Nodülasyona ve Baklagil Bitki Büyüme için tek-bitki, Steril Mikrokozmoslar<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; Rhizobial Symbiont ile<em&gt; Sinorhizobium meliloti</em

Özet

Standart laboratuvar plakalardan yapılmış bireysel, steril mikrokosmlarından yılında azot bağlayıcı bakteriler Sinorhizobium meliloti ile simbiyoz Medicago truncatula bitkilerin büyüme ödün vermeden, sterilite kök sistemleri ve nodüller sık muayene izin verir. Bitkiler kadar 9 hafta boyunca bu büyüme odalarına korunabilir.

Özet

Rhizobial bakteriler uyumlu ana baklagil bitkilerin kökleri üzerinde simbiyotik azot sabitleme nodül oluşturur. Bu etkileşimleri çalışmak için en iyi gelişmiş bir model sistemleri Medicago cv truncatula bitkidir. Jemalong A17 ve rhizobial bakteri Sinorhizobium meliloti 1021. Bitki kökleri ve simbiyotik fenotipleri puanlama tekrarlanan görüntüleme bitki veya bakteri birine tahribatsız yöntemleri gerektirir. Bazı bitki ve bakteriyel mutantlann simbiyotik fenotipleri büyüme göreceli olarak kısa bir süre sonra belirgin hale gelir ve ana / symbiont etkileşiminin uzun süreli takip gerektirmez. Bu atılır Ancak, önce nodülasyon sürecinin erken aşamalarında belirgin değildir simbiyotik verim ve nodül yaşlanma fenotipleri ince farkları nispeten uzun bir büyüme dönemleri gerektirmektedir. Çeşitli yöntemler, uzun vadeli büyüme ve bu ana / symbiont çiftinin gözlem için geliştirilmiştir.Ancak, bu yöntemleri birçok diğer mikroplar tarafından bulaşma olasılığını arttırır tekrarlanan sulama gerektirir. Diğer yöntemler bitkilerin çok sayıda büyüme için nispeten büyük bir alan gerektirir. Bir yöntem olup, burada M. simbiyotik büyüme tarif truncatula / S. steril, tek bitki microcosms in meliloti, birçok avantajı vardır. Bu mikrokosmlarından Bitkiler bu sulama sulama sırasında çapraz bulaşmayı önlemede kadar 9 hafta boyunca gerekli değildir sağlamak için yeterli nem ve besin var. Bu fenotipleri Bu nodül gelişimi ve erken nodül yaşlanmasında ince gecikmeler gibi kısa-vadeli büyüme sistemleri, kaçırmış olabileceğini sayısal sağlar. Up-köklenme gözlem için bitkilerin gerekli değildir bu yüzden de, insan olarak kökleri ve nodüller kolayca, levha kapak aracılığıyla izlenir.

Giriş

Baklagil konak bitki Medicago truncatula A17 ve Sinorhizobium 1021 meliloti rhizobial bakteri arasında etkileşim kök nodül gelişimi ve azot sabitleme ortak yaşam çalışma için en uysal bir model sistemlerinden biridir. Her iki simbiyotik ortakların genomları ^1,2 dizilendi ve bitki ve bakteri hem genetik manipülasyon ^3,4 mükellef bulunmaktadır. Bitki ve bakteri mutantlar hem fenotipleri Analizi nodül gelişme aşamalarını gözlemlemek ve zamanla simbiyotik verimliliğini ölçmek için yeteneği gerektirir. Burada M. kök nodül gelişme gözlem için bir yöntem tarif cv truncatula. S ile aşılandı Jemalong A17 standart, yuvarlak 100 mm çapında, 15 mm derinliğinde laboratuar plakaları (Şekil 1A) yapılan bireysel mikrokosmlarından içinde meliloti 1021. Sürgün plakanın tarafında çentikli bir portal (aracılığıyla maruz ve büyür Figüres 1B, 1C ve 1 E). Kökler microcosms içinde bulunan ve plaka (Şekil 1D) ve kapak boyunca gözlem izin verirken, steril tutulur. Sürgün erişilebilir olduğu için, büyüme kısıtlı değildir ve bu kök sterilitesini ödün vermeden periyodik aralıklarla ölçülebilir. Çentikli plaka Mikrokozmoslar oluşturma yöntem aslında yonca büyüyen bitkiler için Leigh, vd. ⁵ tarafından geliştirilen, ancak yaygın olarak diğer yöntemlere göre birçok avantajları rağmen kabul edilmedi. Bu yöntemin bir varyasyonu, aynı zamanda bitki köklerine ve mikorhizalların ⁶ arasındaki etkileşimin analizi için geliştirilmiştir. Şimdi M. büyümesi için uyarlanmış ve bu yöntemi optimize truncatula bitkiler. Daha yaygın olarak kullanılan yöntemlere göre bu protokol avantajları aşağıda tarif edilmektedir.

