Une seule usine, microcosmes stériles pour la nodulation et la croissance de la plante des légumineuses<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Avec le Rhizobiennes Symbiont<em&gt; Sinorhizobium meliloti</em

Résumé

Croissance des plantes de Medicago truncatula en symbiose avec la bactérie fixatrice d'azote Sinorhizobium meliloti dans des microcosmes individuels stériles fabriqués à partir de plaques de laboratoire standard permet un examen fréquent des systèmes de racines et de nodules sans compromettre la stérilité. Les plantes peuvent être maintenues dans ces chambres de croissance pour un maximum de 9 semaines.

Résumé

Bactéries rhizobium forment symbiotiques, nodules fixateurs d'azote sur les racines des légumineuses hôtes compatibles. L'un des systèmes les modèles les plus développés pour l'étude de ces interactions est la plante Medicago truncatula cv. Jemalong A17 et la bactérie rhizobium Sinorhizobium meliloti 1021. Imagerie répétée des racines des plantes et la notation des phénotypes symbiotiques exige des méthodes qui sont non destructif soit à des plantes ou des bactéries. Les phénotypes symbiotiques de certaines plantes et mutants bactériens deviennent apparents après des périodes relativement courtes de la croissance, et ne nécessitent pas d'observation à long terme de l'interaction hôte / symbiote. Cependant, des différences subtiles dans l'efficacité et la sénescence des nodosités phénotypes symbiotiques qui n'apparaissent pas dans les premiers stades du processus de nodulation nécessitent des périodes de croissance relativement longue avant de pouvoir être reçu. Plusieurs méthodes ont été développées pour la croissance à long terme et de l'observation de ce couple hôte / symbiote.Cependant, beaucoup de ces méthodes nécessitent l'arrosage répété, ce qui augmente la possibilité de contamination par d'autres microbes. D'autres méthodes nécessitent un espace relativement important pour la croissance d'un grand nombre de plantes. La méthode décrite ici, la croissance symbiotique de M. truncatula / S. meliloti dans des microcosmes seule usine stériles, présente plusieurs avantages. Plantes à ces microcosmes ont humidité et les éléments nutritifs suffisants pour assurer que l'arrosage n'est pas nécessaire pour jusqu'à 9 semaines, prévenir la contamination croisée lors de l'arrosage. Cela permet phénotypes à être quantifiés qui pourraient manquer dans les systèmes de croissance à court terme, tels que les retards subtiles dans le développement de nodules et au début de la sénescence des nodosités. En outre, les racines et les nodules dans le microcosme sont facilement visualisables à travers le couvercle de la plaque, de sorte déracinement des plantes pour l'observation n'est pas obligatoire.

Introduction

L'interaction entre la plante hôte de légumineuse Medicago truncatula A17 et la bactérie rhizobium Sinorhizobium meliloti 1021 est l'un des systèmes modèles les plus dociles de l'étude de développement des racines des nodules et symbiose fixatrice d'azote. Les génomes des deux partenaires symbiotiques ont été séquencés et ^1,2 fois l'usine et de la bactérie se prêtent à la manipulation génétique ^3,4. L'analyse des phénotypes de deux plantes et mutants bactériens nécessite la capacité à observer les étapes du développement de nodules et de quantifier la productivité symbiotique avec le temps. Ici, nous décrivons une méthode pour l'observation du développement de nodules de racines de M. truncatula cv. Jemalong A17 inoculées avec S. meliloti 1021 dans des microcosmes individuels fabriqués à partir de standard, diamètre rond de 100 mm, 15 mm plaques de laboratoire profondes (figure 1A). Le tournage est exposée et se développe par le biais d'un portail à encoches dans le côté de la plaque (Figures 1B, 1C, et 1E). Les racines sont contenus dans les microcosmes et maintenues stériles, tout en permettant une observation à travers le couvercle de la plaque (figure 1D). Etant donné que le tournage est accessible, sa croissance n'est pas limitée et elle peut être mesurée à des intervalles périodiques, sans compromettre la stérilité de la racine. La méthode de création de microcosmes-plaque crantée a été initialement développé par Leigh, et ​​al. ⁵ pour la culture de plants de luzerne, mais il n'a pas été largement adopté en dépit de ses nombreux avantages par rapport aux autres méthodes. Une variante de cette méthode a également été développé pour l'analyse de l'interaction entre les racines des plantes et des mycorhizes ^6. Nous avons maintenant conçu et optimisé cette méthode pour la croissance de M. centrales truncatula. Les avantages de ce protocole sur les plus couramment utilisés méthodes sont décrites ci-dessous.

Il existe plusieurs méthodes qui sont actuellement largement utilisés pour les études de nodulation de M. truncatula inoculationlated avec S. meliloti ^7. La méthode la plus couramment utilisée pour la préparation à grande échelle de racinaires est la croissance dans des caissons aéroponique ^7. Dans ce procédé, des plantes sont suspendus au-dessus d'un grand récipient et des racines sont aérées avec un mélange de S. meliloti et solution nutritive ^7. Cette méthode est pratique si un seul génotype de S. meliloti est à tester. Etant donné qu'il nécessite l'aérosolisation des concentrations élevées de bactéries, il existe une forte probabilité de contamination croisée entre les caissons inoculés avec différentes souches bactériennes. Un autre procédé qui est souvent utilisé pour préparer de grandes quantités de plantes inoculées est une croissance dans des bacs ou des pots de la perlite, de la vermiculite, du sable ou de l'argile calcinée qui sont perfusée avec une solution nutritive et on l'inocule avec S. meliloti ^7. Cette méthode nécessite l'utilisation de cuves ouvertes ou des pots, et nécessite un arrosage et de reconstitution de la solution nutritive. Un autre inconvénient de pots est que les plantesdoivent être retirés de cette matrice particulaire à l'examen des racines et des nodules. Un autre inconvénient de cette méthode est qu'une grande partie de l'espace de l'incubateur est nécessaire quand beaucoup différente S. génotypes meliloti sont à comparer, à cause d'un pot séparé doit être utilisé pour chaque génotype bactérien. Le "pot de Leonard" est une variante de cette méthode ^8,9. Un pot Leonard est composé de deux récipients stérilisés empilés l'un au-dessus de l'autre et reliés par une mèche. Le milieu de croissance est placé dans la cuve inférieure et aspiré à travers la mèche par action capillaire dans une matrice de perlite, de la vermiculite, du sable ou de l'argile calcinée dans le récipient supérieur croissance. La plantule (s) sont placés dans la matrice de croissance et inoculées avec S. meliloti. Cette méthode ne nécessite pas d'arrosage, mais l'examen des racines et des nodules exige que la plantule être retiré de la matrice de croissance de particules.

Il existe plusieurs méthodes qui ne permettent examen facile de roots. L'un d'entre eux est la "poche de croissance" de matière plastique transparente ^7. Un inconvénient de cette méthode est que l'arrosage fréquent est nécessaire étant donné que seule ≤ 10 ml de milieu liquide est optimale pour la croissance de M. truncatula dans des sachets ^7. expériences de poche sont également généralement limités à ~ 2 semaines ^7, suite à une panne de la mèche de papier dans la poche. Deux autres méthodes qui sont couramment utilisés sont similaires à notre méthode en ce que les plantes sont cultivées sur gélose et les racines sont visibles, mais ces méthodes ont aussi des inconvénients que notre procédure évite. Dans ces procédés, les plantes sont entièrement contenues dans 24,5 cm x 24,5 cm plaques d'agar scellés autour du sommet avec du ruban adhésif chirurgical poreux ou cultivés dans des tubes de gélose-pente bouchés avec des bouchons de coton ou de bouchons en plastique ^7. Ces deux méthodes permettent examen facile des racines et peut être maintenu stérile. Cependant, les tubes inclinés d'agar-agar sont généralement cultivées avec seulement 20 ml de gélose à moyen ⁷ et nécessitent un arrosage et un nutrimentJOUT pour la croissance à long terme des plantes. Les plantes cultivées dans les 24,5 cm x 24,5 cm agar microcosmes de la plaque ont l'humidité et nutriments pour la croissance à long terme suffisant, mais le tournage de plus en plus devient rapidement limités dans le microcosme de la plaque ci-joint et de l'éthylène gazeux peuvent s'accumuler inhiber la nodulation ^7. Dans la procédure décrite ici, le tournage est exposée et se développe librement en dehors du microcosme qui contient ~ 70 ml de milieu, permettant une croissance à long terme.

