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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

La coopération entre un oncogène RAS activé comme V12 et des mutations dans les gènes de polarité cellulaire comme bourrée, à provoquer une croissance de la tumeur chez la drosophile, où les cellules tumorales présentent également des comportements invasives. Voici un protocole simple pour l'induction et l'observation des tumeurs bénignes et envahissantes est présenté.

Résumé

Drosophila a éclairé notre compréhension de la base génétique du développement normal et la maladie au cours des dernières décennies et aujourd'hui, il continue de contribuer énormément à notre compréhension des maladies complexes 1-7. La progression des tumeurs d'une bénigne à un état ​​métastatique est un événement complexe 8 et a été modélisée chez la drosophile pour nous aider à mieux comprendre la base génétique de cette maladie 9. Ici, je présente un protocole simple pour induire génétiquement, observer et ensuite analyser la progression des tumeurs chez les larves de drosophile. La technique d'induction des tumeurs est basé sur le système de marcm 10 et exploite la coopération entre un oncogène activé, Ras V12 et la perte de gènes de polarité de la cellule (bourrée, et des disques à grande létale larves de géant) pour générer des tumeurs invasives 9. Je démontre comment ces tumeurs peuvent être visualisées dans les larves intactes etcomment ceux-ci peuvent être disséqués pour une analyse ultérieure. Le protocole simplifié présenté ici devrait permettre à cette technique pour être utilisé par les chercheurs intéressés à comprendre le rôle d'un gène dans l'invasion tumorale.

Introduction

La progression des tumeurs d'une bénigne à un état ​​métastatique est un processus de sage étape qui se caractérise par l'évasion de mécanismes protecteurs présents dans le corps 8. Par exemple les cellules tumorales dans le corps doivent être en mesure d'échapper à l'apoptose et le système immunitaire, la percée de la matrice extracellulaire spécialisée (ECM) appelée membrane basale, et de surmonter tous les contrôles sociaux imposés par les cellules environnantes 8. C'est grâce à une progression pas à pas sage que les cellules cancéreuses acquièrent la capacité de migrer et de coloniser des sites distants dans un processus appelé métastase. Notre compréhension de la façon dont la cellule tumorale surmonte les barrières imposées par le corps est encore à ses balbutiements, cependant, l'image qui émerge de la recherche effectuée points ainsi loin d'une utilisation répétée des processus normaux de développement et des voies de signalisation par les cellules cancéreuses 11-13.

La mouche des fruits Drosophila melanogaster a énormément contribué à notre understanding du développement normal et la maladie par l'utilisation de techniques génétiques sophistiquées développées au cours des dernières décennies 14-17. En utilisant la mutagenèse et les outils de surexpression nous sommes arrivés à une meilleure compréhension des différents oncogènes et gènes suppresseurs de tumeurs 18-22. Cependant, les métastases de la tumeur est le résultat d'une coopération entre plusieurs lésions génétiques qui ont été étudiés principalement dans des modèles de culture de cellules 23,24, ainsi que différents modèles de xénogreffe 25-27. Ces modèles quoique puissante ont leurs limites car ils ne reproduisent pas entièrement aux conditions énoncées dans un organisme vivant. En outre, les modèles transgéniques disponibles chez la souris sont encombrants et peu propice à l'analyse génétique de comportement invasif 28,29. Plusieurs études ont tenté de comprendre l'invasion des cellules tumorales chez la drosophile 30,31. Ces techniques utilisent principalement la transplantation de tumeurs primaires aux hôtes et reposent sur le suivi de la tratumeurs nsplanted pour invasion des tissus voisins 32,33. Une technique puissante appelée marcm 10 a été adapté par Pagliarini et Xu pour modéliser l'invasion tumorale chez la drosophile 9. Cette modélisation élégante génétique de l'invasion tumorale a exploité la coopération entre un oncogène activé et la perte de la polarité cellulaire. La puissance de cette modélisation réside dans le fait que les tumeurs invasives sont créés dans un organisme intact contournant ainsi le besoin d'une transplantation de tissus. Pour provoquer la coopération oncogène, un oncogène Ras activé comme V12 est exprimée dans les clones de cellules dans le disque d'eye-antennaire larvaire. En raison de la technique de marcm ces clones sont également marquées avec la protéine fluorescente verte (GFP) pour une visualisation facile et sont publiés homozygotes pour les mutants de la polarité de la cellule tels que les larves létale géant, bourrée, et des disques de grandes. Résulte GFP étiqueté tumeurs invasives dans l' complexe céphalique. Dans ce rapport, jedémontrer comment provoquer, et de visualiser ces tumeurs invasives à la fois dans le cadre d'une larve intact et dans disséquée complexe céphalique. L'induction de tumeurs présentée ici utilise des réactifs sur le deuxième chromosome de Drosophila. Dans le tableau 2, je fournis une liste de stocks sur X et 3 e chromosomes qui peuvent être utilisés dans le même but. Je crois que ce protocole simplifié fera cette technique facilement accessibles aux chercheurs qui s'intéressent à la compréhension de la base moléculaire de la progression tumorale.

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Protocole

Une. L'induction de tumeurs non invasives bénignes

  1. Utiliser les stocks énumérés dans le tableau 2 pour l'induction de tumeurs bénignes.
  2. Préparer un levain pour la "tester" le bilan de la génotype suivante: y, w, ey-FLP1; Tub-GAL80, FRT40A; Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP
  3. Préparer un levain pour la "testé" le bilan de la génotype suivant: w; FRT40A, UAS-Ras V12 / CYO
  4. Recueillir dix filles vierges du "testeur" actions et dix mâles de la souche "testé".
  5. Traverser les hommes et les femmes de la "tester" et le stock "testé" en les plaçant à la fois dans un flacon avec de la nourriture à la mouche.
  6. Placez la croix dans un incubateur à 25 ° C et laisser les mâles et les femelles pour s'accoupler et pondre des œufs pendant 24-48 h.
  7. Vérifiez les flacons pour la ponte suffisante et la présence de larves de premier stade de s'assurer que la culture n'est pas en train de s'assécher.
    1. Ajouter quelques gouttes d'autoclavel'eau distillée à la culture pour le garder humide (si la culture est en train de s'assécher).
    2. Continuer à surveiller la culture et répétez l'étape 1.7.1 si nécessaire.
  8. Respecter errant troisième stade larvaire sous un stéréomicroscope de fluorescence, comme indiqué à l'article 3.

2. L'induction de tumeurs invasives

  1. Utiliser les stocks énumérés dans le tableau 2 pour l'induction de tumeurs invasives.
  2. Utilisez la culture de départ de l'étape 1.2 ci-dessus du génotype suivante: y, w, ey-FLP1; Tub-GAL80, FRT40A; Act5C> y +> Gal4, UAS-GFP
  3. Préparer un levain pour la "testé" le bilan de la génotype suivant: w; lgl 4, FRT40A, UAS-Ras V12 / CYO
  4. Recueillir dix filles vierges du "testeur" actions et dix mâles de la souche "testé".
  5. Traverser les hommes et les femmes de la "tester" et le stock "testé" en les plaçant à la fois dans un flacon à la mouche food.
  6. Placez la croix dans un incubateur à 25 ° C et laisser les mâles et les femelles pour s'accoupler et pondre des œufs pendant 24-48 h.
  7. Vérifiez les flacons pour la ponte suffisante et la présence de larves de premier stade de s'assurer que la culture n'est pas en train de s'assécher.
    1. Ajouter quelques gouttes d'eau distillée à l'autoclave à la culture pour le garder humide (si la culture est en train de s'assécher).
    2. Continuer à surveiller la culture de la sécheresse et répétez l'étape 2.7.1 si nécessaire.
  8. Respecter troisième stade larvaire sous un stéréomicroscope de fluorescence, comme indiqué à l'article 3.

3. Observation de tumeurs bénignes et envahissantes

  1. Utilisez troisième stade larvaire pour l'isolement de tumeur bénigne et la visualisation.
    1. Mouillez un pinceau dans de l'eau distillée, et l'utilisation de ce pinceau gratter un peu de larves de troisième stade de la paroi du flacon de culture.
    2. Placer les larves dans une lame de dépression avec du PBS 1X, puis en utilisant une peinture humide brosse ferraillee de tout produit alimentaire de l'épiderme larvaire.
    3. Placer les larves dans une boîte de Petri et laisser au congélateur à -20 ° C pendant 30 min pour immobiliser la larve.
      1. Autre méthode pour immobiliser les larves à l'aide FLYNAP.
      2. Placez une baguette de FLYNAP trempé dans FLYNAP le flacon de 3.1.3.2 et après avoir branché le let flacon flacon bouché avec larves reposer pendant 30 à 40 min.
    4. Placez la larve immobilisé sur une lame de verre, ajouter une goutte d'huile d'halocarbures lumière, couvrir avec un couvercle en verre et observer sous un stéréomicroscope de fluorescence avec la possibilité de visualiser la protéine fluorescente verte (GFP).
    5. Les larves de palier de tumeur bénigne va émettre une fluorescence verte dans la région antérieure, où le complexe est présent céphalique.
  2. Sélectionnez jour 10 larves (après induction) de la culture définie à l'étape 2 ci-dessus pour l'observation de tumeurs invasives. Jour 10 larves sont choisis parce que les larves d'appui de tumeur invasive ont un l prolongéestade Arval et généralement ne parviennent pas à pupariate.
  3. Suivez les étapes 3.1.1 à 3.1.4, sauf qu'au lieu de la troisième journée stade de l'utilisation des larves de 10 larves.
    1. Le jour 10 larves de palier de la tumeur invasive une fluorescence verte dans la région antérieure, où le complexe est présent céphalique.
  4. Si le microscope à fluorescence est équipé d'un appareil photo numérique, puis prendre des photos des larves d'appui de tumeur bénigne et invasive fluorescent.

4. Dissection de l'Observation complexe et plus céphalique de tumeurs bénignes et envahissantes

L'épiderme translucides de la chenille, il est difficile d'observer l'étendue de l'invasion des tumeurs. Ainsi, l'étendue de l'invasion est mieux visualisé par la dissection du complexe céphalique de la larve. Les étapes suivantes devraient être utilisés pour disséquer le complexe céphalique.

  1. L'utilisation d'un pinceau humide sélectionner troisième stade larvaire (pour les tumeurs bénignes) et le jour 10 larves (pour les tumeurs invasives) felon les flacons de culture respectives.
  2. Placer les larves dans un puits d'une plaque de dissection contenant du PBS 1X froid. Utilisez un pinceau pour racler les particules de nourriture de l'épiderme larvaire.
    1. Transfert larves propre pour un nouveau puits de la boîte de dissection contenant du PBS 1X froid.
    2. Vérification de la présence de fluorescence de la GFP en utilisant un microscope stéréoscopique capable de détecter la fluorescence. Jeter les larves de roulement non-GFP.
  3. Ajouter 1,0 ml de PBS 1X froid à un nouveau puits sur le plat de dissection et l'aide d'une paire de pinces transférer une larve portant soit des tumeurs bénignes ou envahissantes (le protocole de dissection reste le même pour ces deux types de tumeurs).
  4. Maintenir la chenille vers le bas en utilisant une paire de forceps environ 2/3rds de l'extrémité antérieure.
    1. Utilisez l'autre paire de pinces et intelligemment séparer le 1/3ème postérieure de la larve et jetez-le.
    2. Lâchez antérieure 2/3rds de la larve. Comme la pression à l'intérieur de la chenille est libérée du contenu de lalarve suinter hors de la cavité du corps.
    3. Utiliser une paire de pinces pour retirer le tube digestif, le corps gras et les autres composants internes de la larve qui ont suinté de la cavité du corps.
    4. Utilisez une paire de pinces pour tenir le crochet de la bouche de la larve et le pousser dans l'épiderme larvaire et en utilisant l'autre paire de pinces inverser la larve complètement.
    5. Utilisez la pince pour enlever délicatement et soigneusement le corps gras, les glandes salivaires, l'intestin, le complexe de disque de l'aile et des tubes de la trachée. Le complexe céphalique, devrait maintenant être visible attaché à l'hameçon de la bouche de la larve à l'envers. Les hémisphères du cerveau et la corde nerveuse ventrale (VNC) seraient toujours liée à l'épiderme larvaire par les nerfs émanant de la VNC.
    6. Utilisez une paire de pinces pour briser doucement les connexions entre les nerfs céphaliques et l'épiderme larvaire.
    7. Comme les connexions nerveuses entre la VNC et l'épiderme larvaires sont brisées et le corps de l'excès de graisse et d'autres tissus retirés, la co céphaliquemplex deviendrait clairement visible et sera fixé à l'épiderme larvaire seulement à l'embouchure crochets.
    8. Le complexe céphalique peut être laissée dans l'épiderme larvaire si le complexe doit être fixé pour les applications en aval comme la coloration des anticorps ou pour la visualisation plus tard.
    9. Si aucune autre applications en aval seraient effectuées alors le complexe céphalique peut être détaché de l'épiderme larvaire et placé dans une goutte de glycérine à base de milieu de montage pour observation et l'analyse. Utilisez Vectashield que les médias de montage.

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Résultats

Par suite du protocole présenté ici, l'utilisateur sera en mesure d'induire des tumeurs bénignes par la surexpression d'un oncogène activé dans l'oeil disque imaginai antennaire larvaire. L'utilisateur sera également en mesure d'induire des tumeurs invasives dans le disque antennaire de l'oeil en surexprimant un oncogène activé dans les clones de cellules mutantes également pour un gène de la polarité cellulaire. Les tumeurs peuvent être facilement visualisés à l'aide d'...

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Discussion

Le cancer est une maladie complexe avec une bien meilleure compréhension aujourd'hui que dans le passé. Cependant, il reste encore beaucoup à apprendre et expliqué avant que nous ayons une image complète des mécanismes sous-jacents. Le protocole simple présenté ici, il est possible d'induire des tumeurs bénignes et génétiquement invasives dans un organisme entier, puis l'étude de la biologie associée à la progression des tumeurs dans ce modèle. La plupart des techniques existantes de Droso...

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Déclarations de divulgation

Je n'ai rien à divulguer.

Remerciements

Recherche dans mon laboratoire est soutenu par le Département WKU des fonds de démarrage de biologie, WKU Fondation de la recherche de la CRPA-je accorder # 11-8032 et par une subvention KBRIN-ZONE financé grâce à une subvention de parent de l'Institut national de sciences médicales générales des National Institutes de la Santé sous le numéro d'attribution 5P20GM103436-13. Je tiens également à remercier le Dr Tian Xu dans le laboratoire duquel j'ai été présenté à cette technique et le Dr Raymond Pagliarini qui le premier a créé cette technique dans le laboratoire Xu.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
10X PBS (phosphate buffered saline) pH 7.2 stock solutionInvitrogen, Sigma Aldrich
Chilled 1X PBS pH7.2 working solutionInvitrogen, Sigma AldrichMake fresh and refrigerate, can be used up to a week
FlynapCarolina BiologicalsFly anesthesia needed to anesthetize larvae
Fixative0.1M PIPES, pH 7.2, 4% ParaformaldehydeNeeded to fix the dissected cephalic complex
Ice BucketSeveralMaintain solutions on ice. Also, dissect cephalic complex in chilled 1X PBS and then place on ice in an Eppendorf tube
1.7ml Eppendorf tubeVarious
Glass slides, cover glassFisher Scientific
Vectashield Mounting Media or any other mounting mediaVector Laboratories
Halocarbon 200 or 700 OilPolysciences Inc. or Halocarbon.comHalocarbon 200 is used to mount the larvae for visualization on a fluorescence stereoscope
Sally Hansen "Hard as Nails" nail polishCan be found at any general merchandise storeNeeded to seal the edges of Coverslip
A Leica MZ16.5 fluorescence stereomicroscope or any other fluorescence stereomicroscopeLeica and othersNeeded to observe the GFP fluorescence in larvae
Dumont #5 forcepsFine Science Tools
Pyrex 9 well spot plate or any other dissection dishSigma Aldrich
Paint BrushCan be found at any general merchandise store
Table 1. Materials needed to perform the experimental protocol presented in this article.

Références

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