Melhorar a taxa de sucesso de cristalização de proteínas pela Random Microseed Matrix Screening

Resumo

Aqui nós descrevemos um método geral para triagem aleatória matriz microseed. Esta técnica é mostrado para aumentar significativamente a taxa de sucesso de proteína de cristalização experimentos de triagem, reduzir a necessidade de otimização, e fornecer um suprimento confiável de cristais para a coleta de dados e experimentos ligante de imersão.

Resumo

Rastreio aleatório matriz microseed (MGR) é uma técnica de cristalização de proteínas, em que os cristais de semente são adicionados às telas aleatórios. Ao aumentar a probabilidade de que os cristais vai crescer na zona metaestável do diagrama de fases de uma proteína, leva cristalização extras são muitas vezes obtidos, a qualidade dos cristais produzidos poderá ser aumentado, e uma boa oferta de cristais para coleta de dados e experiências de imersão é fornecido. Aqui nós descrevemos um método geral para MGR que podem ser aplicadas a qualquer sentados gota ou pendurados experimentos de difusão de vapor de queda, criada à mão ou usando a robótica de manipulação de líquidos, em 96 poços ou formato de tabuleiro de 24 poços.

Introdução

A partir de sua aplicação inicial por Perutz, Kendrew e colegas de trabalho na determinação das estruturas de hemoglobina e mioglobina, aos alto rendimento modernos pipelines automatizados da genômica estrutural consórcios, macromolecular cristalografia de raios-X nos proporcionou uma visão estrutural sem precedentes no mundo da proteína . Esta técnica continua sendo o método experimental mais amplamente aplicável, que permite a visualização direta da estrutura da proteína em atômica, ou perto de resolução atômica (ou seja, no intervalo a 1-3). Um pré-requisito para a difracção de raios-X para ser aplicado a uma proteína é que ele deve primeiro ser cristalizado, e é esta fase do processo, que continua a ser o maior única etapa limitante da velocidade na determinação da estrutura por meio de métodos de difracção de ^{1, 2.} Apesar dos avanços significativos em nossa compreensão do processo de cristalização de proteínas, e grandes melhorias na qualidade e disponibilidade de telas de cristalização,bandejas, e tecnologias relacionadas, permanece impossível prever com segurança a probabilidade de sucesso de cristalização ^3. Métodos bioquímicos e biofísicos pode ser aplicado para avaliar se uma proteína de interesse apresenta características favoráveis ​​para a nucleação e crescimento de cristais, ou seja, é bem dobrada, homogêneo, monodispersa, etc, no entanto, essas idéias de forma alguma fornecer uma previsão definitiva de cristalização propensão.

Sementeira tem sido suposto ser um método viável para aumentar o número, o tamanho e a qualidade dos cristais existentes ou material cristalino ^4-7. Esta abordagem é baseada na premissa de que uma condição que suporta nucleação de cristais pode não ser ideal para o crescimento de cristais posterior e vice-versa. Por transferência de material nucleadas de uma condição para outra, pode-se tentar separar efetivamente esses processos, dando assim acesso, espaço novo cristalização ainda tão pouco explorado,e, como resultado do aumento da taxa de sucesso total de uma experiência de rastreio. Métodos estabelecidos foram documentadas para (i) macroseeding, a transferência de um único cristal na sua totalidade a partir de um estado para outro ^8, (ii) sequência de semeadura, a transferência de material em núcleos, geralmente obtidos através da aplicação de pressão, por exemplo, usando direccional suiça de um gato para a superfície de um cristal existente, seguido pela passagem subsequente do suiça através de uma nova gota cristalização ^9, e (iii) microdispersão "clássica", a transferência de cristais "sementes", gerados pela colheita esmagado cristais (ou cristalino material), em condições semelhantes às que produziram as sementes ^10. Notavelmente todos esses três métodos são demorados e pouco escalável, certamente em comparação com o que é possível com modernos robótica cristalização manipulação de líquidos. Esses fatores têm contribuído, em algum nível, pelo menos, para a percepção de que as sementesing é um método único para ser visitado quando outras abordagens falharam a dar frutos.

