减少伊曲康唑的浓度和持续时间是成功的治疗<em&gt; Batrachochytrium壶菌</em&gt;感染两栖动物

摘要

Batrachochytrium壶菌感染两栖动物可以使用缩小浓度（0.0025％）和伊曲康唑的持续时间较短（5分钟浴六天），比一般用被淘汰。采用这种改性的治疗方案更少的死亡率和较少副作用进行观察。

摘要

两栖动物遇到任何脊椎动物类的最大跌幅和这些下降的主要原因是真菌病原体，Batrachochytrium壶菌（BD），从而导致疾病的壶菌病。圈养保证菌落受威胁的两栖动物物种的重要全球范围内，可为那些面临灭绝的关键威胁的唯一生命线。维持无病殖民地，是圈养管理者优先级，为所有物种和整个生命阶段还没有安全有效的治疗方法尚未确定。最广​​泛使用的化学治疗是伊曲康唑，尽管通常使用的剂量可能是有害的一些个体和物种。我们进行了临床治疗试验，以评估伊曲康唑的低，但更安全有效剂量是否能找到治愈波特感染。我们发现，从0.01-0.0025％，减少了治疗浓度，减少治疗时间从115分钟浴-6日，青蛙可以用较少的副作用，减少治疗相关死亡率治愈波特感染。

引言

两栖类动物正在经历的所有脊椎动物类群¹的生物多样性的最大跌幅。壶菌病，引起壶真菌病原体Batrachochytrium壶菌（BD）一种皮肤疾病，是这些戏剧性的下滑²的主要原因之一波特是最糟糕的病原体上记录造成生物多样性丧失。它感染了600种两栖动物和有造成下跌超过300种，其中有多达200种已成为极度濒危或灭绝^2,3。两栖动物壶菌是不特定于主机的，目前尚不清楚什么样的素质的主机允许波特感染进步导致严重的疾病。壶菌病引起的死亡通过破坏离子通道的皮肤，造成电解质损失和心脏衰竭^4。此外， 屋宇署上清液（不含波特游动孢子），导致蝌蚪的免疫反应⁵ leadin克研究者认为波特产生的副产品⁶有毒。

由于许多物种正在迅速下降，俘虏保证殖民地和育种计划是重要的保护措施，并可能对某些物种的唯一生命线。建立和维持无病殖民地，是两栖动物管理设施是一个挑战。目前的化疗方法治疗波特感染，虽然有效，可能会损害正在接受治疗的动物，并没有单一的治疗方法一直是跨物种和两栖类⁷龄级成功。

对波特感染治疗几个临床试验已经完成^7。治疗的三种最常用的方法有热疗法，氯霉素和伊曲康唑。热疗是，似乎有一些副作用，可以在多个生命阶段中使用的nonchemotherapeutic治疗选择，并是根儿盟友有效。在治疗试验中，查特菲尔德和Richards-Zawacki ⁸发现，治疗动物的96％被安置在30℃下10天之后清除了感染。虽然这次审判是不是100％成功的，它提供给别人评价热疗法为他们自己种的基准。热疗法，虽然有效的许多物种，是不切实际的，可以不保持在高温环境中长时间许多高山物种。氯霉素，抗菌，已经成功地用于治疗波特在许多物种中，并在体外抑制真菌的生长。作为抗菌，氯霉素不攻击真菌特别，但已经知道导致细胞凋亡在真核细胞^9。据推测，氯霉素治疗引起细胞凋亡的皮肤，造成细胞内的孢子囊，但确切的作用机制尚不清楚。虽然没有临床试验已经进行，因此，剂量和治疗时间没有被评估，当前的治疗方案通常需要浸没为两至四个星期^10,11，使得这种治疗不切实际的地面两栖动物。氯霉素也被限制在一些国家的兽医使用，因为人体暴露已经与再生障碍性贫血¹²一种罕见形式的关联。

伊曲康唑，唑类抗真菌，是目前最广泛地用于在圈养两栖动物治疗波特感染。最广​​泛使用的协议是入浴动物每天连续11天五分钟0.01％伊曲康唑溶液。这个协议是来自用于哺乳动物施用的标准，并且，同时有效两栖类，它不基于在两栖动物^11,13的临床试验。这个协议可以导致某些物种的负面影响，特别是在属蛙和蝌蚪和最近metamorphs ^11。蝌蚪治疗已经成功使用伊曲康唑的浓度低得多（0.0005％），但用色素脱失¹⁴相关联。这同样浓度造模上最近metamorphs，结果为不成功在治疗感染^15。因为有一个负面影响与伊曲康唑治疗的风险，一些从业者已经使用一半的通常浓度（0.005％），连续11天，发现这是成功的固化波特感染^16。

本研究是使用伊曲康唑治疗波特感染¹⁵临床治疗试验的总结。该协议描述，试图找到最低剂量和治疗时间，既安全，有效的治疗波特感染动物与伊曲康唑。在这项研究中使用的动物是最近的墨西哥湾沿岸蟾蜍metamorphs，Incilius nebulifer。

研究方案

伦理批准：本研究及其方法已获美国杜兰大学动物使用及护理委员会（协议没有0407）。

1。测试用于 BD感染

1. 擦拭用于 BD
   1. 拭动物用无菌棉签5倍的ventrum，每个大腿上，每一侧，并且每个肢为总共45笔画五倍。擦拭取样是对波特的两栖类皮肤无创性方法。
   2. 在与招之间轻轻转动棉签，保证DNA的最大量收集棉签。
   3. 于1.5ml微量管在-20℃储存拭子
2. DNA提取和qPCR分析
   1. 提取基因组DNA使用市售的DNA提取试剂盒拭子，根据用于动物组织的指示。
   2. 使用定量实时PCR（定量PCR）以下博伊尔分析提取的DNA 等^[17]，并作以下修改：
   3. 稀释提取DNA样品1:10双去离子水。
   4. 添加0.7微升的牛血清白蛋白（BSA），以防止PCR抑制。
   5. 包括内部阳性对照各样品中，以确保PCR抑制没有影响的结果。
   6. 运行样品与阳性和阴性对照等一系列稀释的标准来估算游动孢子（感染）的负载。

2。接种

1. 文波特
   1. 通过将10g胰蛋白胨1升反渗透或去离子水，高压灭菌（121℃，40分钟），并使其冷却制备胰蛋白胨肉汤。一旦冷却至23℃，加入1 ml青霉素，链霉素。
   2. 在胰蛋白胨肉汤中生长波特株（JEL411从J. Longcore，隔绝Guabal，巴拿马从Phyllomedusa狐猴 ）七天在23°C。
2. 转移的B罗斯文化胰蛋白胨和琼脂平板。
   1. 使板，加10g胰蛋白胨和10g琼脂到1升反渗透或去离子水和高压釜（121℃，40分钟）。
   2. 一旦蒸压混合物不够冷静去触摸，但它凝结之前​​，倒入培​​养皿中，1/4-1/3满，在层流罩。
   3. 当琼脂凝固和冷却之后，加入0.5毫升波特肉汤时，每盘均匀涂抹在板周围。晾干。
   4. 一旦板接种波特游动孢子，密封板用封口膜。
   5. 让板孵化在23℃下5至7天。检查游动孢子的运动，以确保生存接种前。
3. 洪水板的游动孢子接种溶液
   1. 波特孵化和成长的五到七天 ​​后，洪水每盘用5毫升老化的自来水，并允许游动孢子进入媒体10分钟。
   2. 倒入游动孢子suspension到便携式容器。
   3. 估计游动孢子浓度用血球计。
   4. 稀释混合物，以1×10 ⁶每3毫升与老年自来水的浓度。
4. 接种动物
   1. 在个别50毫升容器，通过在其ventrum浇筑3毫升接种混合接种每个动物。允许额外的接种物滴入接种容器的底部。
   2. 每个动物将保持在接种容器放置24小时，以确保感染。
   3. 接种后24小时，回到动物个体消毒terraria。
   4. 使感染建立了两个星期。确认感染拭子和qPCR结果，并开始治疗。
   5. 对于BD-阴性对照，年龄洪水BD-自由琼脂平板用5ml自来水，和模拟接种的动物使用与上述相同的方法。

3。治疗方案

1. 准备相重新处理浴
   1. 添加2.50毫升伊曲康唑水溶液（1％斯皮仁诺口服溶液），以1升两栖类林格氏液（0.0025％伊曲康唑 - 最低有效治疗浓度）。
      1. 两栖类林格氏液配方：1升反渗透或去离子水，氯化6.6克钠加入0.15g氯化钾，0.15克氯化钙和0.2g碳酸氢钠。高压釜中的溶液（121℃，40分钟），并允许冷却到室温。
      2. 对于0.01％伊曲康唑治疗浓度，添加10.00毫升伊曲康唑水溶液（1％斯皮仁诺口服溶液），以1升两栖类林格氏液
      3. 为0.005％，伊曲康唑治疗浓度，添加5.00毫升伊曲康唑水溶液（1％斯皮仁诺口服溶液），以1升两栖类林格氏液。
   2. 对于BD-阳性和BD-阴性对照，洗澡动物两栖类林格氏液，没有伊曲康唑。
2. 治疗<醇>
3. 将个人两栖动物在消毒50毫升容器用35ml的处理液。
4. 确保动物被轻轻摇动容器完全覆盖五分钟。
5. 返回动物消毒terraria。重复6天。

确保治疗成功

1. 实验动物用于 BD感染当天开始治疗。
2. 试验动物为波特感染1周治疗结束后，和每周一次四个星期，以确保感染已被清除。

4， 波特作为一个生化危机

1. 消毒个别terraria每周一次。
   1. 沐浴terraria和治疗的容器中，10％的漂白剂溶液浴。
   2. 用流动水冲洗每漂白容器的两倍。
   3. 让容器在重新使用前晾干24小时。
2. 处理动物时要防止交叉污染戴上干净的手套，丁腈屋宇署病原体。改变处理每个动物之间的手套。
3. 通过将解决10％的漂白粉消毒所有液体废物处置前。
4. 所有高压灭菌的固体废物，是可能接触到波特之前处置。

结果

伊曲康唑治疗被认为是成功的，如果所有的动物都是BD-阴性治疗结束后四个星期。治疗前开始，接种后两周内，所有的BD-接种动物受到感染，以1,121.7平均游动孢子负荷（±17.34），而治疗结束四周后，屋宇署阳性对照组动物有16,765.12平均游动孢子负荷（ ±14643.08）。

Incilius nebulifer的治疗组（n = 15），成功利用浴场0.0025％，伊曲康唑浓度为五分钟，每...

讨论

使用此协议，我们能够安全，有效地降低两栖动物伊曲康唑治疗波特的治疗剂量和时间。最低治疗剂量和时间（六天0.0025％）是一次成功的治疗亚临床感染一nebulifer。这两个较低的剂量和治疗时间的效果表明，有必要为临床治疗试验的波特感染的治疗，因为目前用于两栖类的所有物种和年龄阶层没有安全有效的治疗方法。

死亡由伊曲康唑治疗造成的原因?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Aqueous Itraconazole, Sporonox	Janssen Pharmaceutica Inc.
NaCl	Fisher Scientific	S640-500
KCl	Fisher Scientific	BP366-1
CaCl2	Fisher Scientific	BP510-100
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328-500
Sterile cotton swabs	Medical and Wire Equipment	MW113
1.5 ml Microtubes	Sarstedt	73.703.217
Qiagen DNEasy Blood and Tissue Kit	Qiagen	69581
7500 Real-time PCR	Applied Biosystems	4351104
VIC IPC	Applied Biosystems	4308323
BSA	Applied Biosystems	AM2618
Agar	Invitrogen	30391023
Tryptone	Invitrogen	Q10029
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15070-063
Petri Dish	Sigma Aldrich	CLS430589