单厂，无菌的缩影和结瘤的豆科植物生长<em&gt;苜蓿</em&gt;与根瘤菌共生体<em&gt;根瘤菌</em

摘要

苜蓿植物的共生固氮细菌的苜蓿根瘤菌在个人，无菌微生态从标准实验室板制成的增长使得频 ​​繁的检查根系和根瘤的不妥协不育。植物可以保持在这些生长室长达9个星期。

摘要

根瘤菌形成于兼容的主机豆科植物的根共生固氮根瘤。其中最发达的模型系统研究这些相互作用是植物蒺藜苜蓿品种。 Jemalong A17和根瘤菌菌苜蓿根瘤菌 1021。植物根系共生表型的得分反复成像需要的是无损要么植物或细菌的方法。一些植物和细菌突变体的表型共生变得明显增长后的时间都比较短，而且不需要长期观察主机/共生互动。然而，在共生效率和根瘤衰老表型不明显的结瘤过程的早期阶段，细微的差别需要相对较长的生长时期，他们可以拿下之前。几种方法已经发展为长期增长和观察这个主机/共生体对的。然而，许多这些方法都需要重复浇水，这增加了污染的其他微生物的可能性。其它方法需要对大量的植物的生长相对大的空间。该方法在这里描述的，M的共生增长苜蓿/ S。苜蓿根瘤菌在无菌，单植物微生态，具有几个优点。在这些微观植物有足够的水分和营养物质，以确保不要求浇水长达9周，防止浇水过程中的交叉污染。这使得表型进行量化，可能在短期内生长系统，如在根瘤发育和早期根瘤衰老微妙延迟错过。此外，在微观世界的根和根瘤通过板盖被容易地观看，从而向上生根观察的植物是不需要的。

引言

豆科植物寄主植物蒺藜苜蓿 A17和根瘤菌菌苜蓿根瘤菌 1021之间的互动是最听话的模型系统根瘤发育和固氮共生的研究之一。两者共生伙伴的基因组已被测序^1,2和厂房及细菌都是服从遗传操作^3,4。植物和细菌突变体两者的表型分析需要观察根瘤发育的阶段，量化的共生生产率随着时间的能力。在这里，我们描述了一种观察M的根瘤发展苜蓿品种。 Jemalong A17接种S。根瘤菌 1021从标准，圆形直径3.94英寸，15毫米深的实验板（ 图1A）提出个人的缩影中。在拍摄时，通过在该板的一侧的切口的门户（曝光和生长FIGURES 1B，1C和1E）。根都包含在微观范围内，并保持无菌，同时通过板（ 图1D）的盖允许观察。由于拍摄访问，其增长是不受限的，它可以以周期性的间隔进行测量而不会影响根的无菌性。最初开发创建缺口板微观的方法由雷， 等^。5种植苜蓿植物，但它并没有被广泛采用，尽管其比其他方法的许多优点。这种方法的变化也被开发为植物根系和菌根⁶之间的相互作用的分析。现在，我们已经适应和优化这种方法M的增长苜蓿植物。此协议的过较常用的方法的优点如下所述。

有几种方法，这些方法目前广泛使用的分枝结瘤的研究苜蓿 inoculated与S。根瘤菌 ^7。最常用的方法大规模制备根瘤的根是生长在气雾沉箱^7。在这种方法中，植物被悬挂在一个大的容器中，并根通入S的混合物根瘤菌和营养液^7。此方法是实用的，如果只有一个基因型的S。根瘤菌是进行测试。因为它要求高浓度的细菌的雾化，有沉箱接种不同菌株之间的交叉污染的可能性很高。经常被用于制备大量接种的植物的另一种方法是生长在浴盆或珍珠岩，蛭石，沙子或输注用的营养液并接种S.煅烧粘土花盆根瘤菌 ^7。此方法需要使用开放桶或盆，并需要浇水的营养液和补充。盆的另一个缺点是，植物必须从这样的颗粒基质进行检查根和根瘤中除去。这种方法的另一个缺点是，大面积的培养箱空间时，需要许多不同的S。根瘤菌的基因型进行比较，因为一个单独的锅必须用于每个细菌基因型。在“伦纳德罐子”是这个方法^8,9的变化。甲伦纳德罐子是由一个堆叠在另一个之上，并通过油绳连接的两个消毒容器。生长培养基被放置在下部容器，并通过油绳的毛细管作用进入的珍珠岩，蛭石，沙子或在上部容器煅烧粘土生长基质绘制。秧苗（s）被放置在生长基质和接种S.根瘤菌 。此方法不需要浇水，但检查根和根瘤要求苗从颗粒生长基质除去。

