ダイナミックカルシウムの自動分析<sup&gt; 2 +</supイメージシーケンス内の&gt;の信号

要約

ここでは2次元のタイムラプス画像シーケンス内で正の信号の領域に割り当てられたベストフィット楕円を分類に基づいて、関心の分析プロトコルの新規領域が示されている。このアルゴリズムは、包括的に、最小限のユーザ入力及びバイアスが生理のCa ^{2 +}シグナルを分析するために研究者を可能にすることができる。

要約

細胞内Ca ^{2 +}シグナルは、一般に蛍光性Ca ^{2 +}指示薬色素および顕微鏡技術を用いて研究されている。ただし、のCa ^{2 +}イメージングデータの定量分析は、時間がかかり、バイアスを受ける。関心領域（ROI）検出に基づく自動化された信号解析アルゴリズムは、一次元ライン走査測定のために実装されているが、二次元画像シーケンスにおけるROIの最適化された同定および解析を統合しない現在のアルゴリズムは存在しない。ここで、画像シーケンスにおけるROIの迅速な取得および分析するためのアルゴリズムが記載されている。これは、楕円が最適ROIの配置を決定するために、ノイズのフィルタリングされた信号に嵌合利用し、振幅、持続時間及び空間の広がりのCa ^{2 +}信号パラメータを計算する。このアルゴリズムは、ImageJの（NIH）ソフトウェアの自由に利用できるプラグインとして実装されました。一緒に、オープンソースの統計処理ソフトウェアRのために書かれた解析スクリプトと、このアプローチは、実験的な出力の迅速な統計分析を行うための大容量のパイプラインを提供する。著者らは、この分析のプロトコルの使用は、生理的なCa ^{2 +}のシグナリングのより完全で公平な特性評価につながることを示唆している。

概要

Ca ^{2 +}の^は、分子および細胞質のCa ^{2 +}レベルを高度に制御されているシグナルユビキタスセカンドメッセンジャーである。細胞内Ca ^{2 +}シグナルは複雑であり、孤立トランジェント、振動、および伝搬波¹は、 ^{- 4。}のCa ^{2 +}の空間的および時間的制御は、生理学的シグナルの特異性の根底にあると考えられ、そのためのCa ^{2 +}信号パターンの分析は、複数のフィールド⁵内の研究者にかなりの関心がある。さ

このようなのFluo-4およびフラ-2としてのCa ^{2 +}インジケーター色素は、一般に、蛍光顕微鏡^5-12で細胞内Ca ^{2 +}シグナルを測定するために使用される。 ^{16 -}一般的に、時間的なCa ^{2 +}の信号は、時間依存ユーザ定義領域内の平均蛍光の変化、または関心領域^{（ROI）5,6,13}として評価されます。現在、手動のROI分析は、時間と労力の両方である^{19 -}それは多くのROIを特定し、反復計算を^17を実行するために、ユーザーが必要なため、緊張を引き起こす。これらの技術は、人工信号モードと低振幅またはびまん性信号^18,20の除外の導入など、かなりのユーザーエラーを受ける可能性がある。

^自動 ROI検出アルゴリズムは、以前に最適なROIの配置を決定するための統計的アプローチの様々な方法を用いて実現されているが、それらは一般にライン走査または時間¹⁷に単一の空間次元に分析を制限する擬似ラインスキャン画像の分析に限られていた^{19から22。}さらに、多くの既存のアルゴリズムは、Ca、定期的、局所的な過渡からの伝搬波^23,24の範囲^{2 +}放出事象の多様性を包含するのに十分ではありません。生理的なCa ^{2 +}の信号の総合評価は、多くの場合、さらに重要な画像ARTIFの存在によって複雑になる多くの実験系でのノイズの判別に信号を混乱させる行為。

以前は、カルシウム²への自動ROI検出アルゴリズム溶液は⁺トランジェント検出を知らせる、NIH ImageJソフトウェア（国立衛生研究所、ベセスダ、MD）用のプラグインとして実装され、開発され^、25,26を検証した。 LC_Proと呼ばれるこのアルゴリズムは、二次元のタイムラプス画像シーケンス内のCa ^{2 +}シグナルトランジェントを取り囲む関心領域を識別し、分析するために設計した。ここでは実際的な実験プロトコルおよびブタ冠動脈内皮におけるアルゴリズムの適用を代表するデモンストレーションが使えるグラフィカルな出力を生成するために、オープンソースの統計処理ソフトウェアRを使用して、追加の後処理で、提供されています。

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プロトコル

1。血管解剖とイメージング

1. マルテンスら ²⁷に記載されているように、国内の幼若豚から収穫組織。ポリジメチルシロキサン（PDMS）、HEPESは、生理食塩水（PSS）にバッファリングを含む底の解剖皿に採取したブタの右心室に配置します。
   1. 実体顕微鏡を用いて、周囲の心臓組織層から血管セグメントを除去することによって、鉗子とスプリングはさみを使用して周囲の組織から冠状動脈（〜8mmの長さ、直径0.5mm）を左前のセグメントを分析し、取り除く。注：血管壁に穴を開けないように注意してください。
   2. 解剖皿に、PDMSブロック（1×0.5×0.5 cm）の配置し、底にそれを固定するために、針を使用しています。 micropinsを形成し、12〜0.3センチメートル長のセグメントに約40μmの直径のタングステン線をカットし、皿にそれらを配置します。鉗子を用いて、micropi有するブロックに血管セグメントの一端を固定するN。
   3. 慎重に血管内腔に小さな春のはさみを挿入し、それを完全に開くように、容器の1面下に縦方向に切断。内皮を上にして開いた血管部分を向けます。
   4. 容器は平坦な長方形を形成するようにブロックするために開かれた血管セグメントの境界を固定するために、残りのmicropinsを使用する。注：マイクロピントップは90°に屈曲し、ブロック表面と同じ高さまで挿入する必要があります。ケアは過延伸することなく、容器の準備を伸ばすように注意する必要があります。最終的な幅が始まる未延伸幅1.5倍〜でなければなりません。
   5. 134のNaCl、6塩化カリウム：HEPES中ロニック（0.03％）でDMSOに溶解したFluo-4 AM（10μM）を混合したFluo-4 AMローディング少量の溶液（〜1ミリリットル）を調製mMのInを含むPSSが（バッファー、1塩化マグネシウム、10 HEPES、10グルコース）、暗所で室温で約40分間のローディング溶液中にブロック全体を挿入します。
   6. 充填後、HEPES緩衝内のブロックを洗う5〜10分間PSS。
   7. HEPESを含むカバーガラス下部チャンバーに50〜100ミクロンの厚さのスペーサーの上にブロックをマウントするには、PSSにバッファリングされた。 NOTE：金属ピンがスペーサとして使用され、血管セグメントが下向きとスペーサに触れていないことを確認することができる。
   8. 共焦点イメージングのために備えた倒立顕微鏡のステージ上のチャンバを配置し、内皮​​細胞層に焦点を当てています。
   9. 20X倍率共焦点画像シーケンスの初期同期ソフトウェアを使用して毎秒約8フレームのフレームレートで約3分間、基底相対蛍光のタイムラプス画像シーケンスをキャプチャする。
   10. 基底蛍光を記録〜3分後、交換しHEPESをHEPESに溶解したサブスタンスP（pMの100）の同じ体積（〜1ml）でPSS溶液を緩衝PSSを緩衝し、addtionalの3分間の記録。

2。自動化された分析

1. 8ビット、gと共焦点入手ソフトウェアからの蛍光カルシウム活性の画像シーケンス（単数または複数）をレンダリングするなしスケール情報とrayscale '。TIF」形式のファイル。
2. オープンImageJのは、[ファイル]メニューの「開く」をクリックし、ImageJの画像シーケンス（複数可）を表示するエクスプローラウィンドウで適切な画像シーケンスを選択します。
3. 画像シーケンス（S）内の活動の空間的な広がりの上下の境界を推定するために、長方形のROIツールを使用して、適切なROIの直径を決定します。注：平均長方形の直径は、ROIの直径はぴったりの選択です。
4. コンピュータのハードドライブに新しいフォルダを作成し、フォルダのディレクトリ内に画像シーケンス（複数可）を追加します。
5. ImageJのでは、分析を開始するには、 'LC_Pro」をクリックし、「プラグイン」ウィンドウをクリックします。
6. ROIの直径値を入力し、フィルタ閾値（0.05または0.01のいずれか）を選択します。
7. 「薬物治療」チェックボックスをクリックし、すぐに前と後に、薬剤を添加した時間（秒単位）のポイント値を入力します。
8. 「OK」をクリックし、ファイルエクスプローラウィンドウに画像シーケンスのディレクトリを入力します。

3。グラフィカル出力

1. からRバージョン3.0.2をダウンロードしてくださいhttp://www.r-project.org/ 。
2. Rの32ビットバージョンを開く
3. 「ファイル」は、「開いているスクリプト」をクリックして、グラフィカルな実験​​的なレポートを生成するための「traceplot.R 'のRスクリプトを選択します。
4. 「パッケージ」を選択することで、キャリブレーション、およびgplotsパッケージをインストール、「パッケージをインストール」、およびappropirateパッケージを選択する。
5. 'fil​​e'をクリックして、「ディレクトリ変更」コマンド、およびLC_Pro分析出力に対応するディレクトリを選択するようにエクスプローラウィンドウを使用します。
6. スクリプトウィンドウをクリックし、「すべてを実行 'スクリプトを実行するコマンド。

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結果

カスタムアルゴリズム、LC_Proは、Ca ^{2 +}の共焦点画像シーケンスダイナミクスの自動分析を実行するために開発され、実施された。 図1に示されるように、アルゴリズムは動的のCa ^{2 +}のA）を検出し、追跡する部位が、統計的に（p <0.01）ノイズの上方に変更逐次処理モジュールを利用し、B）が自動的に活性部位の中心に関心領域（ROI）を定義し、 C）特定のイベン...

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ディスカッション

細胞および多細胞レベルでの複雑なCa ^{2 +}の信号を復号化することは、厳密な実験·分析的アプローチが必要になります。ここで、アプローチのCa ^{2 +}依存性蛍光の解決共焦点画像シーケンスが提示される特定の場合には、無傷の細胞のフィールド内に統計的に関連のCa ^{2 +}シグナルを識別し、定量化する自動化された分析に供された時間に記載されている、動脈セグメン?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection dish	Fisher Sci	#08-772-70
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Fisher Sci	#NC9644388	elastomer kit, must be molded into dishes
HEPES-buffered PSS	Sigma	#H3375-250G	HEPES acid
Stereomicroscope	Nikon Inst.	#MNA42000
Forceps	Fine Science Tools	#11223-20
Spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
Tungsten wire	Scientific Inst Svcs	#406
Fluo-4 AM	Life Tech.	#F-14201
Pluronic F-127	Life Tech.	#P3000MP
Metal pins	Fine Science Tools	#26002-10
Cover-glass bottom chamber			Custom designed
Spinning disc confocal microscope	Perkin Elmer	RS-3
ImageJ software			download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
LC_Pro plugin for imageJ			download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html
R software			download at: http://www.r-project.org/
R traceplot script			download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing