自由移动鸽子穿越三个阶段学习记录单个神经元'动作电位

摘要

学习新的刺激 - 反应协会从事范围广泛的神经工序，而最终体现在改变单个神经元的秒杀输出。在这里，我们描述一个行为协议，允许单神经元活动的连续记录，而动物收购，熄灭，和一个实验性会话中重新获取一个条件反应。

摘要

而学习的主题，吸引了极大的兴趣来自行为和神经科学家，只有相对少数的研究者观察到单个神经元的活动，而动物被收购的operantly条件反应，或当该响应熄灭。但即使在这种情况下，观察期通常包括学习的只有一个阶段， 即收购或灭绝，但不能同时使用（例外情况包括用人逆转的学习方案;见宾曼等 ¹中的示例）。然而，收购和灭绝涉及不同的学习机制，因此预期将伴随着不同类型和/或神经可塑性的基因位点。

因此，我们开发了一种行为范式的机构学在一个单一的行为会话和其中三个阶段是非常适合用于同时记录的单个神经元的动作电位。动物重新训练上的单间隔强迫选择的任务，需要各两个可能的选择反应，不同的新颖的视觉刺激（购入）的呈现映射。已达到预定的性能指标，这两个选择反应之一后不再增强（消光）。按照一定的递减在性能水平，正确的反应是再次强化（重捕）。通过使用一套新的在每一个会话的刺激，动物可以反复进行收购灭绝 - 再获取过程。因为学习的三个阶段发生在一个单一的行为会议上，范式是理想的同时观测多个单个神经元的扣球输出。我们用鸽子作为模型系统，但是该任务可以很容易地适应空调能力辨别学习的任何其它物种。

引言

学习新的刺激 - 反应 - 结果组织从事广泛的神经可塑性过程。这些过程最终体现在单个神经元的变化尖峰输出。可以说，最经常使用的学习范式之一是与啮齿类动物进行巴甫洛夫恐惧制约。在这种背景下，一个条件反应的采集和灭绝采取了几十个试验²内进行。条件性恐惧的快速发展是有利的，因为它允许在短时间内运行大量的动物。此外，收购和消光可以在几十试验在一天中天真的动物观察到^3,4或分布在2〜3天^2,5-8。然而，见解学习期间在这些实验中并不一定适用恐惧条件外域上涨约神经活动的变化。例如，目标导向的行为由驱动位置略去钢筋更充分地通过操作性，而不是巴甫洛夫条件反射过程建模，并可能部分依赖于不同的神经基础^9,10。此外，恐惧制约发展如此迅速，在CS的神经反应只能为几十个试验中观察到，将神经活动的变化分析严重限制在学习。

不幸的是，操作性通常响应的收购和消灭需要很多天。这是有害的神经生理学研究，因为它是非常困难的在超过几小时来记录单细胞的活性。由于细胞外记录的动作电位波形的高相似性，它要求该记录在一天尖峰是从同一小区产生的尖峰与记录在下一^11,12相似的波形，特别是在具有高的区域是有问题细胞密度如海马。

为了解决这些问题，我们开发了利用3学习条件了一种新的行为模式中的一个实验性会议上一天。这就要求实验动物愿意在不同条件下对薄加固的时间表来执行上百个试验。信鸽（ 哥伦比亚利维亚经家蝇 ）是经典模式生物在实验心理学^13-17。这些鸟能够执行复杂的视觉歧视^18，可以灵活适应行为来改变筋突发事件^19,20，并且是唯一热衷的工人，进行1,000试验的构件最小配筋量。这些特性使它们特别适用于下述实验。

研究方案

操守准则

所有实验均按照动物在科学的保养和使用了德国的指引进行。程序批准了北莱茵 - 威斯特法伦州，德国的状态的国家伦理委员会。

系统概述

操作性试验箱

操作性室（ 图1）测量34厘米X 34厘米×50厘米。三个半透明的响应键（4厘米×4厘米位于大约20厘米以上的地面水平）的凹入腔室的后壁上。刺激是通过一台液晶平面显示屏后面装有应答键显示。 2个2瓦的灯泡位于侧壁提供昏暗照明。该室被安置在一个声音衰减柜掩盖多余的声音。扬声器提供白噪声在任何时候。粮食（谷物）是由位于美分下方的食品料斗提供呃键。实验的硬件是由自定义编写的MATLAB代码²¹控制。动物都通过连接到腔室的前壁数码相机不断监测。