有几种方法，并允许易检查的袋鼠TS。其中之一是透明的塑料“成长袋^”7。这种方法的一个缺点是，经常浇水，因为仅仅≤的10ml液体培养基是最佳的生长分枝需要苜蓿中袋^7。小袋实验也通常限制在〜2周^7，由于在袋内部的纸芯的击穿。这是常用的两种其它方法类似于我们的方法，所述植物生长在琼脂上和根是可见的，但这些方法也有我们的程序避免了缺点。在这些方法中，植物被完全包含在24.5厘米周围的多孔外科胶带的顶部密封或塞住用棉塞或塑料盖⁷琼脂斜面培养试管x24.5厘米琼脂平板上。这两种方法都允许容易检查根和可以保持无菌状态。但是，琼脂斜面管通常生长仅20毫升琼脂培养基上⁷和需要浇水和养分一个ddition植物的长期增长。 24.5 CM中生长的植物x24.5厘米琼脂平板微观有足够的水分和养分的长期增长，但增长的快速拍摄变得内的板子缩影和乙烯气体可以建立抑制结瘤⁷约束。在这里描述的过程中，拍摄暴露，并自由地生长，其中包含〜70毫升媒体，允许长期增长的缩影之外。

这里描述的过程可能是有用的，不仅为豆科植物结瘤的研究，同时也为其他中型植物的根表型的研究。这些微观和传统的聚碳酸酯植物组织培养罐之间的区别是，在这里所描述的板微生态根上的琼脂的垂直表面上​​生长，而不是分解成琼脂在罐的底部的水平层。这允许根被抬离琼脂表面以最小的D豪悦国际为根毛和琼脂的根表面，它通过显微镜促进根毛的考试最小的附着力。

研究方案

在执行步骤1，2，4，并在无菌的层流罩6被推荐。

1。 M的制备苜蓿幼苗A17

注：M。在这些研究中使用苜蓿种子A17冷却温室条件〜22℃，或维持在22-26℃，〜150-400毫摩尔/米^{-2 -1}光植物生长室下产生的。

1. 倒入种子发芽板：采用100平方毫米板（15毫米深），倒蒸压1.1-1.2％w / v的纯化琼脂^10〜3-5毫米的深度。每块板将被用于发芽〜0.25-0.5克种子（相当于63-125粒/板）。
   注意：使用植物细胞培养测试，纯化琼脂在本协议中所述的所有板块，这一点至关重要。为琼脂的厂商和产品目录号信息列特定的试剂和设备的表中。
2. 划破/消毒M。苜蓿种子A17S：称取足够的种子，种苗所需的号码。 （ 蒺藜苜蓿 A17种子〜4毫克每）地方的种子在无菌125毫升瓶用无菌铝箔盖（0.25-0.5克种子/瓶，这是〜63-125种）和吸管20集中（96％）毫升H ₂ SO ₄沿烧瓶壁。
   注：酸蚀将消毒的种子。此外，通过移液沿烧瓶壁酸，它会重新消毒已经接触到的未经消毒的种子接触的烧瓶内。
3. 分手种子团块用无菌玻璃吸管。经常摇动烧瓶各为10-12分钟。小，褐色坑将成为种子可见。这些都是在种皮¹¹小孔。
   注：用浓H ₂ SO工作₄时，戴上护目镜和手套。
4. 除去H ₂ SO ₄和冲洗种子：当种子至少10％有褐色的小凹点，或是12分钟过去了，取至上，从烧瓶中除去所有的酸，用无菌玻璃吸管。 （地点废酸到含有至少为300毫升自来水1-2升烧杯中，这会冲淡酸，防止过热。）倾斜烧瓶收集在烧瓶中的曲线的剩余酸和使用小玻璃吸管来删除所有剩余的酸。如果残留的酸依然存在，它会与冲洗水反应，加热的种子，并杀死他们。
   1. 通过快速浇筑百毫升无菌超纯水到每个烧瓶中漂洗种子。水的过量体积将稀释的酸，防止酸与水的反应过程中的过热和种子的损伤。倒出的水和火焰灭菌的烧瓶内的唇。
   2. 冲洗种子8至10倍，用50ml灭菌超纯水。每次冲洗过程中摇动烧瓶。烧瓶中，应考虑无菌此时，将烧瓶的唇部应该每次漂洗之前将熄火。
5. 让种子吸收过夜：在最后一次漂洗，倒入50毫升无菌超纯水到每个烧瓶，更换无菌铝箔盖在黑暗中过夜每个烧瓶中放于4℃。
6. 在催芽板瓜子地点：后让种子吸收过夜，倒​​掉水，冲洗用2倍〜25毫升超纯水，然后加入20毫升无菌超纯水，漩涡悬浮种子和从他们倒到1.1-1.2％的琼脂平板发芽步骤1.1。如果种子留在烧瓶中，加入更多的水，并再次倾。分发种子从每个烧瓶中一板（63-125粒/板）。
   1. 旋流板分发种子。种子应在板的一端均匀地分布在一个4-5厘米波段。这将是该板的“顶部”。 “底”5-6厘米应保持自由的种子（ 图2A）。
   2. 抽出的水用无菌吸管。倾斜板以45°角，以使剩余的水漏到板的底部。重新装上盖子上直到特德板和避光。板应允许排出10-20分钟。 （ 图2B）。
7. 成立发芽：删除已收集的倾斜板的底部，用无菌吸管所有的水。
   1. 重新装上盖子，并用封口膜密封板。戴上手套，并保持无菌（ 图2C）。
   2. 堆栈发芽板，然后开启所有的人都在向上90°角。这些种子将趴在琼脂的垂直表面。充分吸胀的种子应该很容易附着在琼脂。根将向下生长（ 图2D）。
   3. 包裹发芽板在箔的叠层挡住光并保持在25℃3天。

注意：如果发芽所得不足3天，根部可能太短达到琼脂缩影。如果发芽转移到缩影板前超过4天进行，苗木成活率会是穷人。如果M。苜蓿生态型或突变与慢发芽率要进行比较，慢慢发芽生态型应允许发芽超过3天。

2。个别板块缩影准备

1. 准备Jensen的介质^12（见表1组成），允许〜70毫升培养基为每个缩影。准备在投手或瓶是方便快速浇注（不超过1-2升，按每投手）和高压灭菌过程中留在投手磁力搅拌棒。
   1. 中等后冷却至55-65〜°C，补充已被添加，并且pH值已经被选中（见表1），倒入圆形直径3.94英寸，15毫米深的板块。板应浇〜0.9-1厘米深（〜70毫升/板）。
   2. Jensen的介质的部件可以形成混浊沉淀物，所以它的投手定期返回磁力搅拌板，以防止部件从沉淀出来是很重要的。沉淀物可能是相在板IBLE它们凝固后，只要它们被均匀地分布在板之间不影响性能。
   3. 浇注，以防止结露的盘子上眼睑形成过程中堆叠板。
2. 之后Jensen的板块都凝固了，陷两个板和盖子与已弯成U形^5（ 图3A）称重铲。热锅铲与燃烧器弯曲，直到红热，缺口5-6片，然后再加热。当缺口盖子被放置在缺口板，这将创建一个椭圆形的门户，通过该苗的枝条将增长（ 图3B）。如果缺口板将被储存起来，单独包装用石蜡膜..

3。 苜蓿的制备根瘤菌文化

前两天植物接种，启动所有S的文化根瘤菌菌株被接种到幼苗。丘尔RES应生长在LBMC辅以2.5毫米硫酸镁_4，2.5毫米氯化钙_2，和适当的抗生素（TY培养基也效果很好）（LB培养基[米勒]）介质^13。少至2-3毫升每种培养物就足够了。

1. 成长在30℃振荡2天，直到细胞密集。
2. 对于大多数植物接种，在S的生长期根瘤菌不是关键的。通常情况下，登录后期或早期静止期细胞使用。

4。铺设了M。对个体缩影苜蓿幼苗

1. 3天之后，打开一个发芽板（在步骤1中制备）和紧接在洪水灭菌超纯水。钳浸在乙醇和简要火焰消毒。用无菌镊子轻轻推全苗的根尖下的水，以防止干燥。罗茨将范围从2-6厘米长。多数为3-4厘米。苗木选择与直根系并没有明显的缺陷。
2. 检查Jensen的介质微观的盖子的积聚凝结。轻弹盖子，除去冷凝或用新的缺口盖更换。如果有过量的缩合的盖子，幼苗根可能会附着在盖子，然后死亡的缩合干燥后。
3. 使用镊子，轻轻的挑子叶幼苗从发芽板打下根在Jensen的媒介缩影。确保根尖是在与琼脂接触。
4. 温和地去除种皮，如果它仍然存在。在水中浸泡5-10分钟后，种皮要宽松。轻轻挑逗种皮的钳子，直到它让路，并丢弃。芽的子叶和大约0.5厘米应该伸出的U形凹口的在板（ 图4A）。小心用U型缺口的盖子在幼苗更换板的盖子，创建一个门户网站的幼苗（ 图4B）。在水平堆叠搁置板，直到所有的苗都被放在缩影。
5. 使用全苗从外观上可行，并有直每根发芽板。 （如果可能的话，让苗未开封作为替代品刚接种前萎蔫苗使用的一个板块。）
6. 铺设全苗之后，让他们坐在水平Jensen的缩影，而S。根瘤菌接种悬浮液正在准备。

5。 S的 ​​制备根瘤菌接种物悬浮液

1. 检查S。接种后定期苜蓿根瘤菌的文化，以确保它们正在日益增强。经过2天的增长，外径₆₀₀应该是2和4之间。
2. 吸取0.5毫升每一种文化的进入无菌1.5mL管中，离心沉淀。除去上清液。
3. 无论是0.85％无菌氯化钠或无菌超纯水洗涤细胞两次。重悬细胞于0.5ml 0.85％输注液激怒NaCl或超纯水。
4. 衡量一个1/10的稀释悬浮S的外径₆₀₀ 苜蓿根瘤菌从步骤5.3文化。在此基础上的阅读，使每个文化在无菌超纯水中的悬浮液在OD ₆₀₀ = 0.05。如果细胞密度过高，结瘤可能受到抑制。使稀悬浮液足以使100微升可以接种到各幼苗。外径₆₀₀ = 0.05悬挂的云应该只是用肉眼几乎难以察觉。

6。接种和缩影的密封

1. 前已开始接种，检查幼苗枯萎，但没有存活转移到Jensen的媒体缩影。取代那些幼苗从发芽片新鲜的苗。
2. 打开每个缩影，接种100μL的适当的学苜蓿根瘤菌悬挂到幼苗根系。重新装上盖子，并预留水平STAC6-10缩影KS。对于每个S。要比较的根瘤菌菌株，接种至少15家工厂。对于具有共生生产力细微的差别株，接种30-35植物。至少留出10株未接种作为阴性对照。接种30-35植物与S根瘤菌 1021或其他适当的野生型菌株作为阳性对照。
3. 之后，S。根瘤菌悬浮有时间来吸附在根表面和所述悬浮液已经浸透到琼脂（至少20分钟），单独包装每板用石蜡膜。板应包裹起来，以缺口的边缘，但石蜡膜不应该阻止秧苗（ 图4C）的生长。
4. 在包装时，使对于根部附着在板盖内最后的检查。从盖子除去附着的根，奠定了板式平在板凳上，然后点击或轻拂盖子回落敲根到琼脂苏rface。
5. 排队每个堆栈6-10板的幼苗门户。与苗朝上（ 图4D）放置在堆栈成90°角。石蜡膜的粘性将持有的板块在地方足够长的时间来包装箔整个堆栈，留下1-2厘米带解开其中的幼苗出现（ 图4E）。箔将保护根部由轻。
6. 将铝箔包裹堆在一个被点燃的生长室或生长室在21-25°C，60-70％的相对湿度和100-175微摩尔/平方米^{-2 -1}光在16小时光照/ 8小时黑暗周期（ 图1A）。在这些生长条件下，延长培养在光照水平高于200微摩尔/米^{-2 -1}可具有对植物生长产生不利影响。

7。考试根系共生表型的定量

植物可以保持在微生态长达9个星期。

1. 根瘤数目可以在一系列时间点由每一堆块解缠箔和计数结节进行量化。开发植物根瘤接种S.根瘤菌 1021野生型是显而易见的接种后10-14天。
2. 共生的生产率，也可在每个时间点，通过测量出现芽的长度测量。
3. 通常是由分离的拍摄和测量拍摄的鲜重进行7周接种后生产率共生的最后定量。这一步可以迟9周进行，则可较长时间的增长是需要的。

结果

相比，在引言中所述大多数其他方法的这些板微观的制备和接种是相对简单的。利用这些缩影中也允许延长植物生长（9周），无需浇水或营养补充，维护根不育的，既不易检查根和避光保护根系，厂房无约束增长笋，方便前往拍摄的长度测量，并去除植物从有根毛损伤极小的缩影。 图1A显示幼苗生长在微观世界中的孵化器。在图1B-1E显示的图像含有M缩影几种不同?...

讨论

有几个步骤是成功的关键协议：1）用纯化，植物细胞培养的必要性测试琼脂怎么强调也不过分。这不是对苜蓿幼苗关键的，但它是为M的增长的关键蒺藜苜蓿 A17。 2）在步骤1中所述的发芽幼苗上垂直琼脂平板上是很重要的。在一个15毫米深板⁷萌发的幼苗在一个倒置的水平面上的广泛使用的技术是不建议在这个协议，因为幼苗根系将是太短和/或不直。苗2-4厘米长的直线增长的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar purified, plant cell culture-tested	Sigma	A7921