Снижение Итраконазол Концентрация и продолжительность успешны в лечении<em&gt; Batrachochytrium dendrobatidis</em&gt; Инфекция в амфибий

Резюме

Batrachochytrium dendrobatidis инфекции у земноводных могут быть устранены с помощью пониженную концентрацию (0,0025%) и короткую продолжительность (пять минут ванны для шести дней) итраконазола, чем обычно используется. Менее смертность и меньше негативных побочных эффектов наблюдались с помощью этого протокола модифицированный лечения.

Аннотация

Амфибии испытывают наибольшее снижение любого класса позвоночных и основной причиной этих снижения является грибковая патоген, Batrachochytrium dendrobatidis (BD), что приводит к chytridiomycosis заболевания. Пленные колонии обеспечения важны во всем мире под угрозой видов амфибий и может быть единственным спасательным кругом для тех, кто в критической угрозой исчезновения. Поддержание болезни бесплатно колонии является одним из приоритетов в неволе менеджеров, пока безопасные и эффективные методы лечения всех видов и через стадиях жизни не были идентифицированы. Наиболее широко используется химиотерапевтическое лечение итраконазол, хотя дозировка обычно используется может быть вредным для некоторых особей и видов. Мы провели испытания клинического лечения для оценки, может ли быть найден ниже и безопаснее, но эффективная доза итраконазола вылечить Bd инфекций. Мы обнаружили, что за счет снижения концентрации лечения от 0.01-0.0025% и сокращения продолжительности лечения с 11-6 Дней 5 мин ванны, лягушки могут быть излечены от Bd инфекции с меньшим количеством побочных эффектов и менее связанной с лечением смертности.

Введение

Амфибии в настоящее время испытывают наибольшее сокращение биоразнообразия всех позвоночных таксонов ^1. Chytridiomycosis, кожное заболевание вызвано хитридиевых грибковых патогенов Batrachochytrium dendrobatidis (BD), является одним из основных причин этих резкое снижение ² Bd является худшим патоген на запись за причинение утраты биоразнообразия:. Он заражает более 600 видов амфибий и имеет вызвало снижение более чем 300 видов, из которых целых 200 видов стали на грани исчезновения или вымершие ^2,3. Амфибия хитридиевых грибок не пройдет конкретных и неясно, какие качества хозяина позволяют Bd инфекции, чтобы прогрессировать в результате чего тяжелые заболевания. Chytridiomycosis приводит к смерти, нарушая ионные каналы в коже, что приводит к потере электролита и сердечной недостаточности ^4. Кроме того, Bd супернатант (не содержащий Bd зооспор) вызывает иммунный ответ у головастиков ⁵ leadinг исследователи верить Bd производит токсичный побочный продукт ^6.

Потому что многие виды которых резко сокращается, в неволе колонии обеспечения и селекционные программы являются важными меры по сохранению и может быть единственным спасательным кругом для некоторых видов. Установление и поддержание болезни бесплатно колонии является проблемой для амфибий объектов управления. Нынешние химиотерапевтические способы лечения Bd инфекции, хотя и эффективны, могут быть вредны для животных проходят лечение, и ни один метод единственного метода лечения был успешным у разных видов и возрастных классов амфибий ^7.

Несколько клинических испытаний лечения Bd инфекции были выполнены ^7. Три наиболее часто используемые методы лечения термотерапия, хлорамфеникол и итраконазол. Тепловая терапия является nonchemotherapeutic вариант лечения, который, кажется, имеет мало побочных эффектов, можно использовать на нескольких этапах жизни, и, вообще говорясоюзником эффективным. В исследовании лечения, Chatfield и Ричардс-Заваки ⁸ обнаружили, что 96% из обработанных животных рассеялся инфекции после того, как размещены при 30 ° С в течение 10 дней. Хотя этот процесс не был на 100% успешным, он обеспечивает основу для других, чтобы оценить тепла терапию для своего вида. Тепловая терапия, хотя и эффективны в течение многих видов, непрактично для многих горных пород, что не может оставаться при высоких температурах в течение продолжительного периода времени. Хлорамфеникол, антибактериальный, успешно используется для лечения Bd у многих видов, и ингибирует рост грибков в пробирке. В качестве антибактериальных, хлорамфеникол не разрушает грибок конкретно, но, как известно, вызывают апоптоз в клетках эукариот ^9. Было предположение, что хлорамфеникол терапия вызывает апоптоз в коже, убив внутриклеточный спорангии, хотя точный механизм действия неизвестен. Хотя ни клинических испытаний не проводилось, и поэтомудоза и время обработки не были оценены, текущие протоколы лечения обычно требуют погружение в течение двух-четырех недель ^10,11, что делает это лечение нецелесообразно для наземных амфибий. Хлорамфеникол также ограничен в некоторых странах для ветеринарного применения, потому что воздействие на человека было связано с редкой формой апластической анемии ^12.