M. nodülasyon çalışmalar için geniş şu anda kullanımda olan birkaç yöntem vardır truncatula inocuS. ile lated meliloti ^7. Nodulated köklerin büyük ölçekli hazırlanması için en yaygın olarak kullanılan yöntem aeroponic kesonların ⁷ de büyüme. Bu yöntemde, bitki büyük bir kap üzerine asılır ve kökleri S. oluşan bir karışım ile havalandınlır meliloti ve besleyici çözelti ^7. Bu yöntem pratik ise S. tek bir genotip meliloti, test edilecek olan. Bu bakterilerin yüksek konsantrasyonlarda aerosol haline gerektirdiğinden, farklı bakteri türleri ile aşılanmış kesonlar arasında çapraz kontaminasyon yüksek bir olasılıktır. Genellikle aşılanmış bitkilerin büyük miktarlarını hazırlamak için kullanılan diğer bir yöntem küvet veya perlit, vermikülit, kum veya besleyici çözelti ile aşılanmış ve S ile aşılanır kalsine kil tencere büyüme meliloti ^7. Bu yöntem, açık tüplerde veya tencere kullanımını gerektirir, ve besin çözeltisi sulama ve ikmal gerektirir. Tencere bir diğer dezavantajı olduğu bitkikökler ve nodüllerin incelenmesi için bu parçacık matris çıkarılmalıdır. Bu yöntemin diğer bir sakıncası olduğunda pek çok farklı S. kuluçka alanı geniş bir alan gerekli olmasıdır meliloti genotip ayrı bir kap her bir bakteri genotip için kullanılmalıdır, çünkü karşılaştırılabilir vardır. "Leonard kavanoz" Bu yöntem, ^8,9 üzerinde bir çeşididir. A Leonard kavanoz diğerinin üstüne yığıldığında ve bir fitil birbirine bağlanan iki steril kapların oluşmaktadır. Büyüme ortamı, alt kabına yerleştirilir ve perlit, vermikülit, kum ya da üst tekne içinde kalsine kil büyüme matris içine kılcal hareket ile lamba fitili üzerinden çekilmektedir. Fide (ler) büyüme matris içine yerleştirilmiş ve S ile aşılanmıştır meliloti. Bu yöntem, sulama gerektirmez, fakat kök ve nodüllerin inceleme fide parçacık büyüme matris kaldırılması gerekir.

Roo kolay muayene izin vermeyiz birkaç yöntem vardırts. Bunlardan biri, saydam plastik "büyüme poşet" ^7'dir. Bu yöntemin bir dezavantajı, sık sulama sıvı ortam M. büyüme için uygun olan tek ≤ 10 ml Başlangıcı gerekli olmasıdır torbalar ^7'de truncatula. Kese deneyler genellikle nedeniyle torba içindeki kağıt fitilin arıza, ~ 2 hafta ⁷ ile sınırlıdır. Yaygın olarak kullanılan diğer iki yöntem bitki agarı üzerinde büyümüş ve kökleri görebilir olduğu bizim yönteme benzer, ancak bu yöntemler aynı zamanda işlemdir önler dezavantajları vardır. Bu yöntemlerde, bitkiler tamamen 24.5 cm gözenekli bir ameliyat bandı ile üst çevresinde kapatılmış veya pamuk tıpalı ya da plastik kapaklar ^7-tıpalı agar eğik tüpler içinde yetiştirilen x 24.5 cm agar plakaları içinde yer alır. Bu yöntemlerin her ikisi de köklerin kolayca incelenmesine olanak ve steril tutulabilir. Ancak, agar eğimli tüpleri genellikle orta ⁷ ağar sadece 20 ml ile yetiştirilen ve sulama ve besin a gerektirirBitkilerin uzun-vadeli büyüme için ddition. 24.5 cm içinde yetiştirilen bitkiler 24,5 cm agar mikrokozmosları yeterli nemi ve uzun vadeli büyüme için besin var, ama büyüyen sürgün hızla kapalı plaka evren ve etilen gazı Nodülasyona ⁷ inhibe kurabilirsiniz içinde kısıtlı olur x. Burada tarif edilen prosedür olarak, sürgün maruz kalır ve uzun süreli büyüme sağlayan, ~ 70 ml ortam içeren evren dışına serbestçe büyür.

Burada tarif edilen prosedür baklagil bitkileri nodülasyon çalışma için değil, aynı zamanda, diğer orta boy bitkilerin kök fenotiplerinin incelenmesi için de yararlı olabilir. Bu microcosms ve geleneksel bir polikarbonat bitki dokusu kültürü kavanoz arasındaki fark, burada tarif edilen plaka microcosms kökleri aşağı kavanozun altındaki agar yatay bir tabaka halinde agar dikey yüzeyi üzerinde büyümeye yerine olmasıdır. Bu kök minimal d agar yüzeyinden kaldırılması sağlar:kök tüyleri ve mikroskopi ile kök tüyleri incelenmesini kolaylaştıran kök yüzeyine, agar minimal yapışmasına Amage.

Protokol

Adımların gerçekleştirilmesi 1, 2, 4, ve steril bir laminar akış başlığı içinde 6 önerilir.

1.. M. hazırlanması truncatula A17 Fideler

Not: M. Bu çalışmalarda kullanılan truncatula A17 tohumlar 22 ° C ° 'de veya ~ 150-400 mmol / ^m-2 s ^-1 ışık ile 22-26 ° C de muhafaza edilen bir bitki büyüme odasında soğutuldu, sera koşulları altında üretilmektedir.

1. Tohum çimlenme plakaları dökün: 100 mm kare plakaları (derinlik 15 mm) kullanın ve 3-5 mm derinliğe kadar ¹⁰ ağar arıtılmış w / v otoklava 1.1-1.2% dökün. Her bir plaka (63-125 tohum / plaka eşdeğeri) tohum ~ 0,25-0,5 g çimlenmeye kullanılacaktır.
   Not: Bu protokolde tarif edilen tüm levhalar için bitki hücre kültür içinde test edilmiş, arıtılmış, agar kullanımı için çok önemlidir. Agar için satıcı ve katalog numarası bilgileri özel reaktifler ve ekipman Tablo listelenir.
2. Kanatın / M. sterilize truncatula A17 tohums: fidan istenilen sayıda için yeterli tohum tartılır. (, Bu ~ 63-125 tohumu 0,25-0,5 g tohum / şişe) ve pipet konsantre edildi (% 96) 20 ml steril folyo kapakları ile steril 125 ml şişelere yer tohumları (M. A17 tohumları, ~ 4 mg olan truncatula) H ₂ SO şişenin yanları boyunca _4.
   Not: Asit scarification tohum sterilize edecek. Aynı zamanda, şişenin yanları boyunca asit pipetleme, bu sterilize edilmemiş tohumları ile temas halinde olan şişenin içine yeniden sterilize olacaktır.
3. Steril bir cam pipet ile tohum öbekler kırmak. 10-12 dakika boyunca sık sık, her şişe döndürülür. Küçük, kahverengi çukurları tohumlar üzerinde görünür hale gelecektir. Bu tohum kat ¹¹ küçük delikler vardır.
   Not: SO ₄ konsantre H ₂ ile çalışırken koruyucu gözlük ve eldiven giyin.
4. SO ₄ H ₂ çıkarın ve tohum durulama: tohumların en az% 10, küçük kahverengi çukurları ya da 12 dk olduğunda geçti, hangisiilk olarak söz konusu olduğunda, steril bir cam pipet ile şişelerden ALL asiti çıkarmak. (En az 300 ml musluk suyu ihtiva eden bir 1-2 L behere yer atık asit elde edildi. Bu seyreltik asit ve aşırı ısınmayı önler. Doyurmaya) şişenin eğrisinde kalan asidi toplamak için şişeyi yatırın ve küçük bir cam pipet için kullanımı Tüm geri kalan asidi çıkarmak. Kalan asit kalırsa, bu, durulama su ile reaksiyona tohumları ısıtmak ve onları öldürecek.
   1. Hızlı bir şekilde her şişeye steril aşırı saf su ve 100 ml dökülerek tohum durulayın. Suyun fazla hacmi seyreltik asit ve su ile asidin reaksiyonu esnasında aşırı ısınma ve tohum zarar görmesini engeller. Su dökün ve şişenin dudak alev sterilize edin.
   2. Steril aşırı saf 50 ml su ile tohum 8-10x durulayın. Her durulama sırasında şişeyi girdap. Şişe bu noktada steril olduğu kabul edilmelidir ve şişenin her bir dudak durulama önce yakılmış olmalıdır.
5. Tohumlar gecede öğrenmek edelim: Mesaison durulama, gece boyunca karanlıkta 4 ° C de, her bir kaba ve bir yere steril folyo kapağı yerine, her bir şişeye 50 ml steril saf su dökün.
6. Çimlenme tabakta Yeri tohumları: icar tohumları gecede öğrenmek sonra, tohum tekrar süspansiyon ve bir 1.1-1.2% agar çimlenme plaka üzerine dökmek için 20 ml steril saf su, girdap eklemek sonra, ~ 25 ml saf su ile 2x yıkayın, suyu dökün 1.1 adım. Tohum şişe içinde kalır, daha fazla su ilave edin ve tekrar dökün. Her bir şişeden bir plaka (63-125 tohum / plaka) için tohum dağıtın.
   1. Tohum dağıtmak için plaka çalkalanır. Tohumlar, plakanın bir ucunda bir 4-5 cm bandında eşit dağıtılmalıdır. Bu plakanın "üst" olacaktır. "Alt", 5-6 cm (Şekil 2A) Tohumların serbest tutulmalıdır.
   2. Steril bir pipet ile suyu çizin. Plakanın altına kalan su tahliye etmek için bir 45 ° açıyla plaka eğin. Til üzerindeki kapağı değiştirinted plakası ve ışıktan korumak. Plakalar, 10-20 dakika boşaltmak için izin verilmelidir. (Şekil 2B).
7. Çimlenmesini kurmak: Steril bir pipet ile eğik plakanın altındaki topladığı tüm suyunu çıkartın.
   1. Kapağı takın ve parafilm plaka mühür. Eldiven giyin ve (Şekil 2C) steril tutmak.
   2. Çimlenme plakaları yığını ve daha sonra bir 90 ° açıyla hepsini açmak. Tohumlar agar dikey yüzey yatan olacaktır. Tamamen emdirilmiş tohumlar kolaylıkla ağar uymalıdır. Kökleri aşağıya doğru (Şekil 2B) artacak.
   3. Işığı bloke eder ve 3 gün boyunca 25 ° C'de tutmak için folyo çimlenme plakaların yığınını sarın.

