动态钙的自动分析<sup&gt; 2 +</sup&gt;在图像序列信号

摘要

在这里，一种新型的基于排序的二维时间推移图像序列中分配给积极信号的地区最适合椭圆利益分析协议的区域是证明。该算法可以使研究人员综合分析生理的Ca ^{2 +}信号以最小的用户输入和偏见。

摘要

细胞内Ca ^{2 +}信号通常研究了用荧光^钙离子指 ​​示剂染料和显微镜技术。然而，Ca ^{2 +}的成像数据的定量分析是费时并受偏压。基于感兴趣区域（ROI）的检测区域自动信号分析算法已实施了一维的线扫描测量，但没有目前的算法集成在二维图像序列优化的识别和投资回报的分析。这里的算法进行快速采集和投资回报分析图像序列进行描述。它利用椭圆拟合到噪声滤波的信号，以确定最佳的ROI的位置，并且计算的Ca ^{2 +}信号的幅度，持续时间和空间扩散参数。该算法被实现为一个可自由查看的插件ImageJ的（NIH）的软件。连同开源的统计处理软件研发书面分析脚本，这种方法提供了一种高容量的管道，用于执行实验的输出的快速统计分析。作者认为，使用这种分析的协议会导致生理的Ca ^{2 +}信号的更全面和公正的表征。

引言

^钙离子是一种普遍存在的第二信使的信号分子和细胞内Ca ^{2 +}的水平受到高度监管。细胞内Ca ^{2 +}信号是复杂的，包括分离的瞬变，振荡，并传播波^{是1 - 4。}的Ca ^{2 +}的空间和时间的控制被认为是背后的生理信号的特殊性，因此对Ca ^{2 +}的信号模式的分析是相当大的兴趣在多个领域的⁵调查。

的Ca ^{2 +}指示剂染料如荧光4和Fura-2的通常用于测量细胞内Ca ^{2 +}信号用荧光显微镜^5-12。典型地，时间的Ca ^{2 +}信号被评价为用户定义的区域内的平均荧光随时间变化，或感兴趣区域（ROI）的^{5,6,13 - 16。}目前，人工ROI分析是既费时又劳力由于病程中它要求用户识别许多的ROI，并执行重复计算^{17 - 19。}这些技术也可能会受到相当大的用户错误，包括引进人工信号模式和排除低振幅或弥漫性信号^18,20。

自动ROI检测算法先前已采用多种统计方法，以确定最佳的ROI的位置实现的，但他们一般都限于线扫描或伪线扫描图像，这限制了分析，以一个单一的空间维度中时间¹⁷分析^{， 19 - 22。}此外，许多现有的算法都不足以涵盖钙，范围从周期性的，本地化的瞬态传播的波^{23,24 2 +}释放事件的多样性。生理的Ca ^{2 +}信号的综合评价通常进一步由显著图像ARTIF存在复杂行动是混淆信号，在许多实验系统噪音的歧视。

此前，自动ROI检测算法解决的Ca ^{2 +}信号瞬态检测，实现为插件NIH ImageJ的软件（卫生，马里兰州贝塞斯达的美国国家研究院），是开发和验证^25,26。这种算法，称为LC_Pro，目的是确定和分析的ROI无所不包的Ca ^{2 +}信号瞬态二维时间推移图像序列。在这里，一个实用的实验方案和算法猪冠状动脉内皮细胞的应用有代表性的示范提供，使用开源统计处理软件研发，生成可用的图形输出额外的后处理。

