JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Три анализы, в том числе цитопатического эффекта (CPE) на основе анализа, доза-реакция для анализа и Время-дополнение (ToA) анализа были разработаны, оптимизированы, проверены и использованы для идентификации новых противовирусных препаратов против вируса синего языка (BTV), а также как определить возможный механизм-о-Action (MOA) для вновь выявленных противовирусных препаратов.

Аннотация

Для выявления потенциальных противовирусных препаратов против BTV, мы разработали, оптимизированы и проверены три анализов, представленные здесь. CPE на основе анализа был первый анализ, разработанный для оценки соединение показало ли какие-либо противовирусную эффективность и были использованы для скрининга большой библиотеки соединений. Между тем, цитотоксичность противовирусных препаратов могут быть также оценивали с помощью CPE на основе анализа. Анализ доза-реакция была разработана, чтобы определить диапазон эффективности для выбранного антивирусного, т.е. 50% ингибирующей концентрации (IC 50) или эффективную концентрацию (ЕС 50), а также свой ​​ассортимент цитотоксичности (CC 50). Тоа анализ был использован для первоначального исследования МСХ, чтобы определить основной механизм романа противовирусных препаратов во время BTV вирусной жизненного цикла или возможного влияния на хозяина сотового оборудования. Эти анализы являются жизненно важными для оценки противовирусной эффективности в системе культуры клеток, и были использованы для наших недавних исследований, проведенныхING к идентификации ряда новых противовирусных препаратов против BTV.

Введение

BTV является прототипом двухцепочечной РНК вируса в род Orbivirus, семейного Reoviridae. BTV является одним из наиболее важных заболеваний домашнего скота, в том числе овец, коз, крупного рогатого скота и других домашних животных, с потерей $ 3 млрд / год по всему миру 1,2. Экзотический BTV серотип является важным патогеном животных перечислены в "Министерство сельского хозяйства США повышенной животноводства патогенов." В последнее время вновь возникающие из BTV вызвало серьезную вспышку болезни у крупного рогатого скота и овец в ряде стран по всему Северной Европы 3,4. В результате его экономической значимости и в качестве модельной системы, BTV была предметом обширных молекулярных, генетических и структурных исследований, а также несколько вакцины были разработаны. Однако в связи с отсутствием надлежащих анализов для противовирусной лекарственных препаратов, нет противовирусных препаратов, доступных на BTV.

В недавнем скрининга высокой пропускной (HTS) кампании с использованием BTV как модельной системы, мы гeveloped, оптимизированы и проверены на CPE основе анализа для выявления потенциальных противовирусных препаратов широкого спектра действия против арбовирусы 5. CPE на основе анализа является хорошо известным анализ, который был использован в противовирусной лекарственных препаратов против ряда вирусов, индуцированного быстрое и наблюдаемый CPE / апоптоз 5-7. В нашей системе сообщение BTV инфекция, CPE проявляется в клетках позвоночных, в том числе HeLa, BSR, и НЕК 293Т 8. BTV-индуцированной CPE может контролироваться и количественно, используя различные методы обнаружения жизнеспособность клеток, в том числе жизнеспособность клеток Набор реагентов CellTiter Glo (КТГ комплекте) 9. Этот набор определяет количество жизнеспособных клеток в культуре на основе количественного клеточного АТФ представлены, который сигнализирует о наличии метаболически активных живых клеток. В оптимальных условиях, СРЕ основе анализа представленных здесь показала свою целесообразность с "смешивать и измерения" один шаг протокола, и гибкости с устойчивых сигналов люминесцентных. Между тем, токсичные соединения РедуCing жизнеспособность клеток будут исключены в этом CPE основе анализа. CPE основе Анализ показал свою устойчивость и надежность для противовирусной лекарственных препаратов против BTV, и был использован для скрининга NIH Молекулярные Библиотеки маленькая молекула Repository (MLSMR), что приводит к идентификации шести нового кластера потенциальной противовирусной ведущего компонента (ов ) 5.

Когда потенциальный противовирусное соединение было идентифицировано с помощью CPE основе анализа, он должен быть подвергнут десятилетнего концентрации доза-реакция анализа, чтобы определить диапазон противовирусной эффективности и цитотоксичность 2. Противовирусная эффективность, представлены как 50% ингибирующую концентрацию (IC 50) или 50% эффективной концентрации (ЕС50), концентрация лекарственного средства, которая ингибирует вирус-индуцированной CPE на полпути между базовой линией и максимума. Цитотоксичность противовирусных препаратов, то есть 50% концентрации цитотоксичности (CC 50), представляет собой концентрациюпрепарата, вызывающего 50% цитотоксичности между базовой и максимумом. Селективный показатель (SI), обозначается как 50% Si (SI 50) вычисляется из CC 50 / IC 50, которая определяет специфичность противовирусное против индуцированного вирусом CPE. IC 50 (или EC 50), CC 50 и SI 50 значения являются критическими меры, чтобы определить, является ли противовирусное соединение является мощным и селективным для дальнейшего развития наркотиков.

Когда противовирусный не показали явной токсичности в пробирке, но предотвратить вирус индуцированных CPE и продуктивной вирусной жизненного цикла, важно, чтобы характеризовать его МСХ 2. Мы инициировали такую ​​характеристику путем проведения Тоа анализа для определения возможного шаг (ы) вирусного жизненного цикла, которая зависит от противовирусного. Как правило, противовирусное соединение добавляют к клеткам в различные моменты времени предварительно или после вирусной инфекции. Если противовирусные были добавлены к инфицированных клеток прикреплять к своей цели сТЭФ в ходе инфекции, было бы привести к снижению активности по сравнению с той, которая была добавлена ​​перед стадией. Таким образом, ToA исследование является критическим для определения противовирусной эффективности соединения, и его потенциальную цель, либо на вирусного жизненного цикла или в хост-машин, участвующих в вирусной жизненного цикла.

Для всех трех анализах, жизнеспособность клеток определяли с использованием набора CTG следующие инструкции производителя 5. Это система обнаружения выводит адекватные сигналы люминесценции, которые могут быть проанализированы с помощью различного программного обеспечения в доме. Каждый анализ проверены и выполнены по крайней мере, в трех экземплярах с восемью копиями. Для всех полученных данных, три параметра, в том числе среднего значения (AVE), стандартное отклонение (отклонение), и коэффициент вариации (CV) были проанализированы, чтобы определить надежность анализа. После того, надежность анализа было определено, данные будут проанализированы и нанесены с использованием различных biostatics и графическигрн инструменты 2.

протокол

1. Клетки, Вирус и противовирусных соединений

  1. Поддержание BSR клеток, производное почки детеныша хомячка (ВНК) ячеек 10, в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM), содержащей 5% эмбриональной сыворотки теленка (FCS), 100U/ml пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина.
  2. Для всех трех анализов, пластины клеток в DMEM с 1% FCS, 100U/ml пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина, как ранее оптимизированный 5. Эту среду называют как среды для анализа всех трех анализов.
  3. Инкубируйте все клетки в инкубаторе при 37 ° С, 5% СО 2 и 80-95% влажности.
  4. Налет-очистить и распространяться тип 10 BTV (BTV-10), как описано ранее 8. Развести BTV-10 в среде для анализа для каждого указанного анализов.
  5. Растворить всех испытаний соединений в ДМСО с получением шток с концентрацией в 10 мМ. Храните запасы при температуре -20 ° С.
  6. Развести соединений в требуемой концентрации с использованием среды для анализа для назначенногод анализы 2.

