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  • 摘要
  • 摘要
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  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

激活的致癌基因RAS一样的V12和细胞极性基因一样潦草 ，导致肿瘤生长的果蝇 ，其中肿瘤细胞也显示侵入行为的突变之间的合作。在这里，一个简单的协议为良性和浸润性肿瘤的诱导和观察提出。

摘要

果蝇照亮了我们的正常发育和疾病的遗传基础的了解，在过去的几十年，今天它仍然极大地促进我们对复杂疾病的1-7了解。肿瘤从良性到转移状态的进程是一个复杂的事件8，并已在模拟果蝇 ，以帮助我们更好地了解这种疾病9的遗传基础。在这里，我提出了一个简单的协议，以基因诱导，观察并分析肿瘤的果蝇幼虫的进展。肿瘤诱导的技术是基于MARCM系统10上，并利用活化的癌基因，的Ras V12和细胞极性基因丢失（ 乱写 ， 光盘大和致死巨型幼虫 ），以产生浸润性肿瘤9之间的合作。我将演示如何将这些肿瘤可在完整的幼虫进行可视化和那么如何将这些可解剖出作进一步分析。这里介绍的简化协议应该有可能使这种技术通过兴趣了解一个基因在肿瘤侵袭中的作用的调查予以确认。

引言

肿瘤从良性到转移状态的进展是明智步骤过程，其特征是存在于主体8的保护机制逃避。例如肿瘤细胞在体内必须能够逃避细胞凋亡和免疫系统，突破了专门的细胞外基质（ECM）称为基底膜，并克服了细胞周围的8所施加的社会控制。它是通过一步明智的进展，癌症细胞获得迁移和殖民遥远的地方在一个称为转移过程的能力。我们如何在肿瘤细胞克服了身体产生的障碍的认识仍处于起步阶段，但是，从研究新兴的画面迄今为止所做指向由癌细胞11-13重复使用正常的发育过程及信号通路。

果蝇果蝇得到了大幅我们UND贡献erstanding通过使用开发了在过去几十年中14-17先进的基因技术正常发育和疾病。使用我们已经到达了一个更好地了解各种癌基因和抑癌基因的18-22诱变和表达的工具。然而，肿瘤转移是一些已被主要研究了细胞培养模型23,24以及各种异种移植模型25-27的遗传病变之间的合作的结果。这些模型虽然厉害有其局限性，因为他们不完全模仿在活的有机体中发现的条件。此外，在现有的小鼠转基因模型是繁琐，不利于侵入行为28,29遗传分析。一些研究试图了解肿瘤细胞的侵袭果蝇 30,31。这些技术主要是利用原发肿瘤移植到主机，然后依靠跟踪TRAnsplanted肿瘤侵犯邻近组织32,33。一个强大的技术，称为MARCM 10适应了Pagliarini和徐肿瘤浸润在果蝇 9建模。肿瘤侵犯的这家优雅的遗传模型利用激活的癌基因和细胞极性的丧失之间的合作。这种造型的优势在于，所述浸润性肿瘤是在一个完整的有机体从而绕过需要组织移植产生的事实。带来的致癌合作，活化的癌基因类似的Ras V12是在细胞中表达的在幼虫眼触角光盘克隆。由于MARCM技术的结果，这些克隆还标有绿色荧光蛋白（GFP），方便的可视化和由合子细胞极性突变体像致命的巨型幼虫 ， 字迹潦草 ，和光盘大，其结果是在绿色荧光蛋白标记的浸润性肿瘤头侧复杂。在这个报告中，我演示如何诱导，并且无论是在一个完整的幼虫的上下文并在解剖出头侧复杂的可视化这些侵入性肿瘤。肿瘤诱导这里提出利用对果蝇第二染色体的试剂。在表2中，我提供股票上，可以被用于相同目的的X和第 3染色体的列表。我认为，这种简化的协议将使这种技术容易接触到感兴趣的研究人员了解肿瘤进展的分子基础。