Итраконазол, азоловый противогрибковое, является наиболее широко используется для лечения Bd инфекции у амфибий в неволе. Наиболее широко используемый протокол для купания животных в 0,01% раствора итраконазола в течение пяти минут в день в течение 11 дней подряд. Этот протокол был получен из стандартов, используемых для управления млекопитающих, и, в то время как в силу для земноводных, она не основана на клинических испытаниях в амфибий ^11,13. Этот протокол может вызвать негативные побочные эффекты у некоторых видов, особенно в рода Rana и в головастиков и последние оборотнями ^11.Лечение Головастик был успешным использованием значительно более низкую концентрацию (0,0005%) итраконазола, но был связан с депигментации ^14. Это же концентрация была опробована на последние оборотнями и признано неудачным при лечении инфекции ^15. Потому что есть риск негативных побочных эффектов с итраконазол лечения, некоторые практикующие использовали половину обычной концентрации (0,005%) в течение 11 дней подряд и этот, чтобы быть успешным в лечении BD инфекциями ^16.

Настоящее исследование представляет собой резюме судебного разбирательства клинического лечения с использованием итраконазола для лечения Bd инфекции ^15. Протокол описывает попытку найти наименьшее время дозы и лечения, который является одновременно безопасным и эффективным для лечения Bd зараженных животных итраконазолом. Животные, используемые в этом исследовании, были недавние Metamorphs из Gulf Coast жаб, Incilius nebulifer.

протокол

Утверждение Этика: Это исследование и его методы были утверждены животных по эксплуатации и уходу комитета Tulane университета (протокол не 0407.) По.

1. Тестирование на Bd инфекции

1. Свабирование для Bd
   1. Swab животные с стерильной ватной палочкой в ​​пять раз по ventrum, пять раз на каждом бедре, с каждой стороны, и каждой конечности в общей сложности 45 ударов. Свабирование является неинвазивным методом отбора проб для Bd на амфибии кожи.
   2. Плавно поворачивайте тампон во время и между ударами, чтобы обеспечить наибольшее количество ДНК собрались на тампоном.
   3. Храните тампоны в 1,5 мл микропробирок при -20 ° С.
2. ДНК Добыча и КПЦР анализ
   1. Извлечение геномной ДНК из мазков, используя имеющийся в продаже набор для выделения ДНК, в соответствии с инструкциями для ткани животного.
   2. Анализ извлеченной ДНК с использованием количественной ПЦР в реальном времени (КПЦР) после Бойл и др. ^17, со следующими изменениями.:
   3. Развести образцы выделения ДНК 1:10 с двойным деионизированной воды.
   4. Добавить 0,7 мкл бычьего сывороточного альбумина (BSA), чтобы предотвратить ингибирование ПЦР.
   5. Включать внутренний положительный контроль в каждом образце, чтобы обеспечить ингибирование ПЦР не влияя на результаты.
   6. Запуск образцы с положительным и отрицательным контролем и серии стандартов разбавления для оценки зооспора (инфекция) нагрузку.

2. Прививка

1. Культура Bd
   1. Подготовка триптон бульон, добавив 10 г триптона до 1 л обратного осмоса или деионизированной воды, выдерживают в автоклаве (121 ° C в течение 40 мин) и давали остыть. После охлаждения до 23 ° С, добавить 1 мл пенициллин-стрептомицин.
   2. Расти Bd напряжение (JEL411 от Дж. Longcore, изолированных от Guabal, Панама из Phyllomedusa лемура) в триптон бульоне в течение семи дней при 23 ° С
2. Перенести бРот культуры, чтобы триптон и агаром.
   1. Чтобы тарелки, добавить 10 г триптона и 10 г агара на 1 л обратного осмоса или деионизированной воды и автоклаве (121 ° С в течение 40 мин).
   2. После того, как в автоклаве смесь достаточно прохладно на ощупь, но, прежде чем он застывает, разлить в чашки Петри, 1/4-1/3 полный, в ламинаре.
   3. Когда агара застыла и охлаждается полностью, добавить 0,5 мл Bd бульон на каждую пластину и равномерно вокруг плиты. Дайте высохнуть.
   4. После того, как планшеты засевают Bd зооспор, печать пластин с парафильмом.
   5. Разрешить пластины для инкубации при 23 ° С в течение пяти-семи дней. Проверьте зооспора движение, чтобы обеспечить жизнеспособность перед прививкой.
3. Наводнение пластины для зооспор решения прививки
   1. После пяти-семи дней от Bd инкубации и роста, затопить каждую тарелку с 5 мл в возрасте водопроводной водой и дайте зооспоры, чтобы войти в СМИ в течение 10 мин.
   2. Вылейте зооспор suspension в портативный контейнер.
   3. Оцените концентрации зооспор с гемоцитометре.
   4. Развести смесь до концентрации 1 × 10 ⁶ в 3 мл возрасте водопроводной воды.
4. Привить животных
   1. В отдельных 50 мл контейнеров, привить каждого животного путем заливки 3 мл посевной смеси над его ventrum. Разрешить дополнительный посевной капать в основание прививки контейнера.
   2. Каждое животное будет оставаться в контейнере инокуляции в течение 24 ч, чтобы обеспечить заражение.
   3. Через 24 часа прививки, вернуться животных к отдельным вылеченных террариумов.
   4. Разрешить инфекция построить в течение двух недель. Подтверждение инфекции с тампоном и результаты КПЦР, и начать лечение.
   5. Для Bd-отрицательных контролей, наводнения Bd без агаром с 5 мл в возрасте водопроводную воду, и макет привить животных с использованием тех же методов, что и выше.

3. Режим лечения

1. Prepaповторно лечения ванной
   1. Добавить 2,50 мл водного итраконазол (1% Sporanox Раствор для приема внутрь) до 1 Решение L амфибия Рингера (0,0025% итраконазол - самая низкая эффективная концентрация лечение).
      1. Амфибия раствор Рингера рецепт: 1 L обратный осмос или деионизированная вода, хлорид натрия 6,6 г, 0,15 г хлорида калия, 0,15 г хлорида кальция и 0,2 г бикарбоната натрия. Автоклав раствор (121 ° C в течение 40 мин) и дать остыть до комнатной температуры.
      2. Для 0,01%-ной концентрации итраконазол лечения, добавьте 10.00 мл водного итраконазол (1% Sporanox Раствор для приема внутрь), чтобы решение 1 л амфибия Рингера
      3. Для итраконазол концентрации лечения 0,005%, добавить 5,00 мл водного итраконазол (1% Sporanox Раствор для приема внутрь), чтобы решение 1 л амфибия Рингера.
   2. Для Bd-положительных и Bd-отрицательных контролей, купать животных в растворе амфибия Рингера, не итраконазола.
2. Лечение <ол>
3. Место отдельных амфибий в вылеченных 50 мл контейнеры с 35 мл обрабатывающего раствора.
4. Обеспечить животные полностью покрываются в течение пяти минут, осторожно вращая контейнер.
5. Вернуться животных вылеченных террариумов. Повторите в течение шести дней.

Обеспечить успех лечения

1. Экспериментальные животные для Bd инфекции на день обращения начинается.
2. Экспериментальные животные для Bd инфекции через неделю после отделки лечения, и один раз в неделю в течение четырех недель по обеспечению инфекции освободится.

4. Bd как Biohazard

1. Лечить индивидуальный террариумов еженедельно.
   1. Купайтесь в террариумах и лечения контейнеров в 10% раствор отбеливателя ванной.
   2. Промыть каждую беленой контейнер дважды с проточной водой.
   3. Разрешить контейнеры высохнуть в течение 24 часов перед повторным использованием.
2. Надевайте чистые нитриловые перчатки при обращении с животными, чтобы предотвратить перекрестное загрязнениеиз Bd патогена. Изменение перчатки между обработке каждого животного.
3. Лечить все жидкие отходы перед захоронением, принося решение 10% гипохлоритом натрия.
4. Автоклав все твердые отходы, которые может понести Bd перед удалением.

Результаты

Итраконазол лечение считался успешным, если все животные были Bd-отрицательных четыре недели после лечения, закончившийся. Перед началом лечения началось, через две недели после прививки, все Bd-привитых животных были заражены, со средним зооспор нагрузки 1,121.7 (± 17,34), в то время ...

Обсуждение

Используя этот протокол мы смогли безопасно и эффективно уменьшить дозу лечения и время итраконазол лечения Bd у амфибий. Самая низкая доза и время (0,0025% в течение шести дней) лечение было успешным лечение бессимптомно инфицированных I. nebulifer. Эффективность как более низкой доз?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Aqueous Itraconazole, Sporonox	Janssen Pharmaceutica Inc.
NaCl	Fisher Scientific	S640-500
KCl	Fisher Scientific	BP366-1
CaCl2	Fisher Scientific	BP510-100
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328-500
Sterile cotton swabs	Medical and Wire Equipment	MW113
1.5 ml Microtubes	Sarstedt	73.703.217
Qiagen DNEasy Blood and Tissue Kit	Qiagen	69581
7500 Real-time PCR	Applied Biosystems	4351104
VIC IPC	Applied Biosystems	4308323
BSA	Applied Biosystems	AM2618
Agar	Invitrogen	30391023
Tryptone	Invitrogen	Q10029
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15070-063
Petri Dish	Sigma Aldrich	CLS430589