Not: en az 3 gün boyunca çimlenme gelirleri ise, kökleri mikrokosmlarından yılında agar ulaşmak için çok kısa olabilir. Çimlenme daha 4 gün evren plakaları aktarılmadan önce devam ederse, fidelerin hayatta olacakfakir. Eğer M. daha yavaş çimlenme oranları ile truncatula ekotipler veya mutantlan karşılaştırılacak olan, yavaş yavaş filizlenen ekotip 3 günden daha fazla çimlenme izin verilmelidir.

2. Bireysel Plate microcosms hazırlanması

1. Her mikrokozmosu için Jensen orta ¹² (kompozisyon bkz. Tablo 1), izin ~ 70 ml ortamı hazırlayın. Için uygundur sürahi veya şişeler içinde hazırlayın hızlı dökme (sürahi başına en fazla 1-2 L) ve otoklav sırasında sürahi bir manyetik karıştırma çubuğu bırakın.
   1. Orta ~ 55-65 ° C, takviyeleri ilave edilmiştir soğuyana ve pH (bkz. Tablo 1) kontrol edildikten sonra, yuvarlak 100 mm çaplı içine 15 mm derin plakaları dökün. Tabaklar ~ 0,9-1 cm derinliğinde (~ 70 ml / plaka) dökülmelidir.
   2. Jensen ortamının bileşenleri bulanık bir çökelti meydana getirebilir, bu nedenle yerleştikten bileşenleri önlemek için periyodik olarak manyetik karıştırma plakasına sürahi dönmek için önemlidir. Çökeltiler vis olabilirkatılaşma sonra plakadaki bağdaş ve sürece eşit plakalar arasında dağıtılır olarak performansını etkilemez.
   3. Plaka kapaklarındaki yoğuşma oluşumunu önlemek için dökme sırasında plakaları yığını.
2. Jensen plakaları katılaşan sonra, bir U-şekilli ⁵ (Şekil 3A) bükülmüş olan bir tartı spatula ile iki tabak ve kapaklar çentik. Kırmızı sıcak, çentik 5-6 plakalar kadar bir brülör ile spatula bend ısıtın ve sonra tekrar ısı. Çentikli kapak çentikli plakası üzerine yerleştirilir, bu fidenin ateş (Şekil 3B) artacak, üzerinden bir oval portal oluşturacaktır. Çentikli plakaları saklanacak ise, parafin film ile ayrı ayrı sarın ..

3. Sinorhizobium meliloti hazırlanması Kültürleri

İki gün bitki inokulasyonlarda önce, tüm S. kültürleri başlar meliloti fideleri üzerine inoküle edilecek suşları. Cultures LBMC 2.5 mM MgSO _4, 2.5 mM _CaCI2, ve uygun antibiyotikler (TY ortam ayrıca iyi çalışır) ile desteklenmiş (Luria-Bertani [Miller]) ortamı içinde ¹³ yetiştirilmelidir. Her kültürün az 2-3 ml yeterli olacaktır.

1. Hücreler yoğun kadar 2 gün boyunca çalkalanarak 30 ° C'de büyür.
2. Çoğu bitki aşıları için, S. büyüme fazı meliloti kritik değildir. Tipik olarak, geç log ya da erken durağan faz hücreleri kullanılır.

4. M. dışarı atarken Bireysel Mikrokozmoslar üzerinde truncatula Fideler

1. 3 gün sonra, (aşama 1 'de hazırlanan) bir çimlenme plakası açık ve derhal steril aşırı saf su ile sel. Dip etanol ve sterilize etmek alev kısaca forseps. Hafifçe kurumasını önlemek için su altında tüm fidan kök ipuçları itmek için steril forseps kullanın. Kökleri uzun 2-6 cm arasında değişmektedir. Çoğunluk 3-4 cm olacaktır. Düz kökleri ve hiçbir belirgin ile fidan seçindefektleri.
2. Yoğuşma birikmesi için Jensen orta mikrokosmlarından kapaklarını kontrol ediniz. Yoğunlaşma kaldırmak veya yeni bir çentikli kapak ile değiştirmek için kapağı hafifçe vurun. Kapağın üzerinde yoğunlaşma fazlalığı varsa, fide kök kapağa yapışabilir ve yoğunlaşma kuruduktan sonra daha sonra ölür.
3. Forseps kullanarak, hafifçe kotiledonlarının tarafından çimlenme plakadan bir fide almak ve Jensen orta mikrokozmos üzerindeki kök yatıyordu. Kök ucu agar ile temas halinde olduğundan emin olun.
4. Hala mevcut olup olmadığını nazikçe tohum kat kaldırmak. Tohum kabukları 5-10 dakika boyunca suda ıslatıldıktan sonra gevşek olmalıdır. Yavaşça yol verir kadar forseps ile tohum ceket kızdırmak, ve atın. Sürgün Kotiledonlar ve yaklaşık olarak 0.5 cm plaka (Şekil 4A) 'de U-çentik üzerinden çıkıntı gerekir. Dikkatlice fide (Şekil 4B) için bir portal oluşturma, fidenin üzerinde kapağın U-çentik ile plaka kapağı yerine takın.Tüm fidanları mikrokosmlarından konuldu kadar yatay yığınlar kenara tabak ayarlayın.
5. Canlı bakmak ve düz bir kök var her çimlenme plaka tüm fide kullanın. (Mümkünse, hemen aşılamadan önce solmuş fide için yedek olarak kullanmak için açılmamış fidelerin bir tabak bırakın.)
6. Tüm fidan dışarı atarken sonra, onları yatay Jensen mikrokosmlarından oturmak için izin verirken S. meliloti inokulum süspansiyonlar hazırlanmaktadır.

5. S. hazırlanması meliloti Aşı Cezalı

1. S. edin onlar büyüyor emin olmak için periyodik aşılamadan sonra kültürleri meliloti. 2 günlük bir büyümeden sonra, OD ₆₀₀ 2 ve 4 arasında olmalıdır.
2. Pipet steril bir 1.5 ml tüp ve pelet için santrifüje her bir kültür 0.5 ml. Süpernatantı.
3. % 0.85 NaCl veya steril aşırı saf, steril su içinde ya da hücreler, iki kez yıkayın. 0.5 ml% 0,85 ste hücrelerin yeniden süspanseNaCl veya saf su kızdırmak.
4. S. yeniden süspansiyon haline getirilmiş bir 1/10 sulandırma OD ₆₀₀ ölçün adım 5.3 den kültürleri meliloti. Bu okuma göre, OD ₆₀₀ = 0.05 steril aşırı saf su içinde her bir kültürün bir süspansiyon elde etmek. Hücre yoğunluğu çok yüksekse, nodülasyon inhibe edilebilir. 100 ul her bir fide üzerine aşılanır, böylece seyreltik süspansiyonun yeterince olun. OD ₆₀₀ = 0.05 süspansiyon bulutluluk gözle zar zor algılanabilir olmalıdır.

6. Aşılama ve mikrokosmlarından Sızdırmazlık

1. Hemen öncesinde başlayan İnokülasyonlara, Jensen orta mikrokosmlarından için transferi hayatta değil soldu fidelerin kontrol edin. Çimlenme plakalardan taze fidan olan fidan değiştirin.
2. Her evren açın ve uygun S. 100 ul aşılamak fide kök üzerine süspansiyon meliloti. Kapağı takın ve yatay istiflenmiş kenara koyun6-10 mikrokosmlarından ks. Her S. meliloti gerginlik karşılaştırıldığında olmak, en az 15 bitki aşılamak. Simbiyotik verimlilik ince farklar var suşları için, 30-35 bitkiler aşılamak. Bir negatif kontrol olarak, aşılanmamış en az 10 bitkiler bırakın. S. ile 30-35 bitkiler inoküle meliloti 1021 veya diğer uygun doğal tipte suş, pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir.
3. Sonra, S. meliloti süspansiyon, kök yüzeyi üzerine adsorbe etmek için zaman oldu ve süspansiyon, sıvı, agar (en az 20 dak.) içine batırılmış, parafin film ile her bir levha sarın. Tabaklar çentik çok kenarına sarılmış olmalı, ancak parafin filmi fide (Şekil 4C) büyümesini engellemek gerekir.
4. Sarma sırasında, plaka kapağın içine yapıştırılmış kökleri için bir kez kontrol edin. , Kapaktan yapışmış kökleri kaldırın bankta düz plaka yatıyordu ve ağar su üzerine tekrar aşağı kök vurmak için kapağı dokunun veya fiskerface.
5. 6-10 plakaların her yığınının fide portalları hizaya. Fide (Şekil 4D) yukarı işaret eden bir 90 ° açıyla yığını yatıyordu. Parafin filmin yapışkanlığı fideleri (Şekil 4E) ortaya çıktığı açılmamış bir 1-2 cm şerit bırakarak folyo yığının tamamını sarmak için yeterince uzun levhaları yerinde tutacaktır. Folyo ışıktan kökleri koruyacaktır.
6. (16 saat ışık / 8 saat karanlık döngüsünde 21-25 ° C,% 60-70 nispi nem ve 100-175 umol / ^m-2 s ^-1 ışık ışıklı bir büyütme odası ya da büyüme odasında folyo sarılmış yığınları yerleştirin Şekil 1A). Bu büyüme koşulları altında, ışık seviyelerinde uzun kuluçka daha yüksek 200 mol / m ^-2 s ^-1 bitki büyümesi üzerinde zararlı etkisi olabilir.

7. Kök Sistemleri ve Simbiyotik fenotipleri Nicel İncelenmesi

Bitkiler korunabilirkadar 9 hafta boyunca mikrokozmosları.

1. Nodül sayısı her yığından folyo açılması ve nodüller sayarak zaman noktalarının bir dizi de belirlenebilir. S ile aşılanmış bitkilerdeki nodülleri geliştirilmesi meliloti 1021 vahşi tip aşılamadan sonra 10-14 gün daha belirgindir.
2. Symbiotic verimliliği de ortaya çıkan sürgünün uzunluğunun ölçülmesi ile, her bir zaman noktasında ölçülebilir.
3. Simbiyotik verimlilik Final miktarlandınlması genellikle ateş ayırma ve sürgün taze ağırlığını ölçerek aşılamadan sonra 7 hafta gerçekleştirilir. Daha fazla büyüme isteniyorsa, bu adım olarak geç 9 hafta gibi gerçekleştirilebilir.

Sonuçlar

Bu plaka mikrokosmlarından hazırlanması ve aşı Giriş bölümünde anlatılan çok diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında oldukça basittir. Bu mikrokosmlarından kullanımı da sulama veya besin takviyesi, kök sterilite bakım, hem de kökleri ve ışıktan köklerinin korunması kolay muayene olmadan (9 haftaya kadar) uzun süre bitki gelişimini sağlar, bitkinin büyümesi için serbest çekimine, kolay erişim vuruyor uzunluk ölçümü ve kök tüyleri minimal hasar ile mikrokosmlarından bitkileri...

Tartışmalar

Başarı için kritik olan protokolün birçok adım vardır: 1) saflaştırılmış, bitki hücre kültürü kullanarak gerekliliği ağar gereğinden fazla vurgulanan olamaz test. Bu, alfalfa fideleri için kritik öneme sahip değildir, ancak M. büyümesi için çok önemlidir truncatula A17. 2) Aşama 1 'de tarif edildiği gibi, dikey agar plakaları üzerinde fide çimlenme için önemlidir. Fide kökleri düz çok kısa ve / veya değil, olacak çünkü 15 mm derin bir plaka ⁷ ter...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar purified, plant cell culture-tested	Sigma	A7921