为检验新型抗病毒药物的鉴定对蓝舌病病毒

摘要

三个实验，包括细胞病变效应（CPE）为基础的试验中，剂量反应实验和时间的 - 加法（TOA）测定法已被开发，优化，验证和用于识别对蓝舌病毒的新的抗病毒药物（BTV），以及以确定可能的机制， - 行动（MOA）为新发现的抗病毒药物。

摘要

为了找出对BTV潜在的抗病毒药物，我们已经开发，优化和验证这里提出三个实验。在基于CPE测定法的开发是为了评估在第一测定化合物是否表现出任何抗病毒活性，并已用于筛选大量化合物库。同时，抗病毒药物的毒性也可以使用基于CPE的测定法进行评价。剂量反应实验的目的是确定疗效所选抗病毒的范围内， 即 50％抑制浓度（IC _50）或有效浓度（EC _50），以及它的范围的细胞毒性（CC _50）。 TOA的分析受聘为农业部初步研究，以确定在BTV病毒的生命周期或宿主细胞机制的可能影响本小说抗病毒药物的作用机制。这些测定是在细胞培养系统的抗病毒功效的评价是至关重要的，并已被用于我们最近的研究导致ing到了一些对BTV新的抗病毒药物的鉴定。

引言

BTV是一个原型双链RNA病毒属中的环状病毒 ， 呼肠弧病毒家族。 BTV是家畜中最重要的疾病，包括绵羊，山羊，牛等家畜之一，与世界各地的^1,2 $ 3十亿/年亏损。异国情调的BTV血清型是在上市的重要动物病原体“美国农业部的严重后果家畜病原体。”重新出现的BTV的最近，已经引起疾病的牛大爆发和羊在整个北欧^3,4几个国家。作为其经济意义的结果，作为一个模型系统，BTV已经成为广泛的分子，遗传和结构研究的主题，并且几种疫苗已经开发出来。然而，由于缺乏适当的检测对抗病毒药物的发现，有没有可用的对抗BTV抗病毒药物。

在最近的高通量筛选（HTS）活动使用BTV作为模型系统，我们ðeveloped，优化和验证一个基于CPE的检测，以确定对虫媒病毒⁵潜在的广谱抗病毒药物。基于CPE的测定是，已在抗病毒的药物发现对许多病毒诱导快速和可观察到的CPE /凋亡^5-7被用于一个公认的测定。在我们的系统，北京电视台后感染，CPE是显而易见的脊椎动物细胞，包括海拉，BSR和HEK 293T ^8。 BTV-诱 ​​导的CPE可以监测和量化使用各种细胞活力的检测方法，包括的CellTiter格洛细胞活力试剂盒（试剂盒^CTG）9。该试剂盒确定基于对细胞内ATP的定量在培养的活细胞的数目呈现，这标志着代谢活跃的活细胞的存在。在优化条件下，这里提出的基于CPE的检测表明其可行性与“混合和计量”一步到位的协议，并与稳定的荧光信号的灵活性。同时，有毒化合物热度庆安细胞活力将被排除在这个基于CPE的检测。在基于CPE的检测表明其稳定性和抗病毒的药物发现对抗BTV的可靠性，并且已经用于筛选NIH的分子库的小分子库（MLSMR），从而导致潜在的抗病毒铅化合物（次六个新集群的识别^）5。

当一个潜在的抗病毒化合物中已使用基于CPE测定法确定，这将需要经受10浓度的剂量-反应实验来确定抗病毒活性和细胞毒性²的范围内。的抗病毒效力，表示为50％抑制浓度（IC _50）或50％有效浓度（EC _50），是一种药物，其抑制基线和最大之间病毒诱导的CPE的中途的浓度。抗病毒药物的细胞毒性， 即 50％的细胞毒性浓度（CC _50），是浓度的药物诱导的基线值和最大值之间的细胞毒性的50％。选择性指数（SI），记为50％的SI（SI _50）从CC ₅₀ / IC _50，它确定对病毒诱导的CPE抗病毒的特异性来计算。该IC _50（或EC _{50），CC 50}和SI ₅₀值是至关重要的措施，以确定抗病毒化合物是否是有效的和有选择性的进行进一步的药物开发。

当一种抗病毒药表明没有明显的毒性在体外 ，还防止了病毒诱导的CPE和生产性病毒的生命周期，它以表征其农业部²是重要的。我们通过开展ToA的检测，以确定病毒的生命周期是受抗病毒的可能（S）步实施这种表征。通常，抗病毒化合物加入到细胞中在不同的时间前或后病毒感染。如果抗病毒药物加入到被感染的细胞中张贴到其目标STEP感染的过程中，它比较时向其中添加之前的步骤中的人会导致较低的活性。因此，ToA的研究是一种用于确定化合物的抗病毒效力，其潜在目标的关键，无论是在病毒的生命周期或参与病毒生命周期的宿主机器。

对于所有三个实验，细胞存活率用CTG套件下列制造商的指示⁵确定。该检测系统输出，可以使用不同的内部软件进行分析，充分的发光信号。每个测定的至少一式三份用8副本进行验证和执行。对于所有获得的数据，三个参数，包括平均值（AVE），标准偏差（STDEV），和共同有效的变化（CV）进行分析，以确定检测的鲁棒性。一次测定的鲁棒性进行了测定，将数据进行进一步的分析，以及使用各种生物统计学和图形化绘制C工具^2。

研究方案

1。细胞，病毒和抗病毒化合物

1. 维护的BSR细胞中，幼仓鼠肾（BHK）细胞^10，在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）含有5％胎牛血清（FCS）的衍生物，100U/ml青霉素和100微克/毫升链霉素。
2. 对于所有三个实验，板细胞的DMEM含1％FCS，100U/ml青霉素和100微克/毫升链霉素，为优化以前^5。该培养基被称为对于所有三个实验测定培养基。
3. 孵育中所有单元的培养箱中在37℃，含5％CO ₂和80-95％的湿度。
4. 噬斑纯化和繁殖如前面⁸中所述类型10 BTV（BTV-10）。稀BTV-10在测定培养基中的每个指定的检测。
5. 溶解在DMSO中的所有测试化合物，形成与浓度的股票为10毫米。存储库存在-20°C。
6. 使用试验介质为候化合物稀释到所需的浓度ð分析^2。

2。基于CPE的检测使用CTG套件

1. 种子的BSR细胞到384孔微孔板（黑色;由16×24格式）通过MicroFlo选择分配器。播种密度为5,000个细胞/孔，和播种量为20μL的抗病毒疗效分析。
2. 细胞孵育2-3小时，直至获得细胞粘附于板彻底。
3. 添加的抗病毒化合物与10μM的终浓度向每个孔中。完全混合。
4. BTV稀释到所需要的滴度，并加入5微升BTV与内政部表示，每孔。对于控制均匀，加入5微升试验培养基。培养感染的细胞72小时，在37℃，含5％CO ₂和80-95％的湿度。
5. 在72 HPI，解冻和平衡CTG缓冲区和冻干CTG基板，使用前室温。由根据第混合冻干酶/底物和缓冲试剂重组均质CTG试剂溶液E制造商的指示。
6. 平衡的测定板至室温15分钟。
7. 通过分配器添加CTG试剂等体积（25微升）到每个孔中。在室温下在黑暗中温育15分钟后，使用多模读取器具有0.1秒的积分时间测量发光信号。

3。剂量 - 反应分析

1. 种子的BSR细胞到384孔微孔板（黑色;格式由16×24），通过一个分配器，以5000个细胞/孔在20微升的抗病毒效力测定法和25μl的细胞毒性测定法，接种量分别接种密度。
2. 培养细胞2-3小时，在37℃，含5％CO ₂和80-95％的湿度，直至细胞被很好地附着到板上。
3. 在384孔板的每个化合物的四分之一面积（相当于一个96孔板），如表1中所示的过程测定。分配8个重复每个浓度在一个单一的检测。通过将病毒仅而不化合物分配的第一列作为不添加化合物和病毒的阳性对照，并且最后一列（ ^第 12 ^届 ）作为阴性对照。
4. 化合物稀释到50μm在测定培养基中，并加入到20微升/孔的抗病毒疗效检测的^第二栏。使用8通道半自动移液器25μM的浓度混合的化合物的五倍。
5. 使用8通道半自动移液器，转移在^第 2栏20微升混合物到下一列（第3 ^次 ），搅拌均匀，形成的12.5μM的浓度存在。通过从^第 3列的转移20微升混合物到下一列（ ^第 4 ^次 ），以形成另一种2倍稀释为6.25μM的浓度重复此过程。重复此两方面的连续稀释，直到^第 11列。吸并添加并混合样稿后丢弃20μl，以11 ^个列中的混合物OUND。
6. 从第2列添加BTV-10的基础上，以0.01的MOI，向每个孔中，以与5微升/孔的体积11列。添加病毒后，在每列的最终化合物浓度应为：20μM2栏，10μM的第3列，并继续以2倍稀释液降至柱11为0.04μM的最终浓度。
7. 加入5微升培养基到第1列的单元格只能控制（正）和5μL/孔BTV的柱12作为北京电视台唯一的感染控制（负）。
8. 稀释化合物以200μM的细胞毒性测定法的初始浓度。类似地，将25μl化合物/孔的具有8通道的半自动移液器加至柱2和混合5倍至100μM的浓度存在。不要添加BTV。
9. 进行2倍系列稀释液通过吸移25μl的从第2列到相邻的第3栏，并一直持续到最后一列（ ^第 12 ^次 ）。在塔12中，混合后，吸出并丢弃25微升米ixture。在第2列中的最终浓度应为100微米和12 ^个列应为0.2微米。列1是细胞唯一的控制。
10. 两种抗病毒疗效和细胞毒性测定法，孵育所述板在37℃，含5％CO ₂和80-95％湿度下72小时后处理。使用CTG试剂盒如上述（协议步骤2.5-2.7）测量细胞活力。

4。 （TOA）测定时，加成

1. 种子的BSR细胞在384 - 孔微量培养板1-24柱（黑色;由16×24的格式），通过一个分配器，在5000个细胞/孔，并在接种体积为15微升/孔。
2. 对于每个化合物，利用所有24列具有八个复制品的每个时间点在384孔板中（ 表2）的一半。通过加入10μl/孔的测定培养基中分配作为细胞仅控制第1列。标记的列24为BTV感染仅对照（阴性对照）加入5微升/孔的测定培养基中的ð5微升/孔的病毒以0.01的MOI为25微升/孔的终体积。
3. 从列2-22在不同时段后感染（HPI）作为抗病毒疗效的评价栏中选择偶数列。在这些列，感染细胞与5微升/孔BTV在0.01 MOI。在不同的HPI，还添加5微升/孔的稀释的化合物至每孔中，以形成25微升/终体积良好。为表示-2和-1 HPI添加化合物的BSR细胞之前BTV感染。对于0 HPI，同时化合物和BTV添加到文化。
4. 同时，从柱3-23指定奇数列作为化合物仅控制，该化合物在不同时间点被添加作为指定（-2，-1，0，1，2，4，8，16， 24，48 HPI）。在这些列中，添加5微升/孔的测定培养基和5微升/孔的稀释的化合物，以形成25微升/终体积良好。
5. 处理后，培养细胞在37℃，5％CO ₂与80-95％的湿度。
6. 确定细胞存活率在72 HPI使用的CellTiter格洛套件如前（协议步骤2.5-2.7）描述。

5。数据分析

1. 使用适当的内部软件的基础上通过所述多模读取器获得的发光信号的第一处理的所有数据。确定的平均值（平均），标准偏差（STDEV）每处理以及变异系数（CV），这就需要一个值不大于10％。
2. 从上面的软件处理过的数据传送到生物稳定性和图形软件工具。进行非线性回归分析，以确定EC ₅₀和CC ₅₀的值。

结果

1。化合物的抗病毒疗效

基于细胞的CPE测定法的开发，优化和使用该发光基CTG试剂盒，以确定新的抗病毒药物对抗BTV如先前描述的^2,5验证体外 。在10剂量响应测定法来反映抗病毒疗效通过测量基础上，在活细胞中^5,11呈现细胞ATP的定量在培养代谢活细胞的数目的确定铅化合物和细胞毒性。在我们以前的报告中，一些潜在的抗病毒化合物进行了评价，包括通?...

讨论

抗病毒的命中初始识别，用于抗病毒药物发现和开发的关键步骤之一是开发强大的测定法，其中包括选择一个量化指标，开发一种简单的协议，从而获得足够的信号和低于10％的CV。大多数生化或基于细胞的筛选被设计成由于在筛分过程所需的再现性和潜在的大量分子筛选的提供基于最稳健的，简单和便宜的测定法，化学的起点。该CPE为基础的检测被指定为满足这些要求，以确定从一个大的复合图...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM medium	Gibco	1134218	For cell culture
FBS	Gibco	16000044	For cell culture
0.05% Trypsin-EDTA	Gibco	1000185	For cell culture
DPBS	Gbico	1049769	For cell culture
CellTiter-Glo (CTG) kit	Promega	TB288	For cell viability measurement
70% ethanol	Fisher	S25309B	Diluted from 95%
Antiviral huashilcompounds	NIH MLSMR and de novo synthesis
BTV-10	ATCC	VR-187
BSR cell	Developed in house
Synergy-II multi-mode microplate reader	BioTek		For luminescent signal reading
MicroFlo select dispenser	BioTek		Adding cells, virus, and reagents
384-well flat-bottom microplate	CORNING	28908031	For cell culture
Gen. 5 software	BioTek		For analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader
GraphPad Prism 5	GraphPad	Version 5	For biostatic analysis and plot