Analyse automatisée de dynamique Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signaux de séquences d&#39;images

Résumé

Voici une nouvelle région d'intérêt protocole d'analyse basée sur le tri des ellipses meilleur ajustement attribués aux régions de signal positif dans le temps à deux dimensions image laps séquences est démontrée. Cet algorithme peut permettre aux enquêteurs d'analyser de manière approfondie les ^signaux physiologiques ⁺ Ca ² avec entrée minimale de l'utilisateur et de partialité.

Résumé

Ca ^{2 +} intracellulaire signaux sont couramment étudiées avec des colorants fluorescents de ^{Ca2 +} de l'indicateur et les techniques de microscopie. Cependant, l'analyse quantitative de Ca ^{2 +} de données d'imagerie prend du temps et soumis à polarisation. Automatisés algorithmes d'analyse de signal selon la région d'intérêt (ROI) de détection ont été mises en œuvre pour les mesures de balayage de ligne unidimensionnelle, mais il n'y a pas de courant algorithme qui intègre l'identification optimisé et l'analyse de ROI dans des séquences d'images en deux dimensions. Voici un algorithme pour l'acquisition rapide et l'analyse de ROI dans des séquences d'images est décrit. Il utilise des ellipses correspondent aux signaux filtrés de bruit afin de déterminer le placement de ROI optimal, et calcule Ca ^{2 +} paramètres de signal d'amplitude, la durée et la diffusion spatiale. Cet algorithme a été mis en œuvre comme un plug-in disponible gratuitement pour ImageJ (NIH) des logiciels. Avec son analyse écrites pour le open source logiciel de traitement statistique R,cette approche fournit un gazoduc à haute capacité pour l'analyse statistique rapide de la production expérimentale. Les auteurs suggèrent que l'utilisation de ce protocole d'analyse conduira à une caractérisation plus complète et impartiale de signalisation physiologique ⁺ Ca ^2.

Introduction

Ca ^{2 +} est un second messager ubiquitaire molécule de signalisation et de Ca ^{2 +} cytosolique niveaux sont très réglementés. Ca ^{2 +} intracellulaire signaux sont complexes et comprennent transitoires isolés, oscillations, et la propagation d'ondes ^{1 - 4.} Contrôle spatial et temporel de Ca ^{2 +} est pensé à la base physiologique spécificité du signal, et donc l'analyse de Ca ^{2 +} modèles de signaux est d'un intérêt considérable pour les chercheurs dans de multiples domaines ^5.

Colorants Ca ^{2 +} d'indicateurs tels que le Fluo-4 et Fura-2 sont couramment utilisés pour mesurer Ca ^{2 +} signaux intracellulaires avec la microscopie à fluorescence ^5-12. Typiquement, Ca ^{2 +} signaux temporels sont évalués comme des changements en fonction du temps de fluorescence moyenne dans une zone définie par l'utilisateur, ou de la région d'intérêt (ROI) ^{5,6,13 - 16.} Actuellement, l'analyse manuelle de ROI est à la fois beaucoup de temps et de travail danstensive, car il oblige les utilisateurs à identifier de nombreux ROI et effectuer des calculs répétitifs ^17-19. Ces techniques peuvent également faire l'objet d'une erreur d'utilisation considérable, y compris l'introduction de modes de signaux artificiels et l'exclusion de faible amplitude ou signaux diffus ^18,20.

Des algorithmes de détection de ROI automatisés ont déjà été mises en œuvre en utilisant une variété de méthodes statistiques pour déterminer le placement de ROI optimal, mais ils ont généralement été limitée à l'analyse de balayage de ligne ou pseudo-ligne des images numérisées, ce qui limite l'analyse à une seule dimension spatiale dans le temps ^{17, 19-22.} En outre, de nombreux algorithmes existants ne sont pas suffisants pour couvrir la diversité de Ca ^{2 +} des événements de relâchement qui vont de périodiques, transitoires localisées à des ondes se propageant ^23,24. Évaluation complète de Ca ^{2 +} signaux physiologiques est souvent compliquée par la présence d'image significative artifLoi qui confond signal discrimination de bruit dans de nombreux systèmes expérimentaux.