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研究方案

1。诱导良性非侵入性肿瘤

  1. 使用表2中列出的股票为良性肿瘤的诱导。
  2. 准备一个起始培养以下 ​​基因型的“测试仪”股票：Y，W，EY-FLP1;浴池- GAL80，FRT40A; Act5C> Y +> Gal4的，UAS-GFP
  3. 准备一个起始培养的“测试”股票下列基因型：W; FRT40A，UAS-V12的Ras / CYO
  4. 收集来自“测试仪”股票10只雌性童女和十男性从“测试”的股票。
  5. 放置他们两个在一个小瓶飞食品跨越从“测试仪”和“测试”股票的男性和女性。
  6. 将交叉于25℃培养箱中培养，并让雄性和雌性交配和产卵24-48小时。
  7. 检查小瓶足够卵沉积并为第一龄幼虫确保培养物不干燥的存在。
    1. 加几滴蒸压蒸馏水文化，以保持湿润（如文化干燥）。
    2. 继续监察文化，并根据需要重复步骤1.7.1。
  8. 根据观察荧光显微镜流浪三龄幼虫第3节所述。

2。感应浸润性肿瘤的

  1. 使用表2中列出的股票为浸润性肿瘤的诱导。
  2. 从步骤1.2以上的下列基因型使用起动机文化：Y，W，EY-FLP1;浴池- GAL80，FRT40A; Act5C> Y +> Gal4的，UAS-GFP
  3. 准备一个起始培养的“测试”股票下列基因型：W; LGL 4，FRT40A，UAS-V12的Ras / CYO
  4. 收集来自“测试仪”股票10只雌性童女和十男性从“测试”的股票。
  5. 通过将他们两个在一个小瓶苍蝇F跨从“测试仪”和“测试”股票的男性和女性OOD。
  6. 将交叉于25℃培养箱中培养，并让雄性和雌性交配和产卵24-48小时。
  7. 检查小瓶足够卵沉积并为第一龄幼虫确保培养物不干燥的存在。
    1. 加几滴蒸压蒸馏水文化，以保持湿润（如文化干燥）。
    2. 继续根据需要监控的培养干燥，然后重复步骤2.7.1。
  8. 在荧光显微镜观察三龄幼虫第3节所述。

3。良性和浸润性肿瘤的观察

  1. 使用三龄幼虫为良性肿瘤隔离和可视化。
    1. 湿油漆刷在蒸馏水中，并使用该漆刷从培养瓶的壁刮几三龄幼虫。
    2. 将出现萧条的幻灯片用1X PBS幼虫，然后用湿油漆刷废料e关从幼虫表皮的任何食品原料。
    3. 将幼虫放置在一个培养皿，并在-20℃下冷冻30分钟，离开固定的幼虫。
      1. 另一种方法使用FLYNAP以固定幼虫。
      2. 放置一个FLYNAP棒蘸FLYNAP到小瓶从3.1.3.2和堵塞小瓶让利插入小瓶幼虫后，静置30〜40分钟。
    4. 放置在玻片上固定化的幼虫，加一滴光卤烃油，盖上盖玻片，并根据与可视化绿色荧光蛋白（GFP）的能力，荧光显微镜观察。
    5. 良性肿瘤轴承幼虫将发出绿色荧光的前部区域，其中头位络合物存在。
  2. 从文化上面的步骤＃2设置观察侵袭性肿瘤中选择10天的幼虫（诱导后）。第10天幼虫被选中是因为肿瘤侵入轴承幼虫有较长的升ARVAL阶段，通常不能pupariate。
  3. 按照步骤3.1.1至3.1.4，除了代替三龄幼虫用10天的幼虫。
    1. 在第10天肿瘤侵入轴承幼虫将发出绿色荧光的前部区域，其中头位络合物存在。
  4. 如果在荧光显微镜配备有数码相机再取荧光良性和肿瘤侵入轴承幼虫的图片。

4。良性和浸润性肿瘤的头侧复杂和进一步观察解剖

幼虫的半透明表皮使得难以观察浸润肿瘤的程度。从而侵犯的程度更好地解剖头侧复杂了幼虫的可视化。应使用下列步骤来剖析头侧复杂。

  1. 用湿画笔选择三龄幼虫（良性肿瘤）和第10天的幼虫（浸润性肿瘤）FROM中的各培养瓶。
  2. 幼虫放置在含冷的1X PBS解剖菜的好。使用油漆刷刮去从幼虫表皮的任何食物颗粒。
    1. 干净的幼虫转移到含有冷的1X PBS解剖盘的新鲜好。
    2. 检查GFP荧光的使用能够检测荧光立体显微镜的存在。摒弃-GFP轴承幼虫。
  3. 加入冷的1X PBS的1.0毫升到一个新的良好的解剖盘，用一对镊子转移幼虫轴承无论是良性或浸润性肿瘤（解剖协议保持不变，这两种类型的肿瘤）。
  4. 使用一对大约2/3rds的从前端钳握住幼虫下来。
    1. 使用其他钳子和巧妙的分隔幼虫的后三分之一个并丢弃。
    2. 放手的幼虫的前2/3rds的。作为幼虫的内部压力被释放的内容幼虫会渗出体腔。
    3. 用一对镊子除去肠，脂肪体和已渗出的体腔的幼虫的其它内容内。
    4. 使用一对镊子举行幼虫的口钩将其推入幼虫表皮和使用其他钳子完全颠倒幼虫。
    5. 使用镊子轻轻地，小心地取出脂肪体，唾液腺，肠道，翼盘复杂，任何气管导管。现在头侧复杂应该是可见的连接到倒置幼虫的口钩。大脑半球和腹神经索（VNC）仍然会通过神经从VNC发出连接到幼虫的表皮。
    6. 使用镊子轻轻地打破头部神经和幼虫表皮之间的连接。
    7. 由于VNC和幼虫表皮之间的神经连接断开和多余的脂肪体等组织取出，头侧合作mplex将变得清晰可见，并且将附着在表皮幼虫只在口钩。
    8. 头侧复杂的可以留贴在幼虫表皮，如果复杂的需要固定的下游应用，如抗体染色或后可视化。
    9. 如果没有进一步的下游应用会被执行，然后头侧络合物可从幼虫表皮被分离并置于滴基于安装介质进行进一步的观察和分析的甘油。使用VECTASHIELD作为安装介质。

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结果

作为协议的结果，在这里呈现的用户将能够通过过度激活的癌基因在幼虫眼触角成虫盘诱发良性肿瘤。用户也将能够通过过表达活化的癌基因在细胞的克隆以诱导侵入性肿瘤在眼触角光盘也突变体的细胞极性基因。肿瘤可以很容易地可视化，用荧光显微镜在整个幼虫或在已解剖出的幼虫体腔（ 图1）的头部复合物“绿色荧光”组织的帮助。良性肿瘤将被局限在眼睛触角盘复杂的GFP阳性...

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讨论

癌症是一种复杂的疾病有一个更好的了解，今天比过去。然而，仍有许多需要学习和解释之前，我们并不拥有相关机制的全貌。这里提出的简单的协议，能够诱导基因在整个生物体良性和侵入性肿瘤，然后研究与肿瘤的此模型中的进展有关的生物学。大部分在果蝇和其他生物的现有技术或者利用基于细胞的培养系统，以了解肿瘤发生及转移，或一个系统，它采用原发肿瘤组织移植入成年的?...

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披露声明

我什么都没有透露。

致谢

研究在我的实验室的支持，生物学启动资金的WKU部，WKU研究基金会RCAP，我承认＃11-8032，并通过从全国学院普通医学科学研究所父母捐款资助，KBRIN-AREA补助生在奖号5P20GM103436-13。我还要感谢田旭中博士实验室的我被介绍给这个技术和雷蒙德Pagliarini博士谁首先建立这种技术在许实验室。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
10X PBS (phosphate buffered saline) pH 7.2 stock solutionInvitrogen, Sigma Aldrich
Chilled 1X PBS pH7.2 working solutionInvitrogen, Sigma AldrichMake fresh and refrigerate, can be used up to a week
FlynapCarolina BiologicalsFly anesthesia needed to anesthetize larvae
Fixative0.1M PIPES, pH 7.2, 4% ParaformaldehydeNeeded to fix the dissected cephalic complex
Ice BucketSeveralMaintain solutions on ice. Also, dissect cephalic complex in chilled 1X PBS and then place on ice in an Eppendorf tube
1.7ml Eppendorf tubeVarious
Glass slides, cover glassFisher Scientific
Vectashield Mounting Media or any other mounting mediaVector Laboratories
Halocarbon 200 or 700 OilPolysciences Inc. or Halocarbon.comHalocarbon 200 is used to mount the larvae for visualization on a fluorescence stereoscope
Sally Hansen "Hard as Nails" nail polishCan be found at any general merchandise storeNeeded to seal the edges of Coverslip
A Leica MZ16.5 fluorescence stereomicroscope or any other fluorescence stereomicroscopeLeica and othersNeeded to observe the GFP fluorescence in larvae
Dumont #5 forcepsFine Science Tools
Pyrex 9 well spot plate or any other dissection dishSigma Aldrich
Paint BrushCan be found at any general merchandise store
Table 1. Materials needed to perform the experimental protocol presented in this article.

参考文献

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