Aleatório matriz microdispersão (MGR) é uma inovação metodológica recente que combina os benefícios da microdispersão tradicional com os de rastreio de alto rendimento e escalabilidade ^11-13. Esta abordagem baseia-se na geração de um stock de sementes, produzido a partir de material cristalino nucleada, que podem ser divididas em alíquotas para / em cada sub-well/coverslip dentro de uma tela de cristalização de 96 condição padrão. Este método é aplicável tanto sentado ou pendurado experimentos de difusão de vapor de queda, criada à mão ou usando a robótica de manipulação de líquidos, em 24 poços ou formato de tabuleiro de 96 poços. MGR foi demonstrada experimentalmente para aumentar significativamente a taxa de sucesso de cristalização, e produzir cristais de melhor qualidade e maior quantidade de ^{11, 13, 14} de difracção, e representa uma ferramenta inovadora no arsenal dos cristalógrafos de abordagens no oNgoing esforço para o sucesso de cristalização. Aqui nós descrevemos um método geral para MGR e fornecer dados de exemplo que ilustram a eficácia desta técnica.

Protocolo

1. Considerações Estratégicas

1. A escolha de uma semente de cristais utilizados para experiências microdispersão irá variar, dependendo do objetivo do ensaio. No início de um projeto é útil para encontrar vários hits de cristalização que podem fornecer pontos de partida alternativos para otimização de cristal. MGR reduz significativamente a necessidade de otimização de cristal porque cristais de boa qualidade são mais propensos a crescer na zona metaestável do diagrama de fases, ou seja, na região onde seguinte perturbação ou nucleação o sistema retorna ao equilíbrio. Assim, sugerimos usar Rmms rotineiramente assim que os primeiros cristais são obtidos (ou, mais precisamente, logo que os primeiros cristais parar de crescer).
2. Para a rodada inicial de MGR, um estoque de sementes deve ser feita com o máximo de material cristalino possível. Se apenas um poço está disponível que contém cristais, ou se os cristais são pequenos, pode ser útil para definir múltiplas repetições dohit original (sem semeadura) para aumentar a oferta de cristais. Se, no entanto, vários acessos diferentes são obtidos, os cristais de semente podem ser colhidas a partir de várias condições e misturados em conjunto.
3. Para evitar a separação de fase, os cristais crescidos em condições de alto sal devem ser colhidas separadamente dos cristais crescidos em condições de alta PEG. Se os cristais de vários poços são misturados, uma solução de reserva que é menos susceptível de dar origem a cristais de sal deve ser seleccionada para a suspensão de sementes. Por exemplo, a altas concentrações de fosfato, sulfato, cálcio e magnésio deve ser evitada.
4. Mais tarde, num projecto, pode ser importante procurar cristais com células unitárias diferentes, a fim de melhorar a difracção, evitar cristais geminados, e obter cristais que são adequados para ligandos de ligação. Nesta fase, apenas os cristais mais adequadas (por exemplo, aqueles que difractam melhor) deve ser utilizado para fazer o material de sementes. Às vezes, são necessárias repetidas rodadas de microdispersão, onde apenas o "melhor"Cristais são usados ​​para fazer o material de semente para o ciclo subsequente. Se possível, um" agente precipitante neutros "tais como o PEG 3000 deve ser usado para suspender os cristais de semente para encorajar novos contactos de cristais e cristalização de complexos que podem ser instáveis ​​em alta soluções ^salinas-12.
5. Experimentos microdispersão clássicos, onde uma condição única cristalização é usado, muitas vezes são úteis após a identificação de uma condição promissora e durante a otimização subseqüente. Muitas vezes, é necessário diluir o estoque de semente de forma a obter o número desejado de cristais por gota. A "combinatória" experimento microdispersão (onde uma série de estirpes de crescente diluição são adicionados a uma condição de cristalização) é um método rápido para encontrar a diluição ideal do estoque de sementes. Esta abordagem é descrita abaixo.

2. Preparação de semente da Bolsa

1. Faça uma sonda de vidro arredondado de uma pipeta Pasteur de vidro usando uma chama de Bunsen.
   1. Aqueça a pipeta perto do meio até que se torne macio, em seguida, removê-lo rapidamente da chama e retirá-la, puxando para além das extremidades. Destinam-se a puxar o copo de diâmetro inferior a 0,25 mm.
   2. Quebre o vidro no ponto onde ela é de cerca de 0,25 milímetros e brevemente mergulhar o final arrombado a chama. Repetir este procedimento até um hemisfério de vidro com um diâmetro de 0,75 milímetros ~ é formada na extremidade. Esta sonda é útil para esmagar material cristalino, uma vez que está devidamente dimensionada para golpear objetos sólidos na escala de 0,01-1,0 mm e não danificar a superfície de plástico de uma cristalização bandeja sub-bem ou lamela. Sondas maiores (~ 1,0 mm) pode esmagar pequenos cristais de forma mais eficaz porque os cristais são presos entre o vidro e plástico.
2. Coloque um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, contendo uma semente de grânulo de gelo.
3. Inspecione a bandeja cristalização pré-estabelecida, utilizando um microscópio binocular ou sistema de imagem de cristal e selecione uma ou mais apquada poços da bandeja a partir da qual colhem material cristalino para geração de estoque de sementes. Qualquer material pode ser utilizado, incluindo as agulhas finas, esferulites, microcristais e irregulares, cristais mal formados. O estoque de sementes deve ser feita o mais rapidamente possível após os cristais param de crescer, como o material mais antigo é mais provável que seja parcialmente reticuladas, reduzindo assim a sua adequação para uso em experimentos de semeadura. Se existir qualquer dúvida quanto ao facto de o material cristalino a ser colhido é o sal ou a proteína também pode ser visualizado utilizando um microscópio de fluorescência, UV ou um sistema de imagem antes da abertura, ou se o material cristalino pode ser sujeito a análise in-situ de difracção de raios-X na bandeja. Ao usar os antigos cristais de proteínas abordagem fluorescência sob irradiação UV, cristais de sal aparecerá incolor.
4. Abra a bandeja de cristalização bem selecionado. Para 96 ​​poços sentado bandejas gota cortam a folha de plástico de vedação superior ao redor do poço selecionado using uma lâmina de bisturi. Para 24 poços tabuleiros hanging gota remover a lamela utilizando um par de pinças. Inverta a lamela e coloque-o sobre uma superfície limpa estável. Retirar 50 mL da solução de reservatório e transferir o líquido para o tubo de microcentrífuga contendo a semente grânulo assegurar que o tubo se mantém no gelo durante todo.
5. Completamente esmagar os cristais no subwell (96 poços bandeja) ou lamela (bandeja de 24 poços) cai, utilizando a sonda de vidro preparado na seção 2.1, a visualização dos resultados sob um microscópio. Pequenos cristais pode demorar alguns minutos para esmagar completamente. Este passo permite que o experimentador para verificar que os cristais são fáceis de esmagar e por isso não são de ligação cruzada, e também que não se encontram cristais de sal. Cristais de sal produzir um clique característico que pode ser ouvido e sentido quando são esmagados. Se os cristais são duras e difíceis de esmagar tentativa de obter e utilizar o material mais fresco.
6. Retirar 5 ml da solução de reservatório a partir do tubo de talão de sementes e transferência para o sub-bem equivalente (sentado experimento gota), ou lamela (pendurado experimento gota) contendo o material cristalino a ser colhida. Pipetar este líquido para cima e para baixo 5-6 vezes para voltar a suspender o máximo de sub-bem ou lamela conteúdo possível. Retorne a suspensão no tubo do grânulo Semente e repita esta etapa mais duas vezes, garantindo que o material cristalino, tanto é colhida possível.
7. Vortex o grânulo semente, durante dois minutos, paragem a cada 30 segundos para arrefecer o tubo em gelo.
8. Fazer uma série de diluições, a diluição da solução stock de sementes no reservatório por um factor de 4 a 10 em cada fase. Normalmente, muitos cristais serão obtidos ao usar um estoque de sementes não diluído, então use os stocks de sementes diluídas para controlar o número de cristais por bem. Na primeira rodada de MGR, é importante para não diluir a solução estoque de sementes, uma vez que quanto maior a concentração de sementes os hits mais de cristalização serão obtidos.
9. Se não estiver a ser utilizado imediatamentetamente, transferir a suspensão de estoque de sementes e do stock de sementes diluída para uma -20 ° C, ou -80 ° C congelador para armazenamento. Para evitar que os ciclos de congelamento e descongelamento repetidos, o que pode reduzir a eficácia do stock de sementes, armazenar este material em pequenas alíquotas de volume, ou seja, 10-20 ul. Uma vez congelado, os estoques de sementes podem ser mantidos indefinidamente até que seja necessário.

3. Estabelecimento de cristalização Bandejas

1. Dependendo da disponibilidade de locais de cristalização e as preferências do experimentador, MGR rastreio de cristalização pode ser realizada utilizando ou bandejas de 24 poços empregando o método de difusão de vapor de gota em suspensão, ou em tabuleiros de 96 poços utilizando o método de difusão de vapor gota sentado. Tabuleiros de cristalização para Rmms pode ser estabelecida tanto por lado, utilizando um dispensador de líquido de manuseamento robotizado, ou uma combinação dos dois.
2. Uma experiência típica MGR criado pela mão compreenderá, 1,0 mL solução de proteína, condição cristalização 1,0 mL, e0,5 mL estoque de sementes. Uma experiência típica configurada usando um robô cristalização compreenderá, solução de proteína de 0,3 mL, 0,2 mL condição de cristalização, e 0,1 mL estoque de sementes.
3. Para realizar a triagem Rmms em 24 poços pendurado bandejas gota, em primeiro lugar, usando uma pipeta manual, transferir 300 ul de cada condição de uma tela de condições de cristalização de 96 poços em 10 mL de formato de tubo único para cada poço de 4 x 24 poços cristalização pregreased bandejas.
   1. Transferência de 1 ul de cada uma das condições de cristalização a partir de cada reservatório de 300 ul para a superfície de uma lamela de plástico correspondente a partir do qual ambas as tiras de suporte de protecção dianteiros e traseiros foram removidos.
   2. Para os 1 ml de cada uma das condições de cristalização adicionar 1 ml de solução de proteína, seguido por 0,5 l de estoque de sementes de cristal. Inverter cada lamela de tal forma que a gota de líquido é virada para baixo e por cima da posição apropriada bem.
   3. Pressione para baixo sobre a lamela, comprimindo o sealing graxa e formando uma vedação segura. Uma vez que todas as gotas 96 são estabelecidas, a bandeja deve ser transferido para uma incubadora ou numa sala de temperatura constante, normalmente na gama de 4-18 ° C durante o armazenamento.
4. Para realizar a triagem Rmms em 96 poços sentado bandejas gota em primeiro lugar transferir 20-50 ul de cada condição de uma tela condição de cristalização de 96 poços no formato de bloco de poços profundos em cada cavidade correspondente da bandeja de cristalização. Esta etapa de transferência pode ser realizada utilizando um robot de cristalização, ou por transferência manual, utilizando uma pipeta de 8 canais.
   1. Transferência de reservatório, proteínas e sementes soluções estoque para as gotas à mão ou com um robô usando os volumes detalhados em 3.1. Alguns robôs de cristalização comercialmente disponíveis não entre em contato dispense, e desempenho de sementes de transferência de estoque usando um tal sistema pode resultar em bloqueio de dispensar dicas ou tubulação associada. A ordem de distribuição é variável: alguns robôs dispensar todas as soluções simultaneamente. Seisso não é possível, dispensar proteína primeiro, depois o reservatório, então sementes de ações.
   2. Se um contato dispensação robô não é transferência disponíveis as sementes usando uma seringa de vidro de baixa de volume com uma agulha sem corte. Lavar a agulha passando-a através da solução do reservatório, em seguida dispensar o estoque de sementes em cada gota.
   3. Selar o tabuleiro com uma folha de selagem transparente e transferir para uma incubadora ou sala de temperatura constante, durante o armazenamento.