Auparavant, une solution de l'algorithme de détection de ROI automatisé de Ca ^{2 +} signal de détection de transitoires, mis en œuvre sous forme de plugin pour le logiciel NIH ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD), a été développé et validé ^25,26. Cet algorithme, appelé LC_Pro, a été conçu pour identifier et analyser ROI englobant Ca ^{2 +} transitoires du signal en deux dimensions laps de temps des séquences d'images. Voici un protocole expérimental pratique et de démonstration représentant d'une application de l'algorithme dans porcine endothélium des artères coronaires est fourni, avec post-traitement supplémentaire utilisant l'open source logiciel de traitement statistique R pour générer une sortie graphique utilisable.

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Protocole

1. Dissection du navire et de l'imagerie

1. tissu de récolte de porcs domestiques mineurs comme décrit dans Martens et al ^27. Placez ventricules droit porc récoltés dans un polydiméthylsiloxane (PDMS) plat de dissection fond contenant HEPES solution saline tamponnée physiologique (PSS).
   1. A l'aide d'un stéréomicroscope, disséquer et enlever une partie de la descendante antérieure gauche Artère coronaire (~ de longueur 8 mm, diamètre 0,5 mm) dans les tissus adjacents à l'aide des pinces et des ciseaux à ressort en enlevant le segment de vaisseau à partir des couches de tissu cardiaque environnantes. REMARQUE: Prenez soin de ne pas percer la paroi du vaisseau.
   2. Placez un bloc de PDMS (1 x 0,5 x 0,5 cm) dans le plat de dissection, et utiliser une aiguille à la broche au fond. Couper un fil de tungstène d'environ 40 um de diamètre en douze segments ~ 0,3 cm de longueur, formant micropointes, et placez-les dans le plat. En utilisant des pinces, fixer une extrémité du segment de vaisseau de la séquence ayant une Micropin.
   3. Insérez délicatement petits ciseaux à ressort dans la lumière du vaisseau, et couper longitudinalement sur un côté du navire pour l'ouvrir complètement. Orientez le segment de vaisseau ouvert avec l'endothélium haut.
   4. Utilisez les micropointes restant à sécuriser les frontières du segment de vaisseau ouvert pour bloquer telle que le navire constitue un rectangle plat. NOTE: les dessus de Micropin doivent être pliés à 90 ° et jusqu'à insérés en affleurement avec la surface du bloc. Il faut prendre soin d'étirer la préparation du navire sans surexploiter; largeur finale devrait être ~ 1,5 x la largeur non étirée de départ.
   5. Préparer un petit volume (environ 1 ml) de Fluo-4 solution AM de chargement par le mélange Fluo-4 AM (10 uM) dissoute dans du DMSO avec Pluronic (0,03%) dans un tampon HEPES tamponné PSS (contenant en mM: 134 NaCl, 6 KCl , une MgCl, 10 HEPES, 10 glucose), et insérer le bloc entier dans la solution de charge pendant environ 40 min à température ambiante dans l'obscurité.
   6. Après le chargement, laver le bloc dans tamponnée HEPESPSS pendant 5-10 min.
   7. Monter le bloc sur 50-100 um entretoises d'épaisseur dans une chambre inférieure lamelle contenant tamponnée HEPES PSS. NOTE: les repères de métal peuvent être utilisées comme entretoises et assurent le segment de vaisseau est orientée vers le bas et ne se touchant pas les éléments d'espacement.
   8. Placer la chambre sur la platine d'un microscope inversé équipé pour l'imagerie confocale, et se concentrer sur la couche de cellules endothéliales.
   9. image laps de temps de capture des séquences de fluorescence relative de base pour ~ 3 min à un grossissement de 20x et un taux de ~ 8 images par seconde en utilisant le logiciel séquence d'aquisition d'image confocale de cadre.
   10. Après ~ 3 min d'enregistrement fluorescence basale, remplacer une solution tamponnée HEPES PSS avec le même volume (~ 1 ml) de substance P (100 pM) dissous dans tamponnée HEPES PSS, et record pour une addtional 3 min.

2. Analyse automatique

1. Rendre séquence (s) de l'image de l'activité du calcium fluorescent à partir du logiciel d'acquisition en tant que confocal à 8 bits, grayscale fichiers «. tif" format avec aucune information à grande échelle.
2. Ouvrir ImageJ, cliquez sur 'Ouvrir' dans le menu Fichier, puis sélectionnez la séquence d'image approprié dans la fenêtre de l'explorateur pour voir la séquence (s) de l'image dans ImageJ.
3. Déterminer un diamètre approprié de la ROI à l'aide de l'outil de ROI rectangulaire pour estimer des limites supérieure et inférieure de la propagation spatiale de l'activité à l'intérieur de la séquence (s) d'image. REMARQUE: Le diamètre moyen rectangulaire est un choix approprié pour un diamètre de ROI.
4. Créez un nouveau dossier sur le disque dur de l'ordinateur, et ajouter la séquence (s) de l'image dans le répertoire du dossier.
5. Dans ImageJ, cliquez sur la fenêtre 'plugins, puis cliquez sur «LC_Pro' pour lancer l'analyse.
6. Entrez la valeur de retour sur investissement de diamètre et sélectionner la valeur de seuil de filtration (soit 0,05 ou 0,01).
7. Cliquez sur la case «traitement de la toxicomanie» et entrez les valeurs des points de temps immédiatement avant et après la drogue a été ajouté (en secondes).
8. Cliquez sur «OK», etentrer dans le répertoire de séquences d'images dans la fenêtre explorateur de fichiers.

3. Sortie graphique

1. Télécharger la version 3.0.2 de R http://www.r-project.org/ .
2. Ouvrez la version 32 bits de R.
3. Cliquez sur "Fichier", puis "scénario ouvert» et sélectionnez le script 'traceplot.R' R pour générer des rapports graphiques expérimentales.
4. Installez le calibrage, et des paquets de gplots en sélectionnant «paquets», «installer des paquets», et en sélectionnant les paquets justificative utile.
5. Cliquez sur «Fichier», puis «répertoire de changement» de commande, et utiliser la fenêtre de l'explorateur pour sélectionner le répertoire qui correspond à la sortie de l'analyse LC_Pro.
6. Cliquez sur la fenêtre de script, puis le 'exécuter tous »commande pour exécuter le script.

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Résultats

Un algorithme personnalisé, LC_Pro, a été développé et mis en œuvre afin d'effectuer une analyse automatisée de Ca ^{2 +} dynamique sur des séquences d'images confocale. Comme le montre la figure 1, l'algorithme utilise des modules de traitement séquentiel que A) détecte et sites piste de dynamique Ca ^{2 +} changer dessus statistique (p <0,01) bruit, B) définir des régions d'intérêt (ROI) automatiquement dans les centres de site actif, et C) calculer l&#...

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Discussion

Décodage Ca ^{2 +} signaux complexes au niveau cellulaire et multicellulaire nécessitera des approches expérimentales et analytiques rigoureux. Ici, une approche est décrite dans laquelle résolus séquences d'images confocale de Ca ^{2 +} fluorescence dépendante sont soumis à une analyse automatisée qui identifie et quantifie Ca ^{2 +} signaux statistiquement pertinentes dans les domaines cellulaires intactes Dans le cas spécifique présentés, un segment d'artère a été isolé...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection dish	Fisher Sci	#08-772-70
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Fisher Sci	#NC9644388	elastomer kit, must be molded into dishes
HEPES-buffered PSS	Sigma	#H3375-250G	HEPES acid
Stereomicroscope	Nikon Inst.	#MNA42000
Forceps	Fine Science Tools	#11223-20
Spring scissors	Fine Science Tools	15003-08
Tungsten wire	Scientific Inst Svcs	#406
Fluo-4 AM	Life Tech.	#F-14201
Pluronic F-127	Life Tech.	#P3000MP
Metal pins	Fine Science Tools	#26002-10
Cover-glass bottom chamber			Custom designed
Spinning disc confocal microscope	Perkin Elmer	RS-3
ImageJ software			download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
LC_Pro plugin for imageJ			download at: http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/lc-pro/index.html
R software			download at: http://www.r-project.org/
R traceplot script			download at: https://docs.google.com/file/d/0B-PSp1D9e2fjV3NIcGppUzkxdEk/edit?usp=sharing