泻。这将有利于切口。
3. 生成头骨上使用的是30号刺针缝小。只能使用针头和不穿透多够进入大脑，因为这会造成脑组织的损害，表现为出血。
4. 持续按住鱼和通过切口部位插入尖端的玻璃毛细管。
5. 东方玻璃毛细管的尖端朝向端脑。避免接触的脑组织，因为这会产生组织损伤，也能防止注入溶液分散。
6. 注入的溶液。的液体注射后立即分散。

5。注射精度的恢复和分析

1. 用新鲜的鱼水的塑料盒中取出鱼从注射设置和地点。
2. 允许恢复。
3. 重新麻醉与0.0025％MESAB的鱼简要鱼在荧光显微镜下检查。红色荧光是一个彻底的分散注射液的广泛分布的指标。
4. 把鱼放回去的塑料盒。
5. 塑料盒连接到t他循环系统，氧气的鱼和维持更长的时间。
6. 利用鱼的目的，如行为分析或牺牲的动物注射后准备组织标本作进一步分析（组织学染色，免疫组化等 ）所需的时间点。以下引用给成年斑马鱼脑^{:9,11,17-20,24-27}如何分析的例子。最快的时间来观察一个有效的击倒（超过50％击倒）是12小时在我们的研究^22。

6。建议科学控制

1. 使用不匹配吗啉代分子是不应该造成任何表型作为阴性对照。使用一个标准吗啉分子或专门设计吗啉控制每一个感兴趣的基因。此外，使用溶剂（在这种情况下的PBS中），作为进一步的阴性对照，以评估非特异性作用或毒性MISM批次/控制啉注射。
2. 使用PCNA吗啉作为阳性对照先前描述^22。这吗啉导致高效击倒在成年斑马鱼脑（75-95％击倒效率1天之内注射^）22。

结果

脑室微量注射导致注入的解决方案广泛分布

使用图1中描绘的脑室微量注射的工作流程和技术方案，吗啉代寡核苷酸给药到成年斑马鱼的大脑。一个准确的注入协议，将导致整个大脑，高效的目标靠近心室表面（ 图2A）的细胞分散液注入液体。注射玻璃毛细管刺穿的脑组织在注入点的（ 图2B），将有一个致密的荧光信号。如果注入的量是不够的，将观察到微弱的荧光信号（ 图2C）。

可用于基因表达于成年斑马鱼脑心室区域撞倒脑室微量注射

我们已经表明日在体内吗啉代可以穿透几个细胞直径的心室面内，因此可以有效地针对心室肌细胞（ 图3A，3B）。吗啉注射液可以拦截基因表达的，因为它会减轻相应的蛋白质生产（例如增殖细胞核抗原所示， 图3C，图3D）。之前我们已经证实，使用这种技术的基因敲除导致在成人神经（ 图3E，3F）或再生反应（ 图3G，3H）的功能的后果。我们表明，注射后约12小时的吗啉代²²达到高效的拦截范围（超过50％击倒）。我们还观察到，有效的击倒期间，直到约5天注射后的PCNA蛋白^22。超过70％的击倒，直到3天后注射液^22。击倒曲线依赖Øn的水平表达的内源性蛋白和吗啉代分子的效率，还必须确定每一个基因被实验者。在我们的研究中，我们没有看到的CVMI程序危及生存的动物，可能是因为管理啉分子是局部的，不会引起全身中毒。

图1。脑室注射技术的示意图。 （A）注射液是从背视顶盖的水平（OT 2）成年斑马鱼（1）。作一个切口，用30号针（3）光纤顶盖颅骨内板。使用玻璃毛细管，吗啉代分子注入脑室液（4）。一个彻底的分散是一个（E）瞬间长足的进步（5）（B）所示的套管，它的带刺端在高倍率（C）前切口。针的方向（D）的切口圈，由虚线概述。位置如图所示，并进行喷射的喷射毛细管。所有的面板都进行了调整，从文献^22。 点击这里查看大图 。

图2。注入效率和准确性。比较（A）良好的注塑针对靠近心室表面细胞。 （B）如果玻璃毛细管插入进入脑组织，这将产生一个位于中心的荧光信号。 （C ）如果喷射量是低的，这会导致弱的荧光信号。

图3。吗啉代渗透，（A）的效率基因击倒和功能的后果。GFP免疫染色吗啉代注射的Tg（H2A:GFP）转基因品系显示GFP阳性细胞核的控制端脑截面。 （B）绿色荧光蛋白免疫组化染色端脑截面GFP反义吗啉注射TG（H2A:GFP）转基因株系GFP阳性核。注意心室区域的GFP信号的差异。 V:心室。 （C），增殖细胞核抗原免疫组化控制啉注入大脑PCNA阳性细胞广泛分布。 （ D）PCNA免疫组化PCNA反义吗啉注入大脑PCNA阳性细胞显着减少的金额，表示CVMI可以敲除内源性基因。 （E）BrdU和HUC / D免疫组化控制吗啉注入大脑新生神经元前²²后的BrdU脉冲追踪实验来确定。 （F）BrdU和HUC / D免疫组化PCNA反义吗啉注入大脑新生神经元前²²后的BrdU脉冲追踪实验来确定。 （G）敲减PCNA导致新生神经元的产生显着降低，表明CVMI可用于拦截内源性基因，产生功能的后果。所有的面板摘自文献²² 点击此处查看大图 。

讨论

我们在这里描述的方法允许进入成年斑马鱼脑的吗啉的容易和快速的管理。我们已经证明，我们的注射方法有效地阻断基因的表达在心室肌细胞在神经元响应的功能性后果和结果。

有一些重要的点是持谨慎态度，同时执行脑室微量注射。例如，吗啉代分子的效果取决于所使用的浓度。这个浓度将由最终用户。我们建议开始与股票溶液（500微米），并进行系列稀释，最好预先测试注入胚胎，胚胎注射使用标准协议^28-30。以前，我们获得了不同级别的拦截效率吗啉浓度的范围从50微米到500微米^22。其次，节流孔的玻璃毛细管不应该被LARGe作为这将导致广泛的液体注射后涌入大脑。同样，开放必须不能过于狭窄，因为这将防止足够的注塑。人能够确定最佳的节流孔的压力的组合，通过空气泵入与水的陪替氏培养皿。所产生的气泡，应该是在一个单一的行，而不是在多个行。在视频中，我们证明这一点。第三，培育麻醉药的鱼是至关重要的。鱼不应存放时间超过2分钟，在麻醉药。这会妨碍注射后的回收率。第四，切口的位置是关键彻底分散注入的液体。在视顶盖心室区域中线以上大横向越走越窄。因此，实验者应该产生在颅骨缝接近中线，只是尾椎端脑区的颅骨内板覆盖。

脑室注射液的优点之一N（CVMI）方法是其快速性。 CVMI是一种快速的方法，用于测定基因的功能。此功能是重要和有益的，相比一代转基因株系的功能研究，一般需要几个月的时间。此外，CVMI导致注射的液体均匀分布的，因此提供了一个比较彻底的联络注射或电相比，操纵基因的活性。多个基因与CVMI，可以撞倒同时准备注射液混合含有多吗啉代寡核苷酸。 CVMI可用于一个给定的吗啉代寡核苷酸注入不同浓度的，因此可用于亚效等位基因表型分析。最后，这种注射范例不引起毒性或危及动物的生存。

其他类型的研究，如注射的调节肽，药物，质粒DNA或RNA的调节莫可能扩大的CVMI技术，lecules或其他物质有可能影响细胞生理状态的。测定分子组合和表演剂量反应分析是可能使用我们的方法，使学习低表现量的表型。凭借这些特性，CVMI被证明是一个快速简便的检测成年斑马鱼大脑中的表达研究，并开辟了快速筛选和功能分析。

组成的成年斑马鱼的大脑可以产生新的神经元沿整个rostrocaudal轴和外伤后还可以再生。这是哺乳动物的大脑，神经和有限，而如果在所有的再生能力差，形成了鲜明的对比。如此广泛的干细胞活性和休养的能力，使一个有用的模式生物斑马鱼了解分子程序所需的中枢神经系统的再生，这是目前很大程度上是未知的。因此，调查性向泽再生的分子基础brafish大脑是一个有趣的研究领域，这或许可以解释的根本区别，鱼类和哺乳动物的大脑是如何受伤后的反应，同时也赋予再生医学疗法在人类的途径。为了了解脊椎动物大脑的可塑性和再生的分子基础设施作为一个重要的研究领域，神经胶质细胞，因为它们是神经源性祖细胞^3,8,20。因此，使用CVMI技术改变基因的斑马鱼大脑中的放射状胶质细胞的功能是在阐明如何鱼脑情侣祖活动高效的成年神经发生和再生反应。我们最近表明在成年斑马鱼脑^24,26,27再生的神经发生响应的几个因素和信号通路的参与和要求，这些研究未能由使用CVMI方法。总体而言，从斑马鱼大脑中获得的知识，我们可以利用征收REGENErative哺乳动物的神经胶质细胞受伤的反应，从而帮助设计对人类神经系统疾病的临床治疗和急性伤害的能力。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagent/Material
CellTracker Red CMTPX	Life Technologies, Invitrogen	C34552	Use at 1:100 dilution for measuring the injection accuracy
MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate)	Sigma-Aldrich	A5040	For anesthetizing the fish
Petri dishes	Sarstedt	821,472	For handling the fish during injection and imaging
Phosphate-buffered saline	Life Technologies, GIBCO	10010-056	As sterile dilution medium
Vivo morpholinos	Gene Tools Inc.	Customized	More info on vivo morpholinos: www.gene-tools.com
			Equipment
Barbed-end needle	Becton-Dickinson	305178	To generate the incision in the skull
Dissecting microscope	Olympus, Leica, Zeiss	Varies with the manufacturer	Part of the whole injection setup
Dumont Tweezers	World Precision Instruments	501985	To snap off the tip of the glass capillary
Fluorescence camera	Zeiss, Nikon, Leica	Varies with the manufacturer	To visualize the fluorescence after injection
Gillies Dissecting Forceps	World Precision Instruments	501265	To hold the fish in position
Glass injection capillaries	World Precision Instruments	TWF10	For microinjection
PicoNozzle kit (microinjector holder)	World Precision Instruments	5430-12	For microinjection
Pneumatic PicoPump (microinjector)	World Precision Instruments	SYS-PV820	For microinjection
Ring illuminator; Ring Light Guide	Parkland Scientific	ILL-RLG	For illuminating the specimen