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研究方案

1，血管夹层和成像

1. 从国内少年猪一样的马腾斯等 ²⁷所描述的收获组织。将收获的猪右心室成聚二甲基硅氧烷（PDMS）含有HEPES缓冲生理盐水溶液（PSS）的底部夹层菜。
   1. 用立体显微镜的帮助下，解剖，取出左前从使用镊子和剪刀弹簧通过从周围的心脏组织的层去除血管区段周围组织降支冠状动脉（约8毫米长，0.5毫米直径）的片段。注意：小心不要刺破血管壁。
   2. 放置一个PDMS块（1×0.5×0.5公分）放入解剖盘，并用针将其脚的底部。削减约40微米直径的钨丝成十二个〜0.3厘米长段，形成m​​icropins，并把这些在盘子里。使用镊子，固定血管段的一端与一个micropi块Ñ​​。
   3. 小心地插入小弹簧剪刀成血管腔，并纵向切开向下容器的一侧，以完全打开。定位打开的血管段与内皮起来。
   4. 使用剩余的micropins以固定打开血管区段的边界方框，使得该容器形成一个扁平的矩形。注意：Micropin面应被弯曲到90°和插入，直到与块表面齐平。应小心，以拉伸容器制备而不过度拉伸;最终宽度应〜1.5倍的首发未拉伸宽度。
   5. 准备一个小体积的通过在HEPES混合的Fluo-4 AM（10μM）溶解在DMSO中与聚醚（0.03％）的Fluo-4AM加载溶液（〜1毫升）中缓冲的PSS（含有以mM计：134 NaCl的，​​6氯化钾，1氯化镁，10 HEPES，10葡萄糖），然后将整个块成在室温下在黑暗中约40分钟的加载溶液。
   6. 加载后，在HEPES缓冲洗块PSS 5-10分钟。
   7. 安装块到50〜100微米厚的垫片中含有HEPES缓冲PSS一个玻璃罩底部室。注：金属针可以用作间隔物​​，并确保血管区段朝下和不接触垫片。
   8. 放置在一个倒置显微镜配备的共焦成像的舞台腔，专注于内皮细胞层上。
   9. 为〜3分钟，在20倍的放大倍率，并使用共聚焦图像序列AQUISITION软件每秒〜8帧的帧速率基底相对荧光的采集时间间隔的图像序列。
   10. 后记录基础荧光〜3分钟，取代的HEPES缓冲液的PSS与P物质（PM 100）相同体积（约1毫升）溶解在HEPES缓冲的PSS，并记录为一个addtional 3分钟。

2，自动分析

1. 呈现荧光活性钙的共聚焦采集软件为8位，G图像序列（S）rayscale'。TIF“格式的文件，没有规模的信息。
2. 打开ImageJ的，单击文件菜单中的“打开”，然后选择在浏览器窗口中相应的图像序列中的ImageJ查看图像序列（S）。
3. 通过使用矩形ROI工具来估计活动的图像序列（次）内的空间传播的上限和下限确定一个适当的ROI的直径。注：平均长方形的直径为直径的投资回报率一个合适的选择。
4. 创建计算机硬盘驱动器上的一个新文件夹，并添加图像序列（S）到该文件夹​​目录。
5. 在ImageJ的，点击“插件”窗口，然后单击“LC_Pro”开始分析。
6. 进入投资回报直径值，然后选择过滤器的阈值（无论是0.05或0.01）。
7. 点击“药物治疗”复选框，并立即将药物加入前，后（以秒为单位）输入时间点的值。
8. 点击“确定”，并进入图像序列目录到文件浏览器窗口。

3，图形输出

1. 从下载R版本3.0.2 http://www.r-project.org/ 。
2. 打开32位版本的河
3. 点击“文件”，然后“打开脚本”，然后选择“traceplot.R'R脚本生成图形化的实验报告。
4. 通过选择“套餐”安装校准，并gplots包，“安装软件包”，并选择appropirate包。
5. 点击“文件”，然后“更改目录”命令，并使用资源管理器窗口中，选择对应于LC_Pro分析输出的目录。
6. 单击脚本窗口，然后在“运行所有'命令来运行该脚本。

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结果

自定义算法，LC_Pro，开发并为了实现来执行CA的自动分析的共聚焦图像序列^{2 +}动态。正如如图1所示，该算法采用顺序处理模块，A）检测和动态的Ca轨道站点^{​​2 +}更改上述统计（P <0.01），噪音，B），自动在活动现场中心定义的感兴趣区（ROI）区域， C）计算平均荧光强度的投资回报，以确定具体的事件参数。该算法的图形概述使用已知的强度和位置的计算机生成的...

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讨论

在细胞和多细胞水平进行译码复杂的Ca ^{2 +}信号，将需要严格的实验和分析方法。这里，这种方法描述了其中时间分辨共焦图象的Ca ^{2 +}依赖的荧光的序列进行识别及量化统计学相关的Ca ^{2 +}内完好蜂窝字段在特定情况下，信号表示的自动分析，动脉段是孤立从猪的心脏，寄托打开，露出内皮，装入的Ca ^{2 +}指示剂fluo-4 AM，受到共聚焦成像，并使用自定义算法LC_Pro评估。?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection dish	Fisher Sci	#08-772-70
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Fisher Sci	#NC9644388	elastomer kit, must be molded into dishes
HEPES-buffered PSS	Sigma	#H3375-250G	HEPES acid
Stereomicroscope	Nikon Inst.	#MNA42000
Forceps	Fine Science Tools	#11223-20
Spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
Tungsten wire	Scientific Inst Svcs	#406
Fluo-4 AM	Life Tech.	#F-14201
Pluronic F-127	Life Tech.	#P3000MP
Metal pins	Fine Science Tools	#26002-10
Cover-glass bottom chamber			Custom designed
Spinning disc confocal microscope	Perkin Elmer	RS-3
ImageJ software			download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
LC_Pro plugin for imageJ			download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html
R software			download at: http://www.r-project.org/
R traceplot script			download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing