Verbesserung der Erfolgsrate der Proteinkristallisation nach Zufall Microseed Matrix Screening

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ein allgemeines Verfahren für zufällige microseed Matrix-Screening. Diese Technik wird gezeigt, dass die Erfolgsrate der Proteinkristallisation Screening-Experimenten deutlich erhöhen, reduzieren die Notwendigkeit für Optimierung, und bieten eine zuverlässige Versorgung von Kristallen für die Datenerhebung und-Ligand-Einweichen Experimenten.

Zusammenfassung

Zufalls microseed Matrix-Screening (RMM) ist ein Protein, in dem Kristallisationstechnik Impfkristalle zufällige Bildschirme aufgenommen. Durch die Erhöhung der Wahrscheinlichkeit, dass die Kristalle in der metastabilen Zone Phasendiagramm eines Proteins wachsen, werden zusätzliche Kristallisation führt oft erhalten, die Qualität der Kristalle hergestellt werden, können erhöht werden, und eine gute Versorgung der Kristalle für die Datensammlung und Einweichen Experimente ist. Hier beschreiben wir eine allgemeine Methode zur Risikomanagementmaßnahmen, die entweder im Sitzen Drop oder hängenden Tropfen Dampfdiffusionsexperimente, entweder von Hand oder mit Liquid-Handling-Robotik, in 96-Well-oder 24-Well-Format etabliert Fach angewandt werden können.

Einleitung

Aus der erstmaligen Anwendung von Perutz, Kendrew und Mitarbeiter bei der Bestimmung der Strukturen von Hämoglobin und Myoglobin, zu den modernen automatisierten Hochdurchsatz-Rohrleitungen der strukturelle Genomik Konsortien hat makromolekularen Röntgenkristallographie uns einen beispiellosen Einblick in die strukturelle Protein-Welt gewährt . Diese Technik bleibt die weithin für experimentelle Methode, die die direkte Visualisierung von Proteinstrukturen auf atomarer erlaubt oder in der Nähe atomarer Auflösung (dh in der 3.1 Å-Bereich). Eine Voraussetzung für die Röntgenbeugung an ein Protein angewendet werden, ist, dass es zunächst kristallisiert werden, und es ist diese Stufe des Verfahrens, die die größte einzelne geschwindigkeitsbestimmende Schritt bei der Strukturaufklärung von Beugungsmethoden ^{1, 2} bleibt. Trotz erheblicher Fortschritte in unserem Verständnis des Prozesses der Proteinkristallisation, und die wichtigsten Verbesserungen in der Qualität und Verfügbarkeit der Kristallisation Bildschirme,Tabletts, und verwandte Technologien bleibt es unmöglich, die Wahrscheinlichkeit des Erfolgs Kristallisations ³ zuverlässig vorhersagen. Biochemische und biophysikalische Methoden angewendet werden, um zu beurteilen, ob ein Protein von Interesse zeigt günstige Eigenschaften für die Kristallkeimbildung und Wachstum, ist also gut gefaltet, homogen, monodisperse etc. werden jedoch diese Erkenntnisse in keiner Weise eine definitive Prädiktor Kristallisations Neigung.

Seeding ist schon lange behauptet worden, um eine praktikable Methode zur Verbesserung der Anzahl, Größe und Qualität der vorhandenen Kristalle oder kristallines Material ^4-7 sein. Dieser Ansatz basiert auf der Prämisse, dass ein Zustand, der Kristallkeimbildung unterstützt möglicherweise nicht optimal für die anschließende Kristallwachstum und umgekehrt basiert. Durch die Übertragung von kernhaltigen Material von einem Zustand zum anderen, kann man versuchen, diese Prozesse effektiv zu entkoppeln und damit den Zugang zu neuen, noch unerforschten Raum Kristallisation,und als Ergebnis eine Erhöhung der Gesamterfolgsrate eines Screening-Experiment. Etablierte Methoden (i) macroseeding, die Übertragung eines Einkristalls in ihrer Gesamtheit von einem Zustand zu einem anderen ^8, (ii) Animpfen Streifen, die Übertragung von kernhaltigen Material, in der Regel durch die Anwendung von gerichteten Druck unter Verwendung beispielsweise erhalten dokumentiert ein Whisker auf der Oberfläche eines vorhandenen Kristall, gefolgt von der anschließenden Passage des Whiskers mit einem neuen Kristallisationstropfen ^9, und (iii) "klassische" microseeding die Übertragung von Kristall "Keime" von Ernte erzeugten zerkleinerten Kristalle (oder kristallinen Material), in die Bedingungen, ähnlich denen, die den Samen ¹⁰ ergab. Insbesondere alle drei dieser Methoden sind zeitaufwendig und schlecht skalierbar, sicher im Vergleich zu dem, was erreichbar ist mit modernen Liquid Handling Kristallisation Robotik. Diese Faktoren haben dazu beigetragen, auf einer bestimmten Ebene zumindest auf die Wahrnehmung, dass die Saatguting ist eine Methode, um nur besucht, wenn andere Ansätze haben es versäumt, Früchte tragen werden.

Zufallsmatrix microseeding (RMM) ist eine neue methodische Innovation, die die Vorteile der traditionellen microseeding mit denen von Hochdurchsatz-Screening und Skalierbarkeit ^11-13 verbindet. Dieser Ansatz beruht auf der Erzeugung eines Saatgut, aus kernhaltigen kristallinen Materials, die in / auf jeden sub-well/coverslip innerhalb eines Standard-96-Zustand Kristallisation Bildschirm aliquotiert werden können, hergestellt. Dieses Verfahren ist sowohl im Sitzen oder hängenden Tropfen Dampfdiffusionsexperimente, entweder von Hand oder mit Liquid-Handling-Robotik, in 24-Well-oder 96-Well-Format Fach etabliert. RMM wurde experimentell nachgewiesen, dass die Kristallisation Erfolgsquote deutlich zu erhöhen, und produzieren Kristalle von mehr Beugungs Qualität und Quantität ^{11, 13, 14,} und stellt ein innovatives Instrument in der Kristallographen "Arsenal der Ansätze in der oLaufende Anstrengungen zur Kristallisation Erfolg. Hier beschreiben wir ein allgemeines Verfahren zur RMM und Probendaten bereitzustellen, die die Wirksamkeit dieser Technik.

Protokoll

1. Strategische Überlegungen

1. Die Wahl der Samenkristalle für microseeding Versuchen verwendet werden, je nach dem Ziel des Experiments variieren. Zu Beginn eines Projektes ist es hilfreich, mehrere Kristallisations Hits, die alternative Startpunkte für Kristall-Optimierung bieten kann. RMM reduziert die Notwendigkeit für kristall Optimierung weil gute Qualität Kristalle sind eher in der metastabilen Zone des Phasendiagramms, also in dem Bereich, wo folgende Störung oder Keimbildung kehrt das System ins Gleichgewicht zu wachsen. Wir schlagen daher vor, mit RMM routinemäßig, sobald die ersten Kristalle erhalten (oder, genauer gesagt, sobald die ersten Kristalle aufhören zu wachsen).
2. Für die erste Runde der RMM sollte ein Saatgut mit so viel kristallines Material wie möglich gemacht werden. Ist nur ein gut verfügbar ist, enthält Kristalle, oder wenn die Kristalle klein sind, kann es hilfreich sein, mehrere Wiederholungen der EinrichtungOriginal-Hit (ohne Aussaat), um die Versorgung von Kristallen zu erhöhen. Wenn jedoch mehrere Zugriffe erhalten werden, können Impfkristalle von mehreren Bedingungen geerntet und miteinander vermischt werden.
3. Um eine Phasentrennung zu vermeiden, sollte Kristalle in Hochsalzbedingungen gezüchtet getrennt von Kristallen in hoher PEG Bedingungen gezüchtet geerntet werden. Wenn Kristalle aus mehreren Brunnen gemischt werden, sollte ein Reservoir-Lösung, die weniger wahrscheinlich, dass Salzkristalle geben, ist für die Keimsuspension ausgewählt werden. Zum Beispiel sollten hohe Konzentrationen von Phosphat, Sulfat, Calcium und Magnesium vermieden werden.
4. Später in einem Projekt kann es wichtig sein, für Kristalle mit unterschiedlichen Einheitszellen, um die Beugung zu verbessern, vermeiden Zwillingskristallen und Kristalle, die für die Bindung Liganden zu erhalten suchen. In dieser Phase nur die am besten geeigneten Kristalle (z. B. solche, die am besten zu beugen) verwendet, um den Samen Lager zu machen. Manchmal wiederholt Runden microseeding erforderlich sind, in denen nur die "beste"Kristalle werden verwendet, um das Saatgut für die nachfolgende Runde zu machen. Wenn möglich, ein" neutral "Fällmittel wie PEG 3000 verwendet, um die Keimkristallen im Suspend werden, um neue Kristall Kontakte zu fördern und Komplexe, die in instabilen hoch sein kann kristallisieren ^{12-Salzlösungen.}
5. Klassische microseeding Experimente, in denen eine einzige Kristallisationsbedingung verwendet wird, sind oft hilfreich, nach der Identifizierung von einem vielversprechenden Zustand und bei der anschließenden Optimierung. Oft ist es notwendig, das Saatgut, um die gewünschte Anzahl der Kristalle pro Tropfen zu verdünnen. A "kombinatorischen" microseeding Versuch (wo eine Reihe von Saatgut von zunehmender Verdünnung zu einer Kristallisationsbedingung hinzugefügt) ist eine schnelle Methode für die Suche nach der optimalen Verdünnung des Saatguts. Diese Vorgehensweise wird nachfolgend beschrieben.

2. Vorbereitung der Seed Lizenz

1. Stellen Sie eine abgerundete Glassonde von einer Glaspasteurpipette mit einer Bunsenflamme.
   1. Erhitzen Sie die Pipette in der Mitte, bis es weich wird, dann schnell entfernen Sie sie aus der Flamme und ziehen Sie es durch Auseinanderziehen der Enden. Ziel ist es, das Glas bis zu einem Durchmesser unter 0,25 mm zu ziehen.
   2. Zerstöre die Glasscheibe an der Stelle, wo es um 0,25 mm und kurz eintauchen, die zerbrochenen Ende in die Flamme. Wiederholen, bis eine Halbkugel aus Glas mit einem Durchmesser von ca. 0,75 mm ist an dem Ende ausgebildet ist. Diese Sonde ist nützlich für die Zerkleinerung von kristallinem Material, wie es geeigneter Größe für markante feste Objekte auf dem 0,01-1,0 mm-Skala und es nicht die Kunststoffoberfläche eines Kristallisationsschale oder auch Unterdeckglas beschädigen. Größere Sonden (~ 1,0 mm) können kleine Kristalle effektiver zu vernichten, weil die Kristalle werden zwischen Glas und Kunststoff gefangen.
2. Legen Sie eine 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Rocaille auf Eis.
3. Prüfen Sie einen vorher festgelegten Kristallisationsschale mit einem Binokular oder Kristall-Imaging-System, und wählen Sie eine oder mehrere apsprech Brunnen aus dem Fach, aus dem kristallinen Material für Saatgut Generation ernten. Jedes Material kann verwendet werden, einschließlich feinen Nadeln, Sphärolite, Mikrokristalle und unregelmäßig, schlecht gebildeten Kristalle werden. Das Saatgut sollte so bald wie möglich, nachdem die Kristalle aufhören zu wachsen gemacht werden, da ältere Material ist wahrscheinlich teilweise vernetzt, damit ihre Eignung für den Einsatz in Experimenten Aussaat verringert. Wenn irgendein Zweifel, ob das kristalline Material geerntet werden Salz oder das Protein kann auch unter Verwendung einer UV-Fluoreszenzmikroskop oder Abbildungssystems vor der Öffnung sichtbar gemacht werden, oder das kristalline Material kann in-situ Röntgenbeugungsanalyse unterzogen werden, besteht in das Fach. Bei der Nutzung der ehemaligen Ansatz Proteinkristallen wird unter UV-Bestrahlung fluoreszieren, werden Salzkristalle farblos erscheinen.
4. Und Öffnen des ausgewählten Kristallisationsschale. Für 96-Well-Schalen sitzen Abfall durch die obere Kunststoffdichtungsbahn herum schneiden die gut ausgewählten using eine Skalpellklinge. Für 24-Well-Schalen entfernen hängenden Tropfen das Deckglas mit einer Pinzette. Kehren Sie die Deckglas und legen Sie es auf eine stabile saubere Oberfläche. Entfernen Sie 50 ul der Reservoirlösung und übertragen diese Flüssigkeit in die Mikrozentrifugenröhrchen, das die Seed Bead sicherzustellen, dass das Rohr bleibt auf Eis ganz.
5. Die Kristalle gründlich zerschlagen in der subwell (96-Well-Fach) oder Deckglas (24-Well-Fach) fällt, mit der Glassonde in Abschnitt 2.1 vorbereitet, Anzeige der Ergebnisse unter dem Mikroskop. Kleine Kristalle kann mehrere Minuten dauern, um gründlich zu vernichten. Dieser Schritt ermöglicht es dem Experimentator, um zu überprüfen, dass die Kristalle sind einfach zu zerquetschen und werden daher nicht vernetzt ist, und auch, dass sie nicht Salzkristalle. Salzkristalle erzeugen eine unverwechselbare Klick, gehört und gefühlt, wenn sie zerkleinert werden kann. Wenn die Kristalle sind hart und schwer zu zerschlagen versuchen zu frischer Material zu erhalten und zu nutzen.
6. Entfernen 5 ul der Reservoirlösung aus dem Seed Bead Rohr und transfer in die entsprechende Unter gut (sitzend Tropfenexperiment) oder Deckglas (hängenden Tropfen-Experiment) mit dem kristallinen Material, geerntet werden. Pipettieren dieser Flüssigkeit nach oben und unten 5-6 mal so viel von den Unter gut oder Deck Inhalt wie möglich zu resuspendieren. Bringen Sie die Suspension auf die Seed Bead Rohr und noch zweimal wiederholen Sie diesen Schritt, um sicherzustellen, dass so viel kristallines Material wie möglich geerntet.
7. Mischen Sie den Seed Bead für zwei Minuten stoppen alle 30 Sekunden, um das Rohr auf Eis kühlen.
8. Machen Sie eine Verdünnungsreihe, Verdünnen der Saatgut in Reservoirlösung um den Faktor 4 bis 10 in jeder Phase. Typischerweise werden zu viele Kristalle bei Verwendung eines unverdünnten Saatgut erhalten werden, so verwenden Sie die verdünnt Saatgut, um die Anzahl der Kristalle pro gut steuern. In der ersten Runde der RMM, ist es wichtig, nicht die Saatgut Lösung zu verdünnen, denn je größer die Konzentration der Samen die Kristallisation mehr Treffer erhalten wird.
9. Wenn sie nicht sofort verwendet werden, umLICH, übertragen Sie die Samen Stoffsuspension und die verdünnte Saatgut zu einer -20 ° C oder -80 ° C-Gefrierschrank für die Lagerung. Um wiederholte Frost-Tau-Zyklen zu verhindern, die die Wirksamkeit des Saatguts reduzieren kann, dieses Material lagern in kleinen Volumen Aliquots, dh 10-20 ul. Einmal gefroren, kann Saatgut auf unbestimmte Zeit, bis sie benötigt gehalten werden.

3. Gründung der Kristallisation Trays

1. Je nach Verfügbarkeit von Kristallisationsanlagen und den Präferenzen des Experimentators kann RMM Kristallisation Screening durchgeführt, entweder mit 24-Loch-Schalen Verwendung des hängenden Tropfen Dampfdiffusionsverfahren, oder 96-Well-Platten mit den sitzenden Tropfen Dampfdiffusionsverfahren werden. Kristallisationsschalen für RMM kann entweder von Hand hergestellt werden, unter Verwendung eines Roboter-Flüssigkeitshandhabungsautomat, oder eine Kombination der beiden.
2. Ein typisches Experiment Rmms von Hand eingestellt werden umfassen 1,0 ul Proteinlösung, 1,0 ul Kristallisationszustand und0,5 ul Saatguts. Ein typisches Experiment unter Verwendung eines Kristallisationsroboter gesetzt wird umfassen 0,3 ul Proteinlösung, 0,2 ul Kristallisationszustand und 0,1 ul Saatguts.
3. Um RMM-Screening in 24-Well-Schalen hängenden Tropfen durchzuführen, zum einen mit einem manuellen Pipette 300 ul jeder Zustand von einem 96-Loch-Zustand Kristallisation Bildschirm in 10 ml Einzelrohr-Format in jede Vertiefung der 4 x 24-Loch-vorbefettet Kristallisation Tabletts.
   1. Übertragung 1 ul jeder Kristallisationszustand von jedem 300 ul Behälter auf der Oberfläche einer entsprechenden Kunststoffdeckglas von der beide vorderen und hinteren Schutzverstärkungsstreifen wurden entfernt.
   2. Zu den 1 ul jeder Kristallisationsbedingung hinzufügen 1 ul der Proteinlösung, gefolgt von 0,5 ul von Kristall Saatguts. Invertieren jedes Deckglas, so daß die Tropfen der Flüssigkeit nach unten ausgerichtet und Position über die entsprechende Vertiefung.
   3. Drücken Sie unten auf dem Deckglas, Komprimieren der sealing Fett und eine sichere Abdichtung zu bilden. Sobald alle 96 Tropfen geschaffen werden, sollten das Fach in einen Inkubator oder Raum mit konstanter Temperatur üblicherweise im Bereich von 4 bis 18 ° C zur Lagerung überführt werden.
4. Um RMM-Screening in 96-Well-Schalen sitzen Tropfen zunächst über 20-50 ul jeder Zustand von einem 96-Loch-Zustand Kristallisation Bildschirm in Deep-Well-Block-Format in jede Vertiefung entsprechend der Kristallisationsschale durchzuführen. Dieser Übertragungsschritt kann entweder unter Verwendung eines Kristallisations Roboter oder durch manuelle Übertragung unter Verwendung eines 8-Kanal-Pipette werden.
   1. Über Reservoir, Protein-und Saatgut-Lösungen für den Tropfen mit der Hand oder mit einem Roboter unter Verwendung der in 3.1 aufgeführten Bände. Einige im Handel erhältliche Kristallisationsroboter kontaktieren Sie nicht verzichten und leistungs Saatgut Transfer mit einem solchen System kann in Blockade der Abgabespitzen oder zugehörigen Schläuche führen. Die Reihenfolge der Ausgabe ist unterschiedlich: einige Roboter verzichten alle Lösungen gleichzeitig. Wenndies nicht möglich ist, verzichten Protein, dann Reservoir, dann säen Lager.
   2. Wenn ein Kontakt Abgabe Roboter nicht verfügbaren Übertragungs die Samen mit einer niedrigen Lautstärke Glasspritze mit einer stumpfen Nadel ausgestattet. Spülen Sie die Nadel, indem es durch die Reservoirlösung dann verzichten die Saatgut in jedem Tropfen.
   3. Verschließen Sie das Fach mit einem transparenten Dichtungsbahn und Transfer zu einem Inkubator oder Raum mit konstanter Temperatur für die Lagerung.

4. Inspektion der Kristallisation Trays

1. Visualisieren Sie alle Kristallisationsversuche entweder mit einem Binokular oder ein Kristall-Imaging-System. Sie im allgemeinen hat der Benutzer eine größere Kontrolle über Ansicht Tiefe und der Grad der Vergrößerung als die letztere, ist aber zeitaufwendig.
2. Überprüfen Sie jeden sub-well/coverslip in Folge und aufzeichnen Anzeichen von Kristallbildung. Experimente sollten einmal alle 24 Stunden für 5 Tage nach der Gründung und inspiziert werden dien anschließend einmal alle 7 Tage für bis zu 4 Wochen.
3. Mehrere Zyklen von Risikomanagementmaßnahmen sind oft erforderlich, bis die optimale Beugungs Qualität Kristalle hergestellt werden.

Ergebnisse

(A) Beispiel für ein Experiment Rmms

Um die Wirksamkeit der RMM-Screening zeigen wir diese Methode angewandt, um die Kristallisation von Hühnereiweiß-Lysozym (HEWL) und Rinderleber-Katalase (BLC). Beide Enzyme sind hervorragend kristallisierbarem und strukturell gut charakterisiert Ziele ^{15, 16.} Als solche bieten beide ausgezeichnete Testpersonen, mit denen die Erfolgsquote verbesserte Kristallisations erreichbar mit RMM illustrieren. Es wurden Experimente in 96-Well-Sitting Drop ...

Diskussion

In diesem Papier haben wir eine allgemeine Methode zur Proteinkristallisation Rmms Screening beschrieben. Wir haben mit zwei Testproteine ​​eine signifikante Verbesserung bei der Kristallisation Erfolgsrate dieser Methode demonstriert. Beugungsanalyse mit Synchrotronstrahlung einer Teilmenge der Kristalle, die unter Verwendung RMM und nicht-Rmms Methoden zeigte wenig Veränderung in der Qualität zwischen Beugungs Kristalle gewachsen mit beiden Methoden, obwohl früheren Autoren haben berichtet, dass gute Qualität ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
MRC 96 well crystallization trays	Molecular Dimensions Ltd	MD11-00-100	Non-UV compatible, for screens established by robot
ClearView sealing sheets	Molecular Dimensions Ltd	MD6-01S
Hen egg white lyzozyme	Sigma-Aldrich	L6876	~95% purity
Bovine liver catylase	Sigma-Aldrich	C9322	>95% purity
Xylanase	Hampton Research	HR7-104
Thaumatin from Thaumatococcus daniellii	Sigma-Aldrich	T7630
Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko	Sigma-Aldrich	P1512
JCSG-plus HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-40	For screens established by robot
PACT premier HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-36	For screens established by robot
Morpheus HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-47	For screens established by robot
Crystal Ph–nix liquid handling system	Art Robbins Instruments	602-0001-10
Seed bead kit	Hampton Research	HR2-320
Binocular stereo microscope	Leica	M165C
Scalpel blades	Sigma-Aldrich	S2646-100EA
ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette	Starlab	S7100-0125
ErgoOne 2-20 μl pipette	Starlab	S7100-0221
ErgoOne 100-1000 μl pipette	Starlab	S7100-1000
JCSG-plus screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-37	For screens established by hand
PACT premier screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-29	For screens established by hand
Morpheus screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-46	For screens established by hand
Tweezers	Sigma-Aldrich	T5415-1EA
CrystalClene coverslips 18 mm	Molecular Dimensions Ltd	MD4-17
2 ml glass Pasteur pipettes	Sigma-Aldrich	Z722669
Vortex mixer	Fisher Scientific	02-215-360
24 well XRL crystallization tray	Molecular Dimensions Limited	MD3-11	For screens established by hand
30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5
20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5
20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0