定制的微型硬盘

微型硬盘外壳16电极导线定制在我们的实验室;本设计是基于工作由比尔基和同事^22,23，和读者可以参考这些文章进行了详细的描述。我们修改了他们的设计，以允许电极的数量较多（16而不是8;25μm的镍铬线），而我们通过导电银胶的探头插座连接的电极布线。此外，我们使用镀金的电极提示，以减少阻抗，以达到更好的信号噪声比（申请-3 V的〜3秒;阻抗应降至<100kΩ的）。

一旦该微驱动器被组装时，电极被切割成所需的长度，提示是CLEANED在超声浴（Tergazyme在蒸馏水中），20分钟，漂洗另一个20分钟在蒸馏水中。镀金的电极尖端应植入前立即生效。对于接地，我们使用一个银球电极置于上方的横向小脑。材料的规范是在材料表，本文附带提供的。

与自由活动动物工作时的一个重要问题是运动伪影。我们发现，在我们设置的运动伪影，主要是由于一）高电极阻抗（> 500KΩ）和插件（植入物）和插座（探头）之间的触点二）不完善的附件，而动物是感动。各种市售microconnectors并没有从自由移动的鸟类记录表现欠佳，因为插头和插座之间的机械接触过鸽子（头部上下摆动，关键啄）蓬勃运动迅速恶化。植入物和探头之间的最佳机械连接​​是由Ginder科学headplug组件来实现。这些插头插座组件配有18接触，并紧紧贴在对方通过环形螺母。

电生理记录设置

该电设置包括以下几部分组成：1）一个定制的探头具有单位增益（运算放大器）2）安装在两个机架15差分放大器模块安装装置（DPA-2FS和EPMS-07，分别NPI电子GmbH，德国），3）一个16通道模拟 - 数字转换器（功率1401马克Ⅰ）。原始信号被放大1000倍和带通滤波（500-5000赫兹， ^第一阶滤波器），数字化，带有16-20千赫的采样率和存储与Spike2的版本7.06a为脱机处理。是次事件（如刺激发病或动物的个体关键啄）通过实验室构建的并行IO端口盒抓获（见玫瑰; 等人 ^21），并转发给AD转换器，用于存储沿着与神经生理数据（参见图1）。离线处理在下面进一步描述。

图1系统概述，信息流是由彩色箭头象征。计算机1控制硬件有关的行为输出（显示刺激通过纯平显示器，房子轻工，食品料斗，振动给料机轻，响应键），并发送事件时间戳的AD转换器。从计算机1接收来自A / D转换器和事件时间戳获得计算机2店神经电生理信号。左边的照片显示的是空调室中的声音衰减柜内。其元素是：1）声音衰减外壳，2-4）响应密钥秒，5）食品料斗，6）馈线光7）房子光，8）观察相机。

单区间强迫选择（SIFC）歧视任务

为了清楚起见，我们将在这里介绍的最后SIFC任务，然后解释训练动物在下面这个任务所需的步骤。

该SIFC任务在图2中所概述。后intertrial间隔（ITI）已经过去时，中心键被透照绿色长达5秒（'初始化阶段'）。紧随其后的5秒内动物的第三个反应，一出几个样品的刺激是提出了关于中心键2秒（'样品阶段“;例如刺激是插图所示图2）。后2秒，中心键被再次透照绿色和动物具有前两个侧键透照（'确认相'）响应一次。根据所示的刺激物的身份在采样阶段中，动物被引导到左或右键（“选择相'）的单一反应必需的。如果它选择正确的目标，获得奖励（粒）被授予2秒。因此，任务的核心是由响应左选择键介绍在中心键一个特定的刺激后，并呈现另一种刺激后回应正确的选择键。该样本相位被初始化并确认相包围的一个原因是为了保持动物的头在中心键的前部，而该样品的刺激呈现。

一旦动物主人这一任务的一对刺激（以下简称，“熟悉”的刺激，FS），它提出了一个新颖的刺激（NS）对每一个新的会话，并有学习这两个新异刺激的是然后依次向左侧或右侧的选择键的响应。该FS继续对日期间提交OSE实验作为合适的控制条件。在最后的任务足够的性能关键取决于对动物的意愿来执行> 1,000试验在整体加固概率<0.5。下面的段落描述了一个训练过程，其中任务的复杂性逐渐增加，直到动物到达SIFC的水平;同时，强化概率和每个会话的试验次数需要增加，以确保最后的任务一致的高性能。

1，动物训练

1. 食品限制
   1. 至少两周的自由进食后称量动物。就拿这个重量为自由摄食量。限制在未来1-2个星期的食物访问，直到动物达到其自由摄食量的85％。
   2. 鸽子保持健康的身体外观和正常的活动在整个实验过程中是至关重要的。至为此，仔细留意动物的整个行为训练和测试的整个持续时间外观和重量。前，后各实验阶段，评估每天的食物摄入量称取动物。如果需要提供额外的食物，以防止进一步的减重。提供周末无限制地获得食物。
2. Autoshaping
   Autoshaping用于习惯于对动物的实验室，并建立条件性反应。
   1. 目前有5秒的视觉刺激（以下，初始化刺激，IS）的中心键。紧随终止了IS或单个啄来响应键（无论是第一位），关掉按键照明和现在的食物奖励（食品料斗2秒激活）。
   2. 保持ITI大大长于样品演示时间，以方便学习^24。用120秒的值ITI和每天运行40试验。以后重复使用IS在最后的任务初始化，确认和选择关键刺激（ 见图2）。这一阶段的训练将采取动物大约一个星期。
   3. 一旦动物可靠响应（在试验中> 85％），降低ITI逐步下降到10秒，样品演示时间缩短到2秒。在同一时间，增加所需的加固到3（共3个固定比率，FR 3）的反应的数量。此外，增加每天试验的总数。选择参数，使得该动物被训练每天为约1小时。这一阶段的训练将持续大约2个星期。
   4. 重复步骤1.2.1 - 1.2.3为左，右按键响应​​，直到受试者可靠地在所有3个按键响应IS。交替试验，激活左，右和中央重点随机的。
   5. 现在，在中心首先介绍了IS后，有条件的响应，在两边键（省略加固的中心键响应）。备用激活侧键随机试验，以试验。终止试验中，受试者并没有5秒后，中心键响应。重复，直到动物可靠地执行（〜3天）。
   6. 引进2个新的刺激将在后面作为财政司司长的最后一个任务（参见图2，插图，的例子）。这些刺激1.2.3 - 重复步骤1.2.1。响应会比更迅速地建立了第一个刺激，一般在4天。

图2插图行为范式。5秒的ITI后，中心键被透照绿色长达5秒（初始化）。如果动物3X响应这5秒内，1出4;样品的刺激呈现在同一位置。之后的2秒内的动物有回应至少一次固定的样品演示时间，中央啄键时透照再次绿色（确认）。再过啄，2个侧键透照绿色。这个问题表明其选择通过响应一次侧键之一。在定位及重新定位，正确反应之后是2秒粮食获得伴有活化给料机的光，或激活馈线单独的光的。如果不正确，屋里的灯都关闭，持续3秒。在消光，消光刺激正确和不正确的反应仍然微不足道。插图显示的例子熟悉和陌生的刺激对。