2. CPE основе анализа Использование CTG Kit

  1. Семенной BSR клеток в микропланшете 384-а (черный; формате на 16 х 24) через MicroFlo выберите дозатора. Плотность посева составляет 5000 клеток / лунку, а объем посева составляет 20 мкл для противовирусной анализ эффективности.
  2. Инкубируйте клетки в течение 2-3 часов до клетки получают приверженцем тщательно пластины.
  3. Добавить антивирусное соединение с конечной концентрации 10 мкМ в каждую лунку. Смешайте его полностью.
  4. Развести BTV до желаемой титра и добавить 5 мкл BTV с обозначают как МВД в каждую лунку. Для контроля также, добавить 5 мкл среде для анализа. Инкубируйте инфицированные клетки в течение 72 ч при 37 ° С, 5% СО 2 и 80-95% влажности.
  5. На 72 HPI, оттепели и уравновешивают буфером CTG и лиофилизированную CTG подложку до комнатной температуры перед использованием. Развести гомогенного раствора реагента CTG путем смешивания лиофилизированного фермента / субстрат и буфер реагент в соответствии с гоИнструкции е изготовителя.
  6. Равновесие аналитические планшеты до комнатной температуры в течение 15 мин.
  7. Добавить равный объем (25 мкл) CTG реагентов в каждую лунку по дозатора. После инкубации в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте, измерения люминесценции сигналов с использованием читателю многорежимный со временем интегрирования 0,1 сек.

3. Анализ доза-ответ

  1. Семенной BSR клеток в 384-а микропланшет (черный; формате на 16 х 24) через дозатор, с плотностью посева 5000 клеток / лунку в объеме высева 20 мкл для противовирусной эффективности анализа и 25 мкл для анализа цитотоксичности, соответственно .
  2. Инкубируйте клетки в течение 2-3 ч при 37 ° С, 5% СО 2 и 80-95% влажности до клетки хорошо прикреплен к пластине.
  3. Процесс анализа в четверть площади 384-луночный планшет для каждого соединения (эквивалент 96-луночный планшет), как показано в таблице 1. Выделение восьми одинаковых образцов для каждой концентрациив одном анализе. Связать первый столбец в качестве положительного контроля без добавления соединения и вирус, и последний столбец (12-е) в качестве отрицательного контроля, добавив вирус только без соединений.
  4. Развести соединений до 50 мкм в среде для анализа и добавления в столбец 2-й на 20 мкл / лунку для противовирусной эффективности анализа. Смешать соединение пять раз с использованием 8-канальный полу-автоматической пипетки до концентрации 25 мкМ.
  5. Использование 8-канальный полуавтоматический пипетки 20 мкл смеси в 2 колонки-й в следующую колонку (3-й), хорошо перемешать, чтобы сформировать концентрации 12,5 мкМ. Повторите этот процесс путем передачи 20 мкл смеси из 3-м столбце в следующую колонку (4-й), чтобы сформировать другой разбавление двукратное с концентрацией 6,25 мкМ. Повторите эту двукратное серийное разведение до колонны 11-й. Аспирируйте и выбросить 20 мкл смеси в 11-й колонке после добавления и смешивания компкруглый.
  6. Добавить BTV-10, по MOI 0,01, в каждую лунку из колонки 2 к колонке 11 с объемом 5 мкл / лунку. После добавления вирус, конечная концентрация соединения в каждом столбце должны быть: 20 мкм в колонке 2, 10 мкМ в колонке 3, и продолжали с двукратным разбавлением вплоть до колонки 11 с конечной концентрацией 0,04 мкМ.
  7. Добавьте 5 мкл среды в колонну 1 как сотовый только контроля (положительного) и 5 ​​мкл / лунку BTV к колонке 12 в качестве BTV инфекции только управления (отрицательный).
  8. Развести соединений к начальной концентрации 200 мкМ для анализа цитотоксичности. Аналогично, добавить 25 мкл / лунку соединения в колонну 2 и смешанной с 5x 8-канальной полуавтоматической пипетки до концентрации 100 мкМ. Не добавляйте BTV.
  9. Провести разбавления серии двукратное путем аспирации 25 мкл из колонки 2 в соседнюю колонку 3, и продолжалось до последней колонке (12-й). В колонке 12 после смешивания аспирации и выбросить 25 мкл мixture. Конечная концентрация в колонке 2 должна быть 100 мкм и 12-й столбец должен быть на 0,2 мкм. В столбце 1 является единственным элементом управления клеток.
  10. Для обоих противовирусной эффективности и цитотоксичность, инкубировать пластин при 37 ° С, 5% СО 2 и 80-95% влажности в течение 72 ч после обработки. Измерение жизнеспособность клеток с использованием набора CTG, как описано выше (протокол шаги 2,5-2,7).

4. Время-дополнение (ToA) Пробирной

  1. Семя BSR клетки из колонки 1-24 в микропланшете 384-а (черный; формат на 16 х 24) с помощью дозатора на 5000 клеток / лунку и объема посева на 15 мкл / лунку.
  2. Для каждого соединения использовать все двадцать четыре колонки с восемью реплик для каждой временной точке в половине 384-луночный планшет (табл. 2). Столбец 1, как клетки только контроль Назначение путем добавления 10 мкл / лунку среды для анализа. Марк колонка 24, как BTV инфекции только управления (отрицательный контроль), добавив 5 мкл / лунку среды для анализа апВирус д 5 мкл / лунку в МВД 0,01 до конечного объема 25 мкл / лунку.
  3. Выберите четные столбцы из колонки 2-22, как противовирусное колонке оценка эффективности при различных часов после заражения (HPI). В этих столбцов инфицировать клетки с 5 мкл / лунку BTV при MOI 0,01. В другом HPI, добавить 5 мкл / лунку разведенного соединения в каждую лунку с получением конечного объема 25 мкл / лунку. Для обозначается -2 и -1 HPI добавить соединение к BSR клеток до BTV инфекции. При 0 HPI, добавьте соединение и BTV к культуре одновременно.
  4. Параллельно обозначают столбцах с нечетными номерами из колонки 3-23, как только контролирует соединение, из которых соединение добавляли при различных временных точках, обозначенных (-2, -1, 0, 1, 2, 4, 8, 16, 24, 48 HPI). В этих колонн, добавляют 5 мкл / лунку среды для анализа и 5 мкл / лунку разведенного соединения с образованием конечного объема 25 мкл / лунку.
  5. После лечения, инкубировать клетки при 37 ° С, 5% СО 2 с 80-95%-ной влажности.
  6. Определение жизнеспособности клеток при 72 HPI с использованием набора CellTiter-Glo как описано ранее (шаги протокол 2,5-2,7).

5. Анализ данных

  1. Процесс все данные сначала с помощью соответствующего программного обеспечения в доме на основе люминесцентных сигналов, полученных с помощью считывателя многомодового. Определить среднее значение (в среднем), стандартное отклонение (отклонение) для каждого лечения, а также вариации коэффициента (CV), который необходимо ввести значение не более 10%.
  2. Трансфер обработанные данные от выше программного обеспечения к биостатические и графического программного инструмента. Провести нелинейный регрессионный анализ, чтобы определить значения EC 50 и CC 50.

Результаты

1. Противовирусный механизм действия соединения

На основе клеток CPE был разработан анализ, оптимизированы и проверены в лабораторных помощью люминесцентного основе CTG комплект для идентификации новых противовирусных препаратов против BTV, как описано выше 2,5. Р?...

Обсуждение

Для первоначальной идентификации противовирусных хитов, одним из ключевых шагов для противовирусной открытия и разработки лекарственных является разработка надежных анализов, которые включает в себя выбор количественные маркер, разработки простой протокол, получения достаточных с...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.

Благодарности

Этот проект был поддержан грантом 1R03MH08127-01 и 7R03MH08127-02 от NIH к Q. Ли, и в результате воздействия средств из Отдела Медицины на UAB, чтобы Q. Ли. Поддержка со стороны Molette фонда и Auburn University ценится. Мы также благодарим технические помощь за г-жой Пулин Че и г-н Владимир Musiienko в ходе работы.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM mediumGibco1134218For cell culture
FBSGibco16000044For cell culture
0.05% Trypsin-EDTAGibco1000185For cell culture
DPBSGbico1049769For cell culture
CellTiter-Glo (CTG) kitPromegaTB288For cell viability measurement
70% ethanolFisherS25309BDiluted from 95%
Antiviral huashilcompoundsNIH MLSMR and de novo synthesis
BTV-10ATCCVR-187
BSR cellDeveloped in house
Synergy-II multi-mode microplate readerBioTekFor luminescent signal reading
MicroFlo select dispenserBioTekAdding cells, virus, and reagents
384-well flat-bottom microplateCORNING28908031For cell culture
Gen. 5 softwareBioTekFor analysis of reading outputs from Synergy-II multi-mode microplate reader
GraphPad Prism 5GraphPadVersion 5For biostatic analysis and plot

Ссылки

  1. Hemati, B., et al. Bluetongue virus targets conventional dendritic cells in skin lymph. J. Virol. 83, 8789-8799 (2009).
  2. Gu, L., et al. Novel Virostatic Agents against Bluetongue Virus. PLoS ONE. 7, e43341 (2012).
  3. Meiswinkel, R., et al. The 2006 outbreak of bluetongue in northern Europe--the entomological perspective. Prev. Vet. Med. 87, 55-63 (2008).
  4. Szmaragd, C., et al. Mortality and case fatality during the recurrence of BTV-8 in northern Europe in 2007. Vet. Rec. 161, 571-572 (2007).
  5. Li, Q., Maddox, C., Rasmussen, L., Hobrath, J. V., White, L. E. Assay development and high throughput antiviral drug screening against Bluetongue virus. Antiviral Research. 83, 267-273 (2009).
  6. Noah, J. W., et al. A cell-based luminescence assay is effective for high-throughput screening of potential influenza antivirals. Antiviral Res. 73, 50-59 (2007).
  7. Che, P., Wang, L., Li, Q. The development, optimization and validation of an assay for high throughput antiviral drug screening against Dengue virus. Int. J. Clin. Exp. Med. 2, 363-373 (2009).
  8. Li, Q., Li, H., Blitvich, B. J., Zhang, J. The Aedes albopictus inhibitor of apoptosis 1 gene protects vertebrate cells from bluetongue virus-induced apoptosis. Insect Mol. Biol. 16, 93-105 (2007).
  9. Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell number. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
  10. Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
  11. Phillips, T., Jenkinson, L., McCrae, C., Thong, B., Unitt, J. Development of a high-throughput human rhinovirus infectivity cell-based assay for identifying antiviral compounds. J. Virol. Methods. 173, 182-188 (2011).
  12. Harvey, T. J., et al. Tetracycline-inducible packaging cell line for production of flavivirus replicon particles. J. Virol. 78, 531-538 (2004).
  13. Puig-Basagoiti, F., et al. High-throughput assays using a luciferase-expressing replicon, virus-like particles, and full-length virus for West Nile virus drug discovery. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49, 4980-4988 (2005).
  14. Puig-Basagoiti, F., et al. Triaryl pyrazoline compound inhibits flavivirus RNA replication. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 1320-1329 (2006).
  15. Duan, M., et al. In vitro and in vivo protection against the highly pathogenic H5N1 influenza virus by an antisense phosphorothioate oligonucleotide. Antivir. Ther. 13, 109-114 (2008).
  16. Ray, D., Shi, P. Y. Recent advances in flavivirus antiviral drug discovery and vaccine development. Recent Pat. Antiinfect. Drug Discov. 1, 45-55 (2006).
  17. Severson, W. E., et al. High-throughput screening of a 100,000-compound library for inhibitors of influenza A virus (H3N2). J. Biomol. Screen. 13, 879-887 (2008).
  18. Severson, W. E., et al. Development and validation of a high-throughput screen for inhibitors of SARS CoV and its application in screening of a 100,000-compound library. J. Biomol. Screen. 12, 33-40 (2007).
  19. Bolken, T. C., et al. Identification and characterization of potent small molecule inhibitor of hemorrhagic fever New World arenaviruses. Antivir. Res. 69, 86-97 (2006).
  20. Van Loock, M., et al. A novel high-throughput cellular screening assay for the discovery of HIV-1 integrase inhibitors. J. Virol. Methods. 179, 396-401 (2012).
  21. Kampmann, T., et al. In silico screening of small molecule libraries using the dengue virus envelope E protein has identified compounds with antiviral activity against multiple flaviviruses. Antiviral Res. 84, 234-241 (2009).
  22. Kirchmair, J., et al. Development of anti-viral agents using molecular modeling and virtual screening techniques. Infect. Disord. Drug Targets. 11, 64-93 (2011).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

80Drug Discovery

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены