JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

שלושה מבחני, כולל השפעת cytopathic (CPE) מבוססת assay, assay מנת התגובה וassay בזמן של תוספת (TOA) פותחו, אופטימיזציה, תוקף ומנוצל כדי לזהות antivirals רומן נגד וירוס Bluetongue (BTV), כמו גם כדי לקבוע את הפעולה מנגנון-of-האפשרית (משרד חקלאות) לantivirals זיהה לאחרונה.

Abstract

לזהות antivirals הפוטנציאלי נגד BTV, פיתחנו, מותאם ומאומתים שלושה מבחני שהוצגו כאן. Assay מבוסס CPE היה assay הראשון שפותח כדי להעריך אם מתחם הראה שום יעילות אנטי ושמש למסך ספריית מתחם גדולה. בינתיים, cytotoxicity של antivirals יכול גם להיות מוערך באמצעות assay מבוסס CPE. Assay מנת התגובה נועד לקבוע את טווח היעילות לנגיפים שנבחרו, כלומר 50% ריכוז מעכב (IC 50) או ריכוז יעיל (50 EC), כמו גם מגוון של cytotoxicity (CC 50). Assay TOA הועסק ללימוד משרד החקלאות הראשוני כדי לקבוע את המנגנון הבסיסי של antivirals הרומן במהלך מחזור חיים נגיפיים BTV או ההשפעה האפשרית על מנגנון תאי מארח. מבחני אלה הם חיוניים להערכת יעילות אנטי במערכת תרבית תאים, והיה בשימוש במשך המחקרים האחרונים שלנו להובילing לזיהוי של מספר התרופות אנטי רומן נגד BTV.

Introduction

BTV הוא וירוס RNA כפול גדילי אב טיפוס בסוג Orbivirus, משפחת Reoviridae. BTV הוא אחת המחלות החשובות ביותר של בעלי חיים מקומיים, ובם כבשים, עז, בקר וחיות בית אחרות, עם אובדן 3000000000 $ / שנה ברחבי העולם 1,2. סרוטיפ BTV האקזוטי הוא פתוגן בעלי חיים חשוב מופיע בסעיף 'פתוגנים משק החי התוצאה USDA גבוהה ". לאחרונה, מחדש מתפתח של BTV גרם להתפרצות גדולה של מחלה בבקר וצאן במספר המדינות באירופה הצפונית 3,4. כתוצאה מהמשמעות הכלכלית שלה כמערכת מודל, BTV כבר את הנושא של מחקרים מולקולריים, גנטיים ומבניים נרחבים, ומספר חיסונים פותחו. עם זאת, בשל המחסור במבחנים ראויים לגילוי תרופות אנטי, אין antivirals זמין נגד BTV.

בהקרנת תפוקה גבוהה לאחרונה במסע פרסום (HTS) תוך שימוש BTV כמערכת המודל, אנחנו דeveloped, מותאם ומאומתים assay מבוסס CPE לזהות antivirals ספקטרום רחב הפוטנציאלי נגד arboviruses 5. assay מבוסס CPE הוא assay מוכר היטב כי כבר בשימוש בגילוי תרופות אנטי נגד מספר הווירוסים שנגרם CPE / אפופטוזיס המהיר והנצפה 5-7. במערכת שלנו, זיהום BTV הודעה, CPE בא לידי ביטוי בתאים בעלי חוליות, כוללים הלה, ב.ס. ר, וHEK 293T 8. CPE-Induced BTV יכול להיות במעקב ולכמת באמצעות שיטות זיהוי כדאיות תא שונות, כוללים ערכת CellTiter Glo מגיב כדאיות תא (ערכת CTG) 9. ערכה זו קובע את מספר תאי קיימא בתרבות המבוססת על quantitation של ה-ATP הסלולרי הוצג, מה שמסמן את נוכחותם של תאי חיים פעילים מטבולית. בתנאים אופטימליים, מבוסס assay CPE מוצג כאן הראה ההיתכנות שלה עם הפרוטוקול "לערבב ולמדוד" צעד אחד, וגמישות עם אותות זורח יציבים. בינתיים, Redu תרכובות רעילותcing כדאיות תא לא ייכללו בassay מבוסס CPE זה. Assay מבוסס CPE הראה עמיד ואמין לגילוי תרופה אנטי נגד BTV שלה, ומאז משמש למסך NIH הספריות מולקולריות המולקולה קטנה Repository (MLSMR), מה שמוביל לזיהוי של שישה אשכול רומן של מתחם להוביל אנטי פוטנציאלי (ים ') 5.

כאשר תרכובת אנטי פוטנציאלית זוהתה באמצעות assay מבוסס CPE, זה יהיה צריך להיות חשוף לassay מנת תגובת עשר הריכוז כדי לקבוע את טווח היעילות וcytotoxicity 2 אנטי. היעילות אנטי, מיוצג כ50% הריכוז המעכב (50 IC) או 50% הריכוז היעיל (50 EC), היא הריכוז של תרופה אשר מעכבת באמצע הדרך CPE-induced וירוס בין קו הבסיס והמקסימום. Cytotoxicity של antivirals, כלומר ריכוז 50% cytotoxicity (CC 50), הוא הריכוזשל תרופת גרימת 50% מcytotoxicity בין קו הבסיס והמקסימום. המדד סלקטיבית (SI), מסומן כ50% SI (50 SI) מחושב מCC 50 / IC 50 הקובע את הספציפיות של נגיפים נגד CPE-induced וירוס. IC 50 (או 50 EC), CC 50 וSI 50 ערכים הם צעדים קריטיים כדי לקבוע אם תרכובת אנטי היא חזקה ובררנית לפיתוח תרופות נוסף.

כאשר נגיפים לא הראו כל רעילות גלויה במבחנה, אך וירוס מנע מושרה CPE ומחזור החיים הנגיפי היעיל, חשוב לאפיין משרד החקלאות שלה 2. אנחנו יזמנו אפיון כזה על ידי ביצוע assay TOA כדי לקבוע את הצעד האפשרי (ים) של מחזור החיים נגיפי שמושפע אנטי. באופן כללי, מתחם אנטי נוספו לתאים בזמנים שונים מראש או זיהום שלאחר וירוס. אם antivirals נוספו לתאים הנגועים לפרסם ליעד שלהTEP במהלך ההדבקה, הוא יביא לפעילות נמוכה יותר בהשוואה לזו שהתווסף לפני הצעד. לכן, מחקר TOA הוא קריטי לקביעת היעילות אנטי של מתחם, והיעד הפוטנציאלי שלו, או על מחזור החיים הנגיפי או מכונות המארח מעורבות במחזור החיים הנגיפי.

לכל שלושת מבחני, כדאיות תא נקבעה באמצעות ערכת CTG בעקבות ההוראה של היצרן 5. מערכת זיהוי זה פלטי אותות הארה הולמים שיכול להיות מנותח באמצעות תוכנות שונות בבית. כל assay קבל תוקף ומתבצע לפחות בשלושה העתקים עם שמונה העתקים. לכל הנתונים שהתקבלו, שלושה פרמטרים, כולל ערך ממוצע (AVE), סטיית תקן (STDEV), ווריאצית שיתוף יעיל (CV) נותחו על מנת לקבוע את החוסן של assay. ברגע שהחוסן של assay נקבע, הנתונים ינותחו נוספים וזממו באמצעות יוסטאטיקה וgraphi שוניםכלים ג 2.

Protocol

1. תאים, וירוסים והתרכובות אנטי

  1. שמור על תאים ב.ס. ר, נגזרת של כליות אוגר תינוק תאים (BHK) 10, במדיום של הנשר שונה Dulbecco (DMEM) המכילה 5% עוברי עגל בסרום (FCS), פניצילין 100U/ml ו100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין.
  2. לכל שלושת מבחני, תאי צלחת בDMEM עם FCS 1%, פניצילין 100U/ml ו100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, כמותאמים בעבר 5. בינוני זה התייחס כמדיום assay לכל שלושת מבחני.
  3. דגירה כל התאים בחממה על 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO 2 ולחות 80-95%.
  4. פלאק-לטהר ולהפיץ את הסוג 10 BTV (BTV-10) כפי שתואר לעיל 8. לדלל BTV-10 במדיום assay עבור כל מבחני מיועדים לכך.
  5. ממיסים את כל חומרי הבדיקה בDMSO כדי ליצור מניות עם ריכוז ב10 מ"מ. אחסן את המניות ב -20 ° C.
  6. לדלל תרכובות לריכוזים רצויים באמצעות מדיום assay ללייעדמבחני ד 2.

2. Assay מבוסס CPE באמצעות ערכת CTG

  1. תאי זרע ב.ס. ר לmicroplate 384 גם (שחור; פורמט ידי 16 x 24) באמצעות מתקן בחר MicroFlo. צפיפות הזריעה היא 5,000 תאים / היטב, וזריעת הנפח 20 μl לניתוח יעילות אנטי.
  2. דגירה תאים למשך 2-3 שעות עד שתאים מקבלים חסיד אל הצלחת ביסודיות.
  3. הוספת מתחם אנטי עם ריכוז סופי של 10 מיקרומטר היטב כל אחד. לערבב אותו לחלוטין.
  4. לדלל BTV לכייל רצוי ולהוסיף 5 BTV μl עם משרד הפנים מסומנים היטב כל אחד. לשליטה טובה, להוסיף 5 μl של תקשורת assay. דגירה התאים הנגועים ל72 שעות על 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO 2 ולחות 80-95%.
  5. ב72 HPI, הפשרה ולאזן חיץ CTG ומצע CTG lyophilized לטמפרטורת חדר לפני השימוש. מחדש את הפתרון מגיב CTG הומוגנית על ידי ערבוב של האנזים / מצע lyophilized ומגיב חיץ על פי ההוראות יצרן דואר.
  6. לאזן את צלחות assay לטמפרטורת חדר במשך 15 דקות.
  7. הוסף נפח שווה (25 μl) של חומרים כימיים CTG היטב כל אחד על ידי מתקן. לאחר דוגרים במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר בחושך, למדוד אותות הארה באמצעות קורא מצב מרובה עם זמן אינטגרציה של 0.1 שניות.

3. Assay מנת התגובה

  1. תאי זרע ב.ס. ר לmicroplate 384 גם (שחור; פורמט ידי 16 x 24) באמצעות מתקן, עם צפיפות זריעה של 5,000 תאים / גם בזריעת נפח 20 μl עבור assay יעילות אנטי ו25 μl עבור assay cytotoxicity, בהתאמה .
  2. דגירה תאים למשך 2-3 שעות על 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO 2 ולחות 80-95% עד תאים המחוברים היטב לצלחת.
  3. assay תהליך באזור רבע מהצלחת 384 גם לכל מתחם (שווה ערך לצלחת 96 היטב), כפי שמוצג בטבלה 1. להקצות שמונה חזרות לכל ריכוזבassay אחד. הקצה את העמודה הראשונה כביקורת החיובית מבלי להוסיף מתחם ווירוס, והעמודה האחרונה (ה 12) כביקורת שלילית על ידי הוספת וירוס רק בלי תרכובות.
  4. לדלל תרכובות 50 מיקרומטר במדיום assay ולהוסיף לעמודה 2 nd ב20 μl / גם עבור assay יעילות אנטי. מערבבים את המתחם חמש פעמים באמצעות פיפטה חצי האוטומטית 8 ערוצים לריכוז של 25 מיקרומטר.
  5. באמצעות פיפטה חצי אוטומטית 8 ערוצים, להעביר 20 תערובת μl ב2 nd עמודה לעמודה הבאה (3 rd), ומערבב היטב כדי ליצור ריכוז של 12.5 מיקרומטר. חזור על תהליך זה על ידי העברת 20 תערובת μl מעמודת 3 ​​rd לעמודה הבאה (4 th) לצורה אחרת דילול כפול עם ריכוז של 6.25 מיקרומטר. חזור על הפעולה דילול סדרה כפול זה עד עמודת -11. לשאוב ולזרוק 20 μl של התערובת בעמודת ה 11 לאחר הוספת וערבוב compound.
  6. הוספת BTV-10, המבוסס על משרד הפנים של 0.01, לכל אחד גם מעמודה 2 לעמודה 11 בהיקף של 5 μl / טוב. לאחר הוספת הווירוס, ריכוז התרכובת הסופי בכל עמודה צריך להיות: 20 מיקרומטר בעמודה 2, 10 מיקרומטר בעמודה 3, והמשיך בדילול כפול למטה לעמודת 11 עם ריכוז סופי של 0.04 מיקרומטר.
  7. הוסף 5 μl של מדיום לעמודה 1 כתא שליטה בלבד (חיובית) וμl 5 / היטב BTV לעמודה 12 כזיהום BTV רק שליטה (שלילית).
  8. לדלל תרכובות לריכוז ראשוני של 200 מיקרומטר עבור assay cytotoxicity. בדומה לכך, להוסיף 25 μl / טוב של מתחם לעמודה 2 ומעורב 5x עם פיפטה חצי אוטומטית 8 ערוצים לריכוז של 100 מיקרומטר. אל תוסיף BTV.
  9. לבצע את דילול הסדרה הכפול על ידי aspirating 25 μl מעמודה 2 לעמודה 3 השכן, ונמשך עד העמודה האחרונה (ה 12). בעמודה 12, לאחר הערבוב, לשאוב ולזרוק 25 μl של מ 'ixture. הריכוז הסופי בעמודה 2 צריך להיות 100 מיקרומטר ועמודת ה 12 צריכה להיות ב0.2 מיקרומטר. עמודת 1 היא השליטה היחידה בתא.
  10. עבור שני מבחני יעילות ורעילים לתאי נגיפים, דגירה הצלחות על 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO 2 ולחות 80-95% ל72 לאחר טיפול שעה. למדוד כדאיות תא באמצעות ערכת CTG כפי שתואר לעיל (פרוטוקול הצעדים 2.5-2.7).

4. בזמן של תוספת Assay (TOA)

  1. תאי הזרע ב.ס. ר מהעמודה 1-24 בmicroplate 384 גם (שחור; פורמט ידי 16 x 24) באמצעות מתקן ב5,000 תאים / היטב וזריעת הנפח 15 μl / טוב.
  2. עבור כל מתחם, לנצל את כל העשרים והארבע עמודות עם שמונה העתקים לכל נקודת זמן במחצית של צלחת 384 גם (טבלה 2). הקצה עמודת 1 כשליטה רק תאים על ידי הוספת 10 μl / גם מדיום assay. מארק עמודה 24 כזיהום BTV רק שליטה (בקרה שלילית) על ידי הוספה בינונית 5 μl / גם assayוירוס ד 5 μl / גם במשרד הפנים של 0.01 לנפח סופי של 25 μl / טוב.
  3. בחר את העמודות הזוגיות מעמודת 2-22 עמודת הערכת יעילות אנטי כבשעות שלאחר זיהום שונה (HPI). בטורים אלה, להדביק תאים עם 5 μl / טוב BTV במשרד הפנים של 0.01. בHPI שונה, גם להוסיף 5 μl / מתחם מדולל היטב היטב כל אחד כדי ליצור נפח סופי של 25 μl / טוב. למסומן -2 ו -1 HPI להוסיף מתחם לתאים ב.ס. ר לפני הדבקת BTV. ל0 HPI, להוסיף את המתחם וBTV לתרבות בו זמנית.
  4. במקביל, לייעד את עמודות אי זוגיות מעמודת 3-23 כמתחם שולט בלבד, מתוכם מתחם נוספו בזמן נקודות שונות כמיועד (-2, -1, 0, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 48 HPI). בטורים אלה, להוסיף 5 μl בינוני / טוב assay ו5 μl / מדולל היטב מתחם כדי ליצור נפח סופי של 25 μl / טוב.
  5. לאחר טיפול, דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% לחות 2 עם 80-95% CO.
  6. לקבוע כדאיות תא ב72 HPI באמצעות ערכת CellTiter-Glo כפי שתואר לעיל (פרוטוקול הצעדים 2.5-2.7).

5. ניתוח נתונים

  1. לעבד את כל הנתונים הראשונים באמצעות תוכנה מתאימה בבית תוך שימוש באיתותים זורח הושגו באמצעות הקורא במצב מרובה. קבע את הערך הממוצע (הממוצע), סטיית תקן (STDEV) עבור כל טיפול, כמו גם וריאציות המקדם (CV), המחייב את ערך שאינו עולה על 10%.
  2. להעביר את הנתונים המעובדים מהתוכנה הנ"ל לכלי תוכנת biostatic והגרפי. לבצע את ניתוח רגרסיה שאינו ליניארי כדי לקבוע את הערכים של EC 50 ו50 CC.

תוצאות

1. יעילות אנטי של מתחם

Assay CPE מבוסס התאים פותח, מותאם ותוקף במבחנה באמצעות ערכת CTG מבוסס זורח לזהות antivirals רומן נגד BTV כפי שתואר לעיל 2,5. Assay התגובה עשרה המינון הועסק כדי לשקף את היעילות ורעילה לתאי נגיפים של מתחם להוביל זוהה ע...

Discussion

לזיהוי הראשוני של להיטים אנטי, אחד הצעדים המרכזיים לגילוי תרופות אנטי ופיתוח הוא לפתח מבחני חזקים, הכולל בחירת סמן לכימות, פיתוח פרוטוקול פשוט, קבלת אותות מספיקים וקורות חיים פחות מ -10%. רוב המסכים ביוכימי או מבוסס תאים נועדו לספק נקודת התחלה כימית המבוססת על assay חזק ב?...

