Reduzierte Itraconazol Konzentration und Dauer sind erfolgreich in der Behandlung von<em&gt; Batrachochytrium dendrobatidis</em&gt; Infektion in Amphibien

Zusammenfassung

Batrachochytrium dendrobatidis Infektion bei Amphibien können mit einer reduzierten Konzentration (0,0025%) und kürzere Laufzeit (5 Minuten Bäder für sechs Tage) von Itraconazol als allgemein verwendet, beseitigt werden. Weniger Sterblichkeit und weniger negative Nebenwirkungen wurden unter Verwendung dieser modifizierten Behandlungsprotokoll beobachtet.

Zusammenfassung

Amphibien sind die mit den größten Rückgang aller Wirbeltierklasse und eine führende Ursache für diesen Rückgang ist eine Pilzerreger, Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), die die Krankheit verursacht chytridiomycosis. Captive Sicherung Kolonien sind wichtig, weltweit für bedrohte Amphibienarten und möglicherweise die einzige Lebensader für die in kritischen vom Aussterben bedroht sein. Die Aufrechterhaltung Krankheit frei Kolonien ist eine Priorität der Gefangenschaft Manager, noch sichere und wirksame Behandlungen für alle Arten und über Lebensphasen nicht identifiziert worden. Die am häufigsten verwendeten chemotherapeutischen Behandlung ist Itraconazol, obwohl die Dosierung üblicherweise verwendeten schädlich für einige Individuen und Arten sein. Wir führten eine Behandlung klinische Studie zu beurteilen, ob eine untere und sicherer, aber effektive Dosis von Itraconazol gefunden werden konnte Bd-Infektionen zu heilen. Wir fanden, dass durch die Reduzierung der Behandlungskonzentration von 0,01 bis 0,0025%, und die Verringerung der Behandlungsdauer von 11-6 Tage von 5 min Bäder, könnten Frösche von Bd-Infektion mit weniger Nebenwirkungen und weniger therapieassoziierte Mortalität geheilt werden.

Einleitung

Amphibien erleben derzeit den größten Rückgang der biologischen Vielfalt aller Wirbeltier-Taxa ^ein. Chytridiomykose, eine Hautkrankheit, die durch den chytrid Pilzpathogen Batrachochytrium dendrobatidis (Bd) verursacht wird, ist eine der Hauptursachen für diesen dramatischen Rückgang Bd ² ist der schlimmste Erreger auf Rekord für verursachen Verlust der biologischen Vielfalt:. Infiziert es über 600 Arten von Amphibien und hat verursachten Rückgänge in über 300 Arten, von denen mehr als 200 Arten sind vom Aussterben bedrohte oder ausgestorbene ^2,3. Die Amphibien-Chytridpilz nicht wirtsspezifisch und es ist unklar, welche Eigenschaften des Host ermöglichen Bd-Infektion, um die Fortschritte zu schweren Krankheit. Chytridiomykose Tod verursacht durch Störung Ionenkanäle in der Haut, was zu Elektrolytverlust und Herzversagen ^4. Auch Bd Überstand (enthaltend keine Bd Zoosporen) eine Immunantwort bei Kaulquappen ^{5-Zuführungs}g Forscher glauben, Bd erzeugt eine giftige Nebenprodukt ^6.

Da viele Arten sind stark rückläufig, in Gefangenschaft Sicherung Kolonien und Zuchtprogramme sind wichtige Schutzmaßnahmen, und die einzige Lebensader für einige Arten sein. Aufbau und Pflege frei von Krankheiten Kolonien ist eine Herausforderung für Amphibien-Management-Einrichtungen. Die aktuellen chemotherapeutischen Methoden zur Behandlung von Bd-Infektionen, obwohl effektiv ist, kann für die Tiere, die behandelt werden, und keine einzige Behandlungsmethode erfolgreich über Arten und Altersklassen von Amphibien ⁷ gewesen.

Nur wenige klinische Studien von Behandlungen für Bd-Infektion durchgeführt worden sind ^7. Die drei am häufigsten verwendeten Methoden der Behandlung sind Wärmetherapie, Chloramphenicol und Itraconazol. Wärmetherapie ist eine Behandlungsoption, die nonchemotherapeutic haben wenige Nebenwirkungen können auf mehrere Lebensphasen verwendet werden wird, und ist GenerVerbündeter wirksam. In einer Therapiestudie, Chatfield und Richards-Zawacki ⁸ festgestellt, dass 96% der behandelten Tiere waren Infektionen, nachdem sie bei 30 ° C für 10 Tage untergebracht gelöscht. Obwohl dieser Versuch war nicht 100% erfolgreich, bietet es eine Grundlinie für andere Wärmetherapie für die eigene Spezies zu beurteilen. Wärmetherapie, obwohl effektiv für viele Arten ist unpraktisch für viele alpine Arten, die nicht bei hohen Temperaturen für eine längere Zeit verbleiben kann. Chloramphenicol, ein antibakterielles, wurde erfolgreich verwendet, um Bd in vielen Arten zu behandeln, und hemmt das Pilzwachstum in vitro. Als antibakterielles, die Chloramphenicol nicht den Pilz befallen besonders aber ist bekannt, dass die Apoptose in eukaryotischen Zellen ⁹ zu bewirken. Es wurde spekuliert, daß Chloramphenicol-Therapie verursacht Apoptose in der Haut, die intrazelluläre Abtöten Sporangien, obwohl der genaue Wirkmechanismus ist unbekannt. Obwohl keine klinischen Studien durchgeführt worden, und deshalbDosis und Behandlungszeit wurden nicht bewertet, aktuelle Behandlungsprotokolle erfordern in der Regel Untertauchen für zwei bis vier Wochen ^10,11, so dass diese Behandlung unpraktisch für terrestrischen Amphibien. Chloramphenicol wurde auch in einigen Ländern für den tierärztlichen Gebrauch beschränkt worden, weil die Exposition des Menschen mit einer seltenen Form von aplastischer Anämie ¹² in Verbindung gebracht.

Itraconazol, ein Azol-Antimykotika, ist das am häufigsten für die Behandlung der Bd-Infektion bei Amphibien in Gefangenschaft eingesetzt. Das am häufigsten verwendete Protokoll ist Bade Tieren in einer 0,01% igen Lösung von Itraconazol fünf Minuten pro Tag für 11 aufeinanderfolgende Tage. Dieses Protokoll wurde von Standards für Säugetier Verabreichung verwendet abgeleitet, und während effektiv für Amphibien, ist es nicht auf klinische Studien in Amphibien ^11,13 berechnet. Dieses Protokoll kann negative Nebenwirkungen bei bestimmten Arten verursachen, besonders in der Gattung Rana und Kaulquappen und in den letzten ¹¹ Metamorphe.Tadpole Behandlung erfolgreich war mit einer viel niedrigeren Konzentration (0,0005%) von Itraconazol, wurde aber mit Depigmentierung ¹⁴ zugeordnet. Die gleiche Konzentration wurde auf den letzten Metamorphe erprobt und festgestellt, die auf die Behandlung erfolglos Infektion ¹⁵ zu sein. Denn es besteht die Gefahr von negativen Nebenwirkungen der Behandlung mit Itraconazol, haben einige Praktiker die Hälfte der üblichen Konzentration (0,005%) für 11 aufeinanderfolgende Tage verwendet und fanden, dass bei der Heilung von Infektionen Bd ¹⁶ erfolgreich.

Die vorliegende Studie ist eine Zusammenfassung einer klinischen Studie mit Itraconazol-Behandlung zu Bd-Infektion ¹⁵ zu behandeln. Das Protokoll beschreibt einen Versuch, die niedrigste Dosis und Behandlungszeit, die sowohl sicher und wirksam für die Behandlung von infizierten Tieren mit Bd Itraconazol finden. Tiere in dieser Studie verwendet wurden, waren letzten Metamorphe der Golfküste Kröten, Incilius nebulifer.

Protokoll

Ethik-Zulassung: Diese Studie und ihre Methoden wurden von Tier Benutzung und Pflege Ausschuss Tulane University (. Protokoll nicht 0407) zugelassen.

1. Testen für Bd-Infektion

1. Abtupfen für Bd
   1. Tupfer Tiere mit einem sterilen Wattestäbchen fünfmal am ventrum fünfmal auf jedem Schenkel, jeder Seite, und jedes Glied für insgesamt 45 Hüben. Swabbing ist eine nichtinvasive Methode der Probenahme für Bd auf Amphibienhaut.
   2. Den Tupfer während und zwischen den Hüben drehen vorsichtig, um die größte Menge an DNA wird auf dem Tupfer gesammelt.
   3. Shop Tupfer in 1,5-ml-Röhrchen bei -20 ° C
2. DNA-Extraktion und qPCR-Assays
   1. Auszug genomische DNA aus den Tupfer mit einem handelsüblichen DNA-Isolation-Kit, in Übereinstimmung mit den Anweisungen für die Tiergewebe.
   2. Analysieren Sie den extrahierten DNA mittels quantitativer Echtzeit-PCR (qPCR) nach Boyle et al ^17, mit den folgenden Modifikationen.:
   3. Verdünnen Sie die DNA-Extraktion Proben 1:10 mit Doppel VE-Wasser.
   4. Hinzufügen von 0,7 &mgr; l Rinderserumalbumin (BSA), um PCR-Hemmung zu verhindern.
   5. Fügen Sie eine interne positive Kontrolle in jeder Probe, um sicherzustellen, PCR-Hemmung wurde nicht Ergebnisse zu beeinflussen.
   6. Führen Proben mit einem positiven und negativen Steuer und eine Reihe von Standards, um Verdünnungszoosporen (Infektion) Last zu schätzen.

2. Impfung

1. Kultur Bd
   1. Vorbereitung Trypton-Brühe durch Zugabe von 10 g auf 1 l Trypton Umkehrosmose oder entionisiertes Wasser, autoklaviert (121 ° C für 40 min) und abgekühlt. Einmal auf 23 ° C abgekühlt, 1 ml Penicillin-Streptomycin.
   2. Wachsen Bd Stamm (JEL411 von J. Longcore, isoliert von Guabal, Panama von einem Phyllomedusa Lemur) in einer Trypton-Brühe für sieben Tage bei 23 ° C
2. Übertragen Sie die broth Kultur Trypton und Agar-Platten.
   1. Um Platten machen, fügen Sie 10 g Trypton und 10 g Agar auf 1 L Umkehrosmose oder VE-Wasser und Autoklaven (121 ° C für 40 min).
   2. Sobald die autoklaviert Mischung ist cool genug, um zu berühren, aber bevor es gerinnt, in Petrischalen gießen, 1/4-1/3 voll, in einer Steril.
   3. Wenn Agar erstarrt und abgekühlt ist komplett, 0,5 ml Brühe Bd zu ​​jeder Platte und gleichmäßig verteilt auf der ganzen Platte. Trocknen lassen.
   4. Sobald die Platten mit Bd Zoosporen, Dichtungsplatten mit Parafilm eingeimpft.
   5. Ermöglichen Platten bei 23 ° C für fünf bis sieben Tage inkubiert. Überprüfen Zoosporen Bewegung, um die Lebensfähigkeit vor der Impfung zu gewährleisten.
3. Flood Platten für Zoosporen Impflösung
   1. Nach fünf bis sieben Tagen der Inkubation Bd und Wachstum, Flut jede Platte mit 5 ml im Alter von Leitungswasser und lassen Zoosporen, die Medien für 10 Minuten geben.
   2. Gießen Sie die Zoosporen UntBrnsion in einen tragbaren Behälter.
   3. Schätzen Sie Zoosporen Konzentration mit einer Zählkammer.
   4. Verdünnte Gemisch in einer Konzentration von 1 x ¹⁰ &sup6; pro 3 ml mit Leitungswasser gealtert.
4. Impfen Tiere
   1. In einzelnen 50-ml-Behälter, impfen jedes Tier durch Gießen 3 ml Inokulum Mischung über seine ventrum. Bemessen Inokulum in die Basis der Impfung Behälter tropfen.
   2. Jedes Tier wird in der Inokulation Behälter für 24 Stunden bleiben, um eine Infektion zu gewährleisten.
   3. Nach 24 Stunden der Impfung zurück, um einzelne Tiere desinfiziert Terrarien.
   4. Lassen Infektion für zwei Wochen bauen. Infektion Bestätigen Sie mit Tupfer und qPCR-Ergebnisse und die Behandlung beginnen.
   5. Für BD-Negativkontrollen, Hochwasser Bd freien Agar-Platten mit 5 ml im Alter von Leitungswasser und spotten impfen die Tiere mit den gleichen Methoden wie oben.

3. Behandlungsschema

1. Prepare Behandlungsbades
   1. In 2,50 ml wässrige Itraconazol (1% Sporanox Oral Solution) auf 1 L Amphibien Ringer-Lösung (0,0025% Itraconazol - die niedrigste wirksame Behandlung Konzentration).
      1. Amphibien-Ringer-Lösung Rezeptur: 1 L Umkehrosmose oder entionisiertes Wasser, 6,6 g Natriumchlorid, 0,15 g Kaliumchlorid, 0,15 g Calciumchlorid und 0,2 g Natriumhydrogencarbonat. Autoklaven-Lösung (121 ° C für 40 min) und auf Raumtemperatur abkühlen.
      2. Für 0,01% Itraconazol Behandlungskonzentration, fügen 10,00 ml wässrige Itraconazol (1% Sporanox Oral Solution) auf 1 L Amphibien Ringer-Lösung
      3. Für 0,005% Itraconazol Behandlungskonzentration, fügen 5.00 ml wässrige Itraconazol (1% Sporanox Oral Solution) auf 1 L Amphibien Ringer-Lösung.
   2. Für Bd-positiven und-negativen Kontrollen Bd, baden Tiere Amphibien in Ringer-Lösung ohne Itraconazol.
2. Behandlung
   1. Zeigen einzelnen Amphibien in 50 ml desinfiziert Behälter mit 35 ml der Behandlungslösung.
   2. Stellen Sie sicher, Tiere sind komplett für fünf Minuten abgedeckt durch leichtes Schütteln des Behälters.
   3. Zurück Tiere desinfiziert Terrarien. Wiederholen Sie für sechs Tage.
3. Stellen Sie sicher, Behandlungserfolg
   1. Testtiere für Bd-Infektion am Tag der Behandlung beginnt.
   2. Testtiere für Bd-Infektion eine Woche nach der Behandlung abgeschlossen ist, und einmal in der Woche für vier Wochen, um sicherzustellen, Infektion verschwunden ist.

4. Bd als Biohazard

1. Desinfizieren einzelnen Terrarien wöchentlich.
   1. Baden Sie die Terrarien und Behandlung Behältern in einem 10% Bleichmittel-Lösung Badewanne.
   2. Jedes gebleicht Behälter zweimal Spülung mit fließendem Wasser.
   3. Erlauben Behälter für 24 Stunden trocknen, bevor Wiederverwendung.
2. Tragen Sie saubere Nitril Handschuhe beim Umgang mit Tieren um eine Kreuzkontamination zu verhindernBd Erregers. Handschuhe zwischen der Behandlung jedes Tier zu ändern.
3. Desinfizieren Sie alle flüssigen Abfällen vor der Beseitigung, indem die Lösung auf 10% Bleichmittel.
4. Autoklav alle festen Abfälle, die möglicherweise zu Bd vor der Entsorgung ausgesetzt ist.

Ergebnisse

Itraconazol-Behandlung wurde als erfolgreich, wenn alle Tiere waren vier Wochen nach Ende der Behandlung Bd-negativ. Vor der Behandlung begonnen, zwei Wochen nach der Impfung alle Bd-geimpften Tiere infiziert waren, mit einer mittleren Belastung von 1.121,7 Zoosporen (± 17,34), während vier Wochen nach Ende der Behandlung eine mittlere Belastung von Zoosporen 16,765.12 hatten die Bd-positiven Kontrolltiere ( ± 14.643,08).

Die Behandlung von Incilius nebulife...

Diskussion

Über dieses Protokoll konnten wir sicher und effektiv reduzieren die Behandlungsdosis und Zeit von Itraconazol-Behandlung für Bd bei Amphibien. Die niedrigste Behandlungsdosis und Zeit (0,0025% für sechs Tage) war eine erfolgreiche Behandlung für subklinisch infiziert I. nebulifer. Die Wirksamkeit von sowohl einer niedrigeren Dosis und Behandlungsdauer zeigen die Notwendigkeit für klinische Therapiestudien für Bd-Infektion Behandlungen, da gibt es noch keine sichere und wirksame Behandlu...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% Aqueous Itraconazole, Sporonox	Janssen Pharmaceutica Inc.
NaCl	Fisher Scientific	S640-500
KCl	Fisher Scientific	BP366-1
CaCl2	Fisher Scientific	BP510-100
NaHCO3	Fisher Scientific	BP328-500
Sterile cotton swabs	Medical and Wire Equipment	MW113
1.5 ml Microtubes	Sarstedt	73.703.217
Qiagen DNEasy Blood and Tissue Kit	Qiagen	69581
7500 Real-time PCR	Applied Biosystems	4351104
VIC IPC	Applied Biosystems	4308323
BSA	Applied Biosystems	AM2618
Agar	Invitrogen	30391023
Tryptone	Invitrogen	Q10029
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15070-063
Petri Dish	Sigma Aldrich	CLS430589