3. 对于熟悉的刺激训练一个单间隔强迫选择（SIFC）任务
   1. 建立初始化，采样，确认和选择的全序列：在每次试验中，目前网络RST了IS（FR 3），那么无论这两个FS（2秒持续时间固定）的，然后再在IS（FR 1）。使用提示选择题的设计：在每次试验中，透照只选择其中的关键是正确的给定的FS。这一阶段的训练大约需要1周。
   2. 一旦主体可靠地执行（> 85％的反应的各侧键），介绍自由选择试验（在选择阶段透照两个侧面的键）。如果动物响应的正确的一面，提供2秒的粮食获得。不正确的反应都是其次超时处罚（观众席灯光熄灭2秒）。如果没有响应，3秒内发出，终止试用并重新启动ITI。动物平时学习2个星期内的任务，这些子组件。
   3. 在随后的会话逐渐增加自由选择试验的分数从20％到100％。
   4. 如果拍摄对象执行>在自由选择试验90％的正确，减少奖励的概率为正确的回应0.5而在平行增加每个会话的试验次数为1,000。不要更改参数天天/会话，但他们选择灵活根据有关初始化遗漏，并正确反应百分比主体的性能水平。这一阶段的训练将持续约4个星期。
   5. 鸽子往往拒绝回应不熟悉的刺激。因此，一旦动物能够可靠地执行> 1,000试验，自选图形应对大集视觉刺激（见1.2节）。但是，不要preexpose注定供以后使用作为最后的范式，但彩色显示器均匀新颖刺激的视觉刺激。
4. 最后的单间隔强迫选择任务与新刺激下不同加固条件
   1. 热身
      让受试者进行50次试验，只有在FS。设置奖励的概率为这些刺激，以<1（例如，0.5 - 0.8）在所有阶段，以防止过早饱食和，因此，缺乏动力响应的。
   2. 收购阶段
      随机交替试验与演示FS和生理盐水。分配不同的反应键作为正确的两个NS和强化每一个正确的回应。计算正确反应百分比的运行平均值在过去的120试验。收购被视为完整的一次为每个对NS的性能超过85％，但不是最低的150试验之前已经执行。
   3. 消光舞台
      停止补强正确和惩治不正确的反应，以一个随机的NS（消光刺激）。开始重新捕获阶段时，正确的响应灭绝的刺激降到低于60％，动物至少经历了150试验在这个阶段中总。
   4. 重新捕获阶段
      再次加强正确和惩罚不正确的反应，以消光刺激，如在收购阶段。终止会话时，这个刺激的表现超过85％和阿尼玛LS共进行至少150试验在这个阶段。

2，电

1. 电极植入
   植入手术发生动物后反复（3-4倍）完成整个采集灭绝，再获取序列并进行更详细的别处²⁵所述。
   1. 将5-6不锈钢microsrews头骨上的锚定牙科水泥头安装，包括微硬盘。
   2. 进行开颅手术略高于感兴趣的大脑区域;然后小心地解剖硬脑膜和降低电极至所需的位置。
   3. 前锚定微硬盘的磁头安装，应用凡士林围绕引导套管;这将防止牙科用粘固剂从包围所述导向管。
   4. 使用绝缘银球电极放置在颅骨上覆小脑地面之下。
   5. 提供动物的止痛药（卡洛芬，10毫克/ K克，注射，每天两次）三天手术。让动物恢复至少2周。
2. 录音虽然动物执行任务
   1. 在开始之前，请使用新的对新刺激的每个会话，并提前电极至少125微米（驱动螺杆半圈）。如果有足够的信号噪声比没有动作电位的观察，中止会话，将动物的笼子，然后重试的第二天。
   2. 排列的探头电缆，使得它不与动物的正常啄食和摄食行为干扰。这可以通过附加的连接线与多个弹性带的空调室的顶部和鸟类habituating到连接电缆一段时间来实现。
   3. 如果有的话，做一个换向器，为鸟类提供了运动的额外自由使用。
3. 离线信号分析
   1. 带-P屁股过滤器由500至5,000 Hz使用Spike2的陡峭滚降下线的所有通道。提取尖峰幅度阈值并进行排序采用手动主成分分析。
   2. 检查结果排序与自定义编写的MATLAB代码（可在MATLAB中心文件交换，文件编号＃37339）。良好的隔离单单元（ 图3）应符合以下所有条件：1）在主成分空间明显分开集群，多台机组二）没有任何迹象时，所有记录的波形叠加并绘制热图（ 图3A ），C）对称分布的峰值波形振幅（ 图3B），在整个会议d）稳定的记录就证明了不变的尖峰幅度（ 图3C），e）在前面的秒杀的不应期发生的没有或很少有秒杀活动（ 图3D），且至少2（SNR的信号-噪声比（SNR）是这里ðefined的平均尖峰波形，由噪声频带（2.5 ^个和值的所有波形的第一个bin中的分布为97.5 ^个百分位数））的修剪宽度除以最小值和最大值之间的差异。在图3所示的单元的SNR为3.9。
   3. 原道脱机运动有关的文物考察。当表示放弃渠道。
   4. 在关键啄发生电气构件都可以在极少数情况下被混淆与适当的尖峰波形。测试的录音通过检查尖峰时间直方图污染计算相对于每个注册的关键啄（围啄时间直方图，PPTH， 图3E）。啄引起的伪影显示为直方图接近峰值（±50毫秒），以时间为0。作为一个额外的检查，绘制在±20毫秒的关键啄的注册分别假定所有秒杀活动的波形，并比较它秒杀波形检测outsidË这个窗口（ 图3F）。

图3。质量度量单元隔离。 A）热，所有波形的时间-电压值B）的最大值（红色），最小值（绿色），和所有的噪声波形（蓝色）电压值的分布地图。该分布很好的分离，这表明优异的设备隔离。C）放电频率（红色，从2秒片段中的所有intertrial间隔计算）和尖峰振幅（峰-峰值）作为时间的会话函数。这两个曲线平滑与棚车功能（宽度：50个数据点）D）峰峰间隔分布的本机。滨宽，10毫秒（插图：1毫秒）。很短的时间间隔几乎不存在（<下4毫秒的时间间隔为0.1％）。 E）PSTH触发键啄。接近关键啄（±20毫秒）事件计数红色突出显示。 女性）在±20毫秒啄关键事件的记录全部157波形。波形媲美面板中A所示整体的波形形状

结果

行为

图4A显示了一个动物在一个实例中会话的行为表现。动物的表现水平达到标准的NS 2在180个试验（45刺激演示），并接近100％的NS从1开始。这一策略 - 首先响应相同的密钥进行新的刺激，然后调整反应的刺激之一 - 大约是经常观察到的初始随机响应两个NS。在这个会议上，南北2是随机选择接受灭绝，这意味着下面的这种刺激所有的选择保持无关紧要的（学习阶段?...

讨论

本协议描述适用于并发单机录制一个复杂的行为的任务。我们所描述的SIFC任务的鸽子，但它可以通过要求的鼻子戳或杆按下，而不是关键啄，而代以通过视觉嗅觉，听觉或触觉的刺激很容易地适应啮齿类动物。

也许是训练过程中最关键的步骤是：1）逐渐减少奖励概率和2）在试验的数目增加。对于间歇性强化的熟悉的刺激，我们决定奖励的概率从0.5到0.8;这些都足以产生稳定?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Resistance wire (for use as electrodes)	California Fine Wire, Grover Beach, CA, USA		Stablohm 675; formvar-coated nichrome wires (outer diameter 25 µm)
Microconnectors	Ginder Scientific, Nepean, Ontario, Canada		GS18PLG-220 (plug) & GS18SKT-220 (socket to build headstage)
Cannulae	Henke Sass Wolf, Tuttlingen, Germany		0.4 x 20 mm/ 27 Gx3/4"
Gold solution for plating	Neuralynx, Bozeman, MT, USA		SIFCO Process Gold Non-Cyanide, Code 5355
Solution for ultrasonic bath	Alconox, Inc., New York, USA	1304	Tergazyme
Conductive glue	Henkel Loctite		LOCTITE 3888 Silver filled, conductive, adhesive
Stainless steel screws	J.I. Morris, Southbridge, MA, USA		F0CE125 self-tapping miniature screws, body length 1/8 inches
Light-curing dental cement	van der Ven Dental, Duisburg, Germany		Omniceram Evo Flow A2
Light-curing unit	van der Ven Dental, Duisburg, Germany		Jovident Excelled 215 Curing Light (wireless LED light curing unit)
Filter amplifiers	npi electronic GmbH, Germany	DPA-2FS
A/D converter	Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK	power 1401
Spike2 software	Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK		Version 7.06a
MATLAB	The Mathworks, Natick, MA, USA		R2012a