4. Inspeção de cristalização Bandejas

1. Visualize todos os experimentos de cristalização usando tanto um microscópio binocular ou um sistema de imagem de cristal. O ex geralmente proporciona ao utilizador um maior controlo sobre a profundidade de visão e o grau de ampliação do que o segundo, mas é mais demorado.
2. Inspecione cada sub-well/coverslip em seqüência e registrar qualquer evidência de formação de cristais. Experimentos deve ser inspecionado a cada 24 horas durante 5 dias após o estabelecimento ean, posteriormente, uma vez a cada 7 dias para até 4 semanas.
3. Múltiplos ciclos de MGR muitas vezes são necessárias antes de cristais de qualidade óptima de difracção são produzidos.

Resultados

(A) Exemplo de um experimento MGR

Para demonstrar a eficácia do rastreio MGR aplicamos este método para a cristalização de galinha lisozima de ovo branco (HEWL) e fígado bovino catalase (BLC). Ambos estes enzimas são eminentemente cristalizável e são estruturalmente alvos ^{15, 16,} bem caracterizados. Como tal, tanto fornecer assuntos de teste excelentes com as quais ilustram a taxa de sucesso reforçada cristalização alcançável com MGR. Experimentos de cristalização fora...

Discussão

Neste artigo descrevemos um método geral para MGR proteína triagem cristalização. Nós demonstramos usando duas proteínas de teste uma melhoria significativa na taxa de sucesso de cristalização utilizando este método. Análise de difração usando radiação síncrotron de um subconjunto de cristais gerados usando MGR e métodos não-MGR revelou pouca variação de qualidade de difração entre cristais crescidos usando qualquer método, embora autores anteriores relataram que os cristais de boa qualidade são m...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
MRC 96 well crystallization trays	Molecular Dimensions Ltd	MD11-00-100	Non-UV compatible, for screens established by robot
ClearView sealing sheets	Molecular Dimensions Ltd	MD6-01S
Hen egg white lyzozyme	Sigma-Aldrich	L6876	~95% purity
Bovine liver catylase	Sigma-Aldrich	C9322	>95% purity
Xylanase	Hampton Research	HR7-104
Thaumatin from Thaumatococcus daniellii	Sigma-Aldrich	T7630
Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko	Sigma-Aldrich	P1512
JCSG-plus HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-40	For screens established by robot
PACT premier HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-36	For screens established by robot
Morpheus HT-96 screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-47	For screens established by robot
Crystal Ph–nix liquid handling system	Art Robbins Instruments	602-0001-10
Seed bead kit	Hampton Research	HR2-320
Binocular stereo microscope	Leica	M165C
Scalpel blades	Sigma-Aldrich	S2646-100EA
ErgoOne 0.1-2.5 μl pipette	Starlab	S7100-0125
ErgoOne 2-20 μl pipette	Starlab	S7100-0221
ErgoOne 100-1000 μl pipette	Starlab	S7100-1000
JCSG-plus screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-37	For screens established by hand
PACT premier screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-29	For screens established by hand
Morpheus screen	Molecular Dimensions Ltd	MD1-46	For screens established by hand
Tweezers	Sigma-Aldrich	T5415-1EA
CrystalClene coverslips 18 mm	Molecular Dimensions Ltd	MD4-17
2 ml glass Pasteur pipettes	Sigma-Aldrich	Z722669
Vortex mixer	Fisher Scientific	02-215-360
24 well XRL crystallization tray	Molecular Dimensions Limited	MD3-11	For screens established by hand
30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5
20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5
20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0