Le procédé décrit ici peut être utile non seulement pour l'étude de la nodulation de légumineuses, mais également pour l'étude des phénotypes de racines d'autres plantes de taille moyenne. La différence entre ces microcosmes et un pot traditionnel de culture tissulaire végétale de polycarbonate est que les racines dans des microcosmes de plaques décrits ici se développent sur la surface verticale de l'agar-agar, plutôt que vers le bas dans une couche horizontale de gélose au fond du pot. Cela permet à la racine de se dégager de la surface de la gélose avec un minimum dAMAGE de poils absorbants et l'adhérence de la gélose minimale à la surface de la racine, ce qui facilite l'examen de poils absorbants par microscopie.

Protocole

Effectuer les étapes 1, 2, 4 et 6 dans une hotte à flux laminaire stérile est recommandée.

Une. Préparation de M. truncatula A17 semis

Remarque: M. truncatula A17 graines utilisées dans ces études sont réalisées dans des conditions de serre refroidis à ~ 22 ° C, ou dans une chambre de croissance des plantes maintenue à 22-26 ° C avec ~ 150-400 mmol / m ^-2 s ^-1 lumière.

1. Verser plaques de germination: Utilisez 100 mm plaques carrées (15 mm de profondeur) et verser autoclave 1.1-1.2% p / v purifié agar ¹⁰ à une profondeur de 3-5 mm. Chaque plaque sera utilisé pour germer ~ 0,25-0,5 g de graines (équivalent à 63-125 graines / plaque).
   Remarque: Il est essentiel d'utiliser la culture cellulaire testée, agar purifié des plantes pour toutes les plaques décrites dans le présent protocole. Le vendeur et le numéro de catalogue de l'agar-agar est répertorié dans le tableau des réactifs et des équipements spécifiques.
2. Scarifier / stériliser le M. truncatula A17 semencess: Peser suffisamment de semences pour le nombre désiré de semis. (M. truncatula A17 graines sont ~ 4 mg chacun) Placer les semences stériles dans des flacons de 125 ml avec des couvertures de feuilles stériles (0,25-0,5 g de graines / flacon, ce qui est ~ 63 à 125 graines) et la pipette 20 ml de concentré (96%) H ₂ SO _4, le long des parois du ballon.
   Remarque: la scarification acide permet de stériliser les graines. En outre, l'acide par pipetage le long des parois du ballon, il sera ré-stériliser l'intérieur de la fiole qui a été en contact avec les graines non stérilisées.
3. Briser les mottes de semences avec une pipette en verre stérile. Agiter chaque flacon souvent pour 10-12 min. Petites fosses brunes seront visibles sur les graines. Ce sont de minuscules trous dans le tégument de la graine ^11.
   Remarque: Porter des lunettes de protection et des gants pour travailler avec H ₂ SO ₄ concentré.
4. Retirer H ₂ SO ₄ et rincer les graines: Lorsque au moins 10% des graines ont de petites fosses brun, ou 12 min se sont écoulées, selonvient d'abord, enlever tout l'acide dans les fioles avec une pipette en verre stérile. (Place de l'acide résiduaire dans un bêcher de 1 à 2 L contenant au moins 300 ml d'eau du robinet. Cela diluer l'acide et d'éviter toute surchauffe.) Incliner le ballon pour recueillir l'acide restant dans la courbe de la fiole et en utilisant une petite pipette en verre pour éliminer tout l'acide restant. Si de l'acide résiduel, il réagit avec l'eau de rinçage, chauffer les graines et de les tuer.
   1. Rincer les graines en versant rapidement 100 ml d'eau ultrapure stérile dans chaque fiole. L'excès de volume d'eau va diluer l'acide et d'éviter la surchauffe et de semences dommages pendant la réaction de l'acide avec l'eau. Décanter l'eau et stériliser à la flamme de la lèvre du flacon.
   2. Rincer les graines 8-10x avec 50 ml d'eau ultra-pure stérile. Agiter le ballon lors de chaque rinçage. Le ballon doit être considéré comme stérile à ce point et la lèvre de la bouteille doit être brûlé avant chaque rinçage.
5. Laissez les graines s'imbibent nuit: Après l'dernier rinçage, versez 50 ml d'eau ultra-pure stérile dans chaque flacon, replacez le couvercle de la feuille stérile sur chaque flacon et laisser reposer à 4 ° C dans l'obscurité pendant une nuit.
6. Placer les semences sur la plaque de germination: Après graines laisser s'imprégner de la nuit, verser l'eau, rincer 2x avec ~ 25 ml d'eau ultra-pure, puis ajouter 20 ml d'eau ultra-pure stérile, remous pour remettre en suspension les graines et versez-les sur une plaque de gélose de germination 1.1-1.2% par rapport à l'étape 1.1. Si les graines restent dans le flacon, ajouter de l'eau et verser à nouveau. Distribuer les graines de chaque flacon à une plaque (63 à 125 graines / plaque).
   1. Agiter la plaque de distribuer les semences. Les graines doivent être répartis uniformément dans une bande de 4 à 5 cm, à une extrémité de la plaque. Ce sera le "top" de la plaque. Le "fond" 5-6 cm doit être exempte de graines (figure 2A).
   2. Prélever l'eau avec une pipette stérile. Incliner la plaque à un angle de 45 ° pour permettre à l'écoulement de l'eau restant au fond de la plaque. Remettre le couvercle sur le tilplaque de TED et de protéger de la lumière. Les plaques doivent être autorisés à vider 10-20 min. (Figure 2B).
7. Mettre en place la germination: Retirer toute l'eau qui s'est accumulée au fond de la plaque inclinée avec une pipette stérile.
   1. Remettre le couvercle et sceller la plaque avec du parafilm. Porter des gants et garder stérile (figure 2C).
   2. Empilez les plaques de germination et puis tourner tous vers le haut à un angle de 90 °. Les semences seront couchés sur la surface verticale de l'agar-agar. Graines entièrement imbibés doivent adhérer facilement à l'agar-agar. Les racines se développeront vers le bas (figure 2D).
   3. Enveloppez la pile de plaques de germination dans du papier pour bloquer la lumière et conserver à 25 ° C pendant 3 jours.

Remarque: Si le produit de germination pour moins de 3 jours, les racines peuvent être trop court pour atteindre la gélose dans des microcosmes. Si la germination procède plus de 4 jours avant le transfert des plaques de microcosme, la survie des plantulesêtre pauvre. Si M. écotypes truncatula ou mutants avec plus lents taux de germination sont à comparer, l'écotype lentement germination devrait être autorisé à germer plus de 3 jours.

2. Préparation des microcosmes des plaques individuelles

1. Préparer moyen ¹² (voir le tableau 1 pour la composition), permettant ~ 70 ml de milieu de Jensen pour chaque microcosme. Préparer dans des cruches ou des flacons qui sont pratiques pour la coulée rapide (pas plus de 1-2 L par pichet) et laisser un barreau magnétique dans le pichet pendant l'autoclavage.
   1. Après moyen a refroidi à ~ 55-65 ° C, les suppléments ont été ajoutés et le pH a été contrôlé (voir le tableau 1), verser dans diamètre rond de 100 mm, 15 mm assiettes creuses. Les plaques doivent être versés ~ 0,9-1 cm de profondeur (~ 70 ml / plaque).
   2. Composants de milieu de Jensen peuvent former un précipité nuageux, il est donc important de revenir au lanceur de la plaque d'agitation magnétique périodiquement pour empêcher les composants de décantation. Précipités peuvent être vistible dans la plaque après leur solidification, et à ne pas affecter les performances dans la mesure où ils sont uniformément répartis entre les plaques.
   3. Empiler des plaques au cours de la coulée pour éviter la formation de condensation sur les couvercles des plaques.
2. Après les plaques de Jensen ont solidifié, cochez les deux plaques et couvercles avec une spatule de pesée qui a été plié en forme de U ⁵ (figure 3A). Chauffer le virage de la spatule avec un brûleur jusqu'à rouges chauds, notch 5-6 plaques, puis chauffer à nouveau. Lorsque le couvercle à encoche est placée sur la plaque à encoches, ce qui créera un portail ovale à travers laquelle la tige de la plantule va croître (figure 3B). Si les plaques entaillées doivent être stockés, envelopper individuellement avec un film de paraffine ..

3. Préparation de Sinorhizobium meliloti Cultures

Deux jours avant inoculation de plantes, commencer les cultures de tous les S. meliloti souches à être inoculés sur des plants. Cultures doivent être cultivées dans LBMC (Luria-Bertani [Miller]) moyen ¹³ supplémenté avec 2,5 mM _{MgSO4, CaCl2} 2,5 mM, et les antibiotiques appropriés (milieu TY fonctionne aussi bien). Aussi peu que 2-3 ml de chaque culture seront suffisantes.

1. Croître à 30 ° C avec agitation pendant 2 jours jusqu'à ce que les cellules sont denses.
2. Pour la plupart des inoculations de plantes, la phase de la croissance de S. meliloti n'est pas critique. En règle générale, la fin connecter ou cellules en phase stationnaire début sont utilisés.

4. Mise en M. truncatula semis sur microcosmes individuels

1. Après 3 jours, ouvrez une plaque de germination (préparé à l'étape 1) et rincez-les immédiatement avec de l'eau ultra-pure stérile. Dip forceps dans de l'éthanol et brièvement flamme à stériliser. Utilisez des pinces stériles pour pousser doucement les pointes des racines de tous les plants sous l'eau pour éviter le dessèchement. Les racines vont de 2-6 cm de long. La majorité sera de 3-4 cm. Sélectionnez plants à racines droites et pas évidentedéfauts.
2. Vérifier les couvercles des microcosmes moyennes de la Jensen pour l'accumulation de condensation. Basculez le couvercle pour éliminer la condensation ou le remplacer par un nouveau couvercle cranté. Si il ya un excès de condensation sur le couvercle, la racine de semis peut adhérer au couvercle puis mourir après la condensation sèche.
3. En utilisant les forceps, ramasser délicatement un semis de la plaque de germination par les cotylédons et était la racine sur un milieu microcosme d'un Jensen. Assurez-vous que l'extrémité de la racine est en contact avec l'agar-agar.
4. Retirez délicatement le tégument de la graine si elle est toujours présente. Les enveloppes devraient être lâche après trempage dans l'eau pendant 5-10 min. Doucement taquiner le tégument de la graine avec la pince jusqu'à ce qu'il cède, et le jeter. Les cotylédons et environ 0,5 cm de tournage doivent faire saillie hors de l'échancrure en U dans la plaque (figure 4A). Replacez soigneusement le couvercle de la plaque avec le U-encoche du couvercle sur le semis, la création d'un portail pour le semis (figure 4B).Réglez plaques de côté en piles horizontales jusqu'à ce que tous les plants ont été placés sur des microcosmes.
5. Utilisez tous les plants de chaque plaque de germination que regarder viable et avoir une racine droite. (Si possible, laissez une plaque de semis fermés à utiliser en remplacement des plants flétris juste avant l'inoculation.)
6. Après la pose de tous les plants, leur permettre de s'asseoir sur les microcosmes de l'horizontale Jensen alors que le S. suspensions d'inoculum meliloti sont en cours de préparation.

5. Préparation de S. meliloti inoculum Suspensions

1. Vérifiez S. meliloti cultures périodiquement après l'inoculation pour être sûr qu'ils sont de plus en plus. Après une croissance de 2 jours, la DO ₆₀₀ doit être comprise entre 2 et 4.
2. Pipette 0,5 ml de chaque culture dans un tube de 1,5 ml stérile et centrifuger pour sédimenter. Retirer le surnageant.
3. Laver les cellules deux fois dans les deux 0,85% de l'eau stérile ultrapure NaCl ou stérile. Remettre les cellules dans 0,5 ml de 0,85% sterile NaCl ou de l'eau ultra-pure.
4. Mesurer la DO ₆₀₀ d'une dilution 1/10 de remise en suspension S. meliloti cultures de l'étape 5.3. Sur la base de cette lecture, faire une suspension de chaque culture dans l'eau ultra-pure stérile à DO ₆₀₀ = 0,05. Si la densité de cellules est trop élevée, la formation de nodules peut être inhibée. Faire suffisamment de la suspension diluée de sorte que 100 pl peuvent être inoculées sur chaque plant. Le trouble de la DO ₆₀₀ = 0,05 suspension devrait être à peine perceptible à l'oeil.

6. Inoculation et scellement des microcosmes

1. Immédiatement avant inoculations compter, vérifier les plants flétris qui n'ont pas survécu au transfert de microcosmes moyennes de la Jensen. Remplacez les plants avec des plants frais à partir de plaques de germination.
2. Ouvrez chaque microcosme et inoculer 100 ml de l'S. approprié meliloti suspension sur la racine des plantules. Remettre le couvercle et mettre de côté dans STAC horizontaleks de 6-10 microcosmes. Pour chaque S. souche meliloti à comparer, ensemencer au moins 15 plantes. Pour les souches qui ont des différences subtiles dans la productivité symbiotique, inoculer 30-35 plantes. Laissez au moins 10 plantes non inoculées comme contrôle négatif. Inoculer 30-35 plantes avec S. meliloti 1021 ou d'une autre souche de type sauvage approprié pour servir de contrôle positif.
3. Après l'S. suspension meliloti a eu le temps de s'adsorber sur la surface de la racine et le liquide de suspension a trempé dans la gélose (au moins 20 min.), envelopper individuellement chaque plaque avec un film de paraffine. Les plaques doivent être enveloppés au bord de l'encoche, mais le film de paraffine ne doivent pas bloquer la croissance de la plantule (figure 4C).
4. Au moment de l'emballage, faire un contrôle final pour les racines ont adhéré à l'intérieur du couvercle de plaque. Pour enlever les racines adhéré du couvercle, poser la plaque à plat sur le banc et tapez ou feuilleter le couvercle de frapper la racine vers le bas sur la gélose surface.
5. Alignez les portails de semis de chaque pile de plaques 6-10. Placez la pile à un angle de 90 ° avec les plants pointant vers le haut (figure 4D). La rigidité du film de paraffine tiendra les plaques en place assez longtemps pour envelopper toute la pile en papillote, en laissant une bande de 1-2 cm déballé où les plantules apparaissent (figure 4E). Le film sera de protéger les racines de la lumière.
6. Placez les feuilles enveloppé piles dans une chambre de croissance éclairée ou chambre de croissance à 21-25 ° C, 60-70% d'humidité relative et 100-175 pmol / m ^-2 s ^-1 lumière sur un cycle de 16 heures de lumière sombre / 8 h ( Figure 1A). Dans ces conditions de croissance, une incubation prolongée à des niveaux de lumière supérieure à 200 umol / m ^-2 s ^-1 peut avoir un effet néfaste sur la croissance des plantes.

7. Examen des systèmes de racines et quantification des phénotypes symbiotiques

Les plantes peuvent être maintenus enmicrocosmes pour jusqu'à 9 semaines.

1. nombre de nodules peut être quantifiée à une série de points de temps par déballer la feuille de chaque pile et comptage des nodules. Développer des nodules sur les plantes inoculées avec S. meliloti 1021 de type sauvage sont apparents par 10-14 jours après l'inoculation.
2. Productivité symbiotique peut également être mesurée à chaque point de temps en mesurant la longueur de la tige émergente.
3. Quantification finale de la productivité symbiotique est généralement effectuée à 7 semaines après l'inoculation en détachant le tournage et la mesure du poids frais de la pousse. Cette étape peut être réalisée aussi tard que si plus de 9 semaines de croissance est souhaitée.

Résultats

La préparation et l'inoculation de ces microcosmes de la plaque est relativement simple par rapport à la plupart des autres méthodes décrites dans l'introduction. L'utilisation de ces microcosmes permet également la croissance des plantes prolongée (jusqu'à 9 semaines) sans arrosage ou suppléments nutritionnels, maintien de la stérilité de la racine, à la fois faciliter l'examen des racines et de la protection des racines de la lumière, la croissance sans contrainte de la plante tire, un ...

Discussion

Il ya plusieurs étapes du protocole qui sont essentiels pour le succès: 1) La nécessité d'utiliser, plante de culture cellulaire purifié testé agar ne peut pas être surestimée. Ce n'est pas critique pour plantules de luzerne, mais il est essentiel pour la croissance de M. truncatula A17. 2) Il est important de faire germer les semis sur des plaques d'agar vertical, comme décrit à l'étape 1. La technique largement utilisée de la germination des plants sur une surface horizontale inver...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar purified, plant cell culture-tested	Sigma	A7921