提高蛋白质结晶的成功率随机Microseed矩阵筛选

摘要

在这里，我们描述了随机microseed矩阵筛选的一般方法。这种技术被示为显著增加的蛋白质结晶筛选实验的成功率，减少需要优化，并提供晶体的数据收集和配体浸泡实验的可靠供应。

摘要

随机microseed基质筛选（RMMS）是在其中晶种加入到随机屏幕的蛋白质结晶技术。通过增加晶体蛋白质的相图介稳区将增长的可能性，额外的结晶导线通常获得的，​​所产生的晶体的质量可能会增加，并提供晶体数据收集和浸泡实验的良好供应。这里我们描述了可应用于任一坐滴或悬滴蒸气扩散实验中，通过手或使用液体处理机器人，在96孔或24孔盘格式建立RMMS的一般方法。

引言

由佩鲁茨，肯德鲁和同事在确定血红蛋白和肌红蛋白的结构，在结构基因组学财团的现代高通量自动化流水线及其初步应用，大分子X射线晶体学已为我们提供了前所未有的结构性一窥世界的蛋白质。这种技术仍然是最广泛应用的实验方法，允许蛋白质结构的直接可视化在原子，或接近原子分辨率（ 即在1-3的范围内）。一个先决条件被应用到的蛋白质X-射线衍射是，它必须首先被结晶化，这是此阶段中残留的结构确定的一个最大限速步骤由衍射方法^1，2的过程。尽管在我们的理解蛋白质结晶的方法，并且在结晶画面的质量和可用性的重大改进显著进步，托盘，以及相关的技术，但它仍然无法可靠地预测结晶成功³的可能性。生物化学和生物物理方法可用于评估是否感兴趣显示器的蛋白质晶体成核和生长良好的特性， 即它是良好的折叠，均匀的，单分散性等，然而，在没有办法这些见解提供结晶的最终的预测倾向。

播种长期以来一直声称是用于改善的数目，大小，和现有的晶体或结晶材料^4-7的质量的可行方法。这种方法是基于的前提是，支持晶体成核的条件可能不是最优的用于随后的晶体生长，反之亦然。通过将核物质从一种状态到另一种，人们可能试图有效地分离这些过程，以新的，迄今未开发的结晶太空，使访问，并因此增加在筛选试验的总体成功率。建立的方法已被记录为（ⅰ）macroseeding，其全部的单晶从一个状态转移到另一个^{8，（ⅱ）}条纹播种，核材料的转移，通常由定向的压力，例如，用应用程序得到猫的晶须到现有的晶体，然后通过随后的晶须的通路通过一个新的结晶降^9，以及（iii）“经典的”microseeding的表面的晶体“种子”，以收获所产生的传输结晶粉碎物（或结晶性材料），到类似的，产生的种子¹⁰的条件。值得注意的是所有这三种方法都是费时和可扩展性很差，当然在比较什么是可以实现的现代化液体处理机器人技术的结晶。这些因素促成，在一定程度上，至少，在人们认为种子ING是一种方法，只访问时，其他方法都未能见效。

随机矩阵microseeding（RMMS）是最近的创新方法，结合了传统microseeding与高通量筛选和可扩展性^11-13的好处。这种方法依赖于生成器的种子的库存，从核的结晶材料，其可以在一个标准的96条件结晶屏等分入/到每个sub-well/coverslip生产。此方法适用于两个坐或悬滴蒸气扩散实验中，通过手或使用液体处理机器人，在24孔或96孔盘格式建立。 RMMS已经通过实验证实，以显著提高结晶的成功率，并产生更大的衍射质量和数量^11，13，14的晶体，并代表了晶体学家“在邻方法阿森纳一种创新的工具ngoing对结晶成功的努力。在这里，我们描述了用于RMMS的一般方法，并提供采样数据表示该技术的有效性。

研究方案

1。战略思考

1. 的籽晶用于microseeding实验的选择将取决于实验的目的而有所不同。在项目开始的时候是有帮助的找几个结晶命中，可以为水晶优化提供可供选择的出发点。 RMMS大大减少了对晶体优化，因为优质的晶体更容易在相图， 即在该地区，其中在干扰或核系统返回到平衡的稳区种植。因此，我们建议使用RMMS经常只要第一晶体获得（或者更准确的说，只要第一晶体停止生长）。
2. 对于首轮RMMS的，种子股票应尽可能多晶材料尽可能进行。如果只有一个孔是可用的包含晶体，或者如果晶粒是小的，也可能是有帮助的设置的多个重复原始命中（没有播种），以增加结晶的供给。但是，如果几个不同的检索结果得到，晶种可以从几个条件可以收获并混合在一起。
3. 为了避免相分离，在高盐条件下生长的晶体应分别从高PEG条件下生长的晶体收获。如果从多口井的结晶混合，贮存器的解决方案，是不容易得到的盐的晶体应选择种子悬浮液中。例如，应避免使用高浓度的磷酸盐，硫酸盐，钙和镁。
4. 后来在一个项目中，寻找具有不同的单元电池的结晶，以改善衍射，避免孪晶的晶体，得到晶体，适合在结合配体，它可能是很重要的。在该阶段只有最适合的晶体（ 如那些衍射最好）应该被用来使种子的库存。有时重复几轮microseeding都是必需的，其中仅“最佳“晶体是用来使种子股票的后续回合。如果可能的话，一个”中性“沉淀剂，如PEG 3000应该被用来在暂停晶种，以鼓励新的晶体接触和结晶复合物，可能是不稳定的高盐的解决方案^12。
5. 经典microseeding实验中，在一个单一的结晶状态时，常常是有帮助以下的一个有希望的条件，并在随后的优化的鉴定。它往往是必要的稀释种子储备，以获得每一滴水晶体所需的号码。 “组合”microseeding实验（其中一系列的增加摊薄种子储备被添加到一个结晶条件）是一种快速的方法找到种子股票的最佳稀释。下面这种方法进行说明。

2。种子股票的制备

1. 做一个圆形玻璃探头使用本生灯火焰玻璃巴斯德吸管。
   1. 加热靠近中间的吸管，直到它变得柔软，然后迅速从火焰中删除，并把它画出来了拉开两端。旨在拉动玻璃下降到直径小于0.25毫米。
   2. 打破玻璃的地步，它是在0.25毫米和简要投身破碎端插入火焰。重复该步骤直至玻璃与形成于末直径为〜0.75毫米半球。这个探针是用于破碎晶体材料是有用的，因为它是适当的大小，以0.01-1.0毫米刻度撞击固态物体和它不损坏的结晶托盘子阱或盖玻片的塑料表面上。较大的探针（〜1.0毫米）可以更有效地粉碎小晶体，因为晶体的玻璃和塑料之间被困。
2. 将装有冰种珠1.5 ml离心管中。
3. 使用双目显微镜或晶体成像系统检查预先建立结晶托盘，然后选择一个或多个APpropriate从托盘井从中收获的种子储备一代的晶体材料。任何材料都可以使用，包括细的针头，球晶，微晶和不规则，形成不良的结晶。该种子库应尽快之后晶体停止生长做，因为旧的材料更可能是部分交联，从而减少其在播种试验适用性。如有疑问形式存在于结晶材料可以收获是否是盐或蛋白质的井可以用前开口的UV荧光显微镜或成像系统的可视化，或者结晶性材料可以原位 X射线衍射分析来进行在托盘。当使用前一种方法的蛋白质晶体将紫外光照射下发出荧光，盐晶体将会出现无色。
4. 打开选定的结晶盘好。对于96孔坐在通过上胶密封片切割围绕降盘所选以及USIng的手术刀刀片。对于24孔悬滴盘使用镊子取出盖玻片。反转盖玻片，并将其放置在平稳的表面干净。去除50微升的储库溶液和该液体转移到含有种子珠确保管保持在冰上在整个离心管中。
5. 彻底粉碎了晶体中的subwell（96孔盘）或盖玻片（24孔托盘）下降，使用2.1节准备的玻璃探头，观察在显微镜下的结果。小晶体可能需要几分钟才能彻底粉碎。这个步骤允许实验者检查该晶体是易粉碎，因此不交联的，并且还认为它们不是盐晶体。盐晶体产生独特的点击，可以听到和感觉到他们被压碎时。如果晶体是坚韧，不易粉碎试图获得并使用新鲜的材料。
6. 删除5微升从种子珠管和t储液转拨到等效子阱（坐滴实验）或盖玻片（悬滴实验）含有结晶材料被收割。吸取该液体向上和向下的5-6倍，以悬浮尽可​​能多的子井或盖玻片的内容成为可能。返回暂停的种子珠管和重复此步骤两次以上，以确保尽可能多晶材料是收获的可能。
7. 涡流种子珠两分钟，停止每30秒冷却冰管。
8. 做系列稀释，由4至10在每个阶段的一个因素稀释种子库中贮存溶液。通常情况下，使用未稀释的种子的库存，当太多的结晶便可得到，因此使用稀释种子储备，以控制每孔的晶体的数目。在第一轮RMMS的，它不以稀释种子储备溶液是很重要的，因为更大的种子的浓度越结晶命中将获得的。
9. 如果它不被使用immediately，种子股票停牌，并稀释种子储备转移至-20℃，或-80℃冰箱保存。为了避免反复冻融周期，这可能会降低种子库的功效，这种材料存放在体积小等份， 即 10〜20微升。一旦冻结，种子储备可以保持下去，直到需要。

3。建立结晶盘的

1. 根据不同的结晶设施和实验者的喜好的可用性，RMMS结晶检查可以使用任一24孔托盘采用悬滴气相扩散法，或96孔托盘采用坐滴气相扩散法进行。既可以建立手工结晶盘为RMMS，使用液体处理机器人的分配器，或者是两者的组合。
2. 一个典型的RMMS实验设置由专人将包括，1.0μL蛋白溶液，1.0微升结晶状态，0.5微升种子储备。一个典型的实验设置使用结晶机器人将包括，0.3μL蛋白溶液，0.2微升结晶条件，以及0.1微升种子储备。
3. 到在24孔悬滴盘执行RMMS筛选中，首先，使用手动移液管，转移300μl的每个条件的从在10ml单管格式的96孔结晶状态​​屏幕分成4×24孔pregreased结晶每个孔托盘。
   1. 转让1微升来自各300微升储各结晶状态到相应塑料盖玻片从正面和背面保护背衬条被去除的表面上。
   2. 到1微升的每个结晶条件加1微升的蛋白质溶液，然后用0.5微升的晶种股票。反转每个盖玻片，使得液体的下降是朝下的和上面的适当的井的位置。
   3. 按下向下的​​盖玻片，压缩seali纳克油脂，形成一个安全的密封。一旦所有96滴的建立，托盘应转移到孵化器或恒温室，其范围通常为4-18℃下储存。
4. 在96孔坐滴盘首先传输20-50微升的每个条件的从在深井块格式的96孔结晶状态​​屏幕到结晶托盘的每个相应的井进行RMMS筛选。这个转印步骤可使用一个机器人结晶，或通过手动传输使用8道移液器进行。
   1. 转移储层，蛋白质和种子储备溶液至滴用手或用在3.1中详述的体积的机器人。一些市售的结晶机器人不接触的分配，以及使用这样的系统中进行种子库存转移可能会导致分注器或相关联的管道的阻塞。分配的顺序是可变的：一些机器人同时免除所有的解决方案。如果这是不可能的，首先免除的蛋白质，那么水库，然后种子储备。
   2. 如果一个接触点胶机器人不可转让使用配有钝针的低容积的玻璃注射器的种子。通过传递它通过储液再分发种子股票进入每一滴冲洗针头。
   3. 使用透明密封片密封托盘并转移到孵化器或恒温室进行存储。

4。结晶盘的检查

1. 想象使用一个双目显微镜或晶体成像系统中的所有结晶实验。前者通常能提供使用者更好地控制深度图和放大的程度大于后者，但更耗费时间。
2. 检查每个sub-well/coverslip顺序和记录晶体形成的任何证据。实验应检查一次，每24小时5天以下，并成立了Ñ​​随后连用7天为4周。
3. 经常需要RMMS的多次循环优化衍射级晶体产生之前。

结果

一个RMMS实验（A）示例

以证明RMMS筛查的有效性，我们应用此方法到的鸡蛋白溶菌酶（HEWL）和牛肝脏过氧化氢酶（BLC）的结晶。这两个酶是突出的结晶和结构上良好表征的目标^15，16。这样既提供出色的考试科目，用以说明增强结晶成功率可达到与RMMS。结晶实验是建立于96孔用液体处理机器人坐滴盘的格式。 HEWL和BLC的溶液通过分别在20mM的Tris-HCl，150mM的氯化钠，pH值7.5，?...

讨论

在本文中，我们描述了RMMS蛋白质结晶筛选的一般方法。使用两个测试蛋白质一个显著增强的结晶成功率用这种方法我们已经证明。使用使用RMMS和非RMMS方法产生的结晶的一个子集的同步加速器辐射衍射分析表明使用任一方法生长，虽然以前的作者已报道，良好品质的晶体更容易在RMMS实验¹¹生长晶体间偏差小衍射质量^{， 13。} HEWL和背光补偿可能给非典型的结果，因为他们特别容易结?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
MRC 96 well crystallization trays	Molecular Dimensions Ltd	MD11-00-100	Non-UV compatible, for screens established by robot
ClearView sealing sheets	Molecular Dimensions Ltd	MD6-01S
Hen egg white lyzozyme	Sigma-Aldrich	L6876	~95% purity
Bovine liver catylase	Sigma-Aldrich	C9322	>95% purity
Xylanase	Hampton Research	HR7-104
Thaumatin from Thaumatococcus daniellii	Sigma-Aldrich	T7630
Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko	Sigma-Aldrich	P1512
JCSG-plus HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-40	For screens established by robot
PACT premier HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-36	For screens established by robot
Morpheus HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-47	For screens established by robot
Crystal Ph–nix liquid handling system	Art Robbins Instruments	602-0001-10
Seed bead kit	Hampton Research	HR2-320
Binocular stereo microscope	Leica	M165C
Scalpel blades	Sigma-Aldrich	S2646-100EA
ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette	Starlab	S7100-0125
ErgoOne 2-20 μl pipette	Starlab	S7100-0221
ErgoOne 100-1000 μl pipette	Starlab	S7100-1000
JCSG-plus screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-37	For screens established by hand
PACT premier screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-29	For screens established by hand
Morpheus screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-46	For screens established by hand
Tweezers	Sigma-Aldrich	T5415-1EA
CrystalClene coverslips 18 mm	Molecular Dimensions Ltd	MD4-17
2 ml glass Pasteur pipettes	Sigma-Aldrich	Z722669
Vortex mixer	Fisher Scientific	02-215-360
24 well XRL crystallization tray	Molecular Dimensions Limited	MD3-11	For screens established by hand
30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5
20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5
20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0