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

פרויקט זה מומן על ידי מענק 1R03MH08127-01 ו7R03MH08127-02 מ-NIH לש לי, ועל ידי קרנות IMPACT ממחלקה לרפואה ב UAB לש לי. תמיכה מקרן Molette ואוניברסיטת אובורן זוכה להערכה. אנו מודים גם assistances הטכני מהגב 'Pulin צ'ה ומר ולדימיר Musiienko במהלך העבודה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM mediumGibco1134218For cell culture
FBSGibco16000044For cell culture
0.05% Trypsin-EDTAGibco1000185For cell culture
DPBSGbico1049769For cell culture
CellTiter-Glo (CTG) kitPromegaTB288For cell viability measurement
70% ethanolFisherS25309BDiluted from 95%
Antiviral huashilcompoundsNIH MLSMR and de novo synthesis
BTV-10ATCCVR-187
BSR cellDeveloped in house
Synergy-II multi-mode microplate readerBioTekFor luminescent signal reading
MicroFlo select dispenserBioTekAdding cells, virus, and reagents
384-well flat-bottom microplateCORNING28908031For cell culture
Gen. 5 softwareBioTekFor analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader
GraphPad Prism 5GraphPadVersion 5For biostatic analysis and plot

References

  1. Hemati, B., et al. Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph. J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).
  2. Gu, L., et al. Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus. PLoS ONE. 7, e43341 (2012).
  3. Meiswinkel, R., et al. The 2006 outbreak of bluetongue in northern Europe--the entomological perspective. Prev. Vet. Med. 87, 55-63 (2008).
  4. Szmaragd, C., et al. Mortality and case fatality during the recurrence of BTV-8 in northern Europe in 2007. Vet. Rec. 161, 571-572 (2007).
  5. Li, Q., Maddox, C., Rasmussen, L., Hobrath, J. V., White, L. E. Assay development and high throughput antiviral drug screening against Bluetongue virus. Antiviral Research. 83, 267-273 (2009).
  6. Noah, J. W., et al. A cell-based luminescence assay is effective for high-throughput screening of potential influenza antivirals. Antiviral Res. 73, 50-59 (2007).
  7. Che, P., Wang, L., Li, Q. The development, optimization and validation of an assay for high throughput antiviral drug screening against Dengue virus. Int. J. Clin. Exp. Med. 2, 363-373 (2009).
  8. Li, Q., Li, H., Blitvich, B. J., Zhang, J. The Aedes albopictus inhibitor of apoptosis 1 gene protects vertebrate cells from bluetongue virus-induced apoptosis. Insect Mol. Biol. 16, 93-105 (2007).
  9. Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell number. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
  10. Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
  11. Phillips, T., Jenkinson, L., McCrae, C., Thong, B., Unitt, J. Development of a high-throughput human rhinovirus infectivity cell-based assay for identifying antiviral compounds. J. Virol. Methods. 173, 182-188 (2011).
  12. Harvey, T. J., et al. Tetracycline-inducible packaging cell line for production of flavivirus replicon particles. J. Virol. 78, 531-538 (2004).
  13. Puig-Basagoiti, F., et al. High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 4980-4988 (2005).
  14. Puig-Basagoiti, F., et al. Triaryl pyrazoline compound inhibits flavivirus RNA replication. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 1320-1329 (2006).
  15. Duan, M., et al. In vitro and in vivo protection against the highly pathogenic H5N1 influenza virus by an antisense phosphorothioate oligonucleotide. Antivir. Ther. 13, 109-114 (2008).
  16. Ray, D., Shi, P. Y. Recent advances in flavivirus antiviral drug discovery and vaccine development. Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 1, 45-55 (2006).
  17. Severson, W. E., et al. High-throughput screening of a 100,000-compound library for inhibitors of influenza A virus (H3N2). J. Biomol. Screen. 13, 879-887 (2008).
  18. Severson, W. E., et al. Development and validation of a high-throughput screen for inhibitors of SARS CoV and its application in screening of a 100,000-compound library. J. Biomol. Screen. 12, 33-40 (2007).
  19. Bolken, T. C., et al. Identification and characterization of potent small molecule inhibitor of hemorrhagic fever New World arenaviruses. Antivir. Res. 69, 86-97 (2006).
  20. Van Loock, M., et al. A novel high-throughput cellular screening assay for the discovery of HIV-1 integrase inhibitors. J. Virol. Methods. 179, 396-401 (2012).
  21. Kampmann, T., et al. In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses. Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).
  22. Kirchmair, J., et al. Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques. Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

80AssayBluetonguecytopathicof Time of

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved