转录动力学的脑组织样本在行为经验综合分析

摘要

This manuscript describes a protocol that applies comprehensive profiling for analysis of transcriptional programs induced in specific brain nuclei of rodents following behavioral paradigms. Herein, this approach is illustrated in the context of profiling genes induced in the nucleus accumbens (NAc) of mice following acute cocaine exposure, utilizing microfluidic qPCR arrays.

摘要

在大脑和长期记忆巩固经验的编码依赖于基因转录。识别编码经验的特定基因的功能的分子神经科学的主要目标之一。此外，确定基因与特定行为的功能联系对于理解神经精神疾病的基础意义。感应的鲁棒转录方案已在下列各种行为操作小鼠的大脑中观察到。而一些遗传元件被用于循环地以下不同行为的操作和在不同脑核，转录方案是整体独特的诱导刺激物和它们所研究^1,2的结构。

在本出版物，协议是针对操纵行为的描述，从小鼠脑核强大和全面的转录谱。该协议中演示了在细胞核中基因表达的动力学分析的情况下伏隔急性可卡因经验。随后到体内的经验定义，目标神经组织被解剖;其次是RNA纯化，反转录和利用微阵列为多个目标基因的综合定量PCR分析。该协议是着眼于全面的分析（处理50-500个基因）限制原料的数量，如小的大脑标本，甚至单个细胞。

该协议是对多个样品的平行分析（ 如单细胞，动态分析下列药物，病毒或行为紊乱）最有利的。然而，该协议也可以事先对全基因组研究中起到了样品的特性和质量保证通过微阵列或RNAseq，以及从全基因组研究中获得的数据的验证。

引言

大脑的充满活力的组织能够认知和行为的灵活性。经验是通过神经元之间的连接的结构和强度的变型在大脑³编码。这个“经验依赖性可塑性”是诱导特异性基因表达，可提供必要的蛋白质的突触结构和强度⁴的变形例的模式的结果。基因调控网络的识别中介长期记忆的形成是分子神经科学的核心原则，并期望识别转录程序的主导因素将提供洞察调节记忆的形成，以及对目标的基本原则治疗神经变性和神经精神障碍。转录程序展开在时间上定义的波，其中每一个编码的基因不同的字符，这是当d重要ifferent阶段的信号事件^1,2的结果的执行情况。因此重要的是要解决的转录动力学进行了详细的时间时间表，以便确定诱导的基因的全面补充，并洞察他们的潜在功能，根据自己归纳的动态。

吸毒是造成药物滥用的神经回路在大脑^5,6长期影响的经验依赖可塑性强大的表单。最初，急性暴露于药物可能导致成瘾的发展和过渡到长期使用。上下文信息是网瘾发展的关键因素。药物相关环境线索在药物滥用者的头脑中分配显著重要性。上下文信息，提醒过往用药经验滥用药物可诱发复吸毒品的渴求，甚至禁欲以下长时间的药物暴露^7,8。因此，重要的临床挑战成瘾-成瘾的倾向，停药后症状已经消退⁹复发甚至长。

行为敏可卡因是可卡因经验的毒瘾机制的研究很有用一个简单的模型。在本作中持久过敏引起的慢性接触到滥用药物被广泛研究的模式，鼠类首先习惯于注射生理食盐水（腹腔，IP）的一个新的环境中（一个开放的领域腔中的自发活动监测） ;然后，他们收到可卡因每天注射，在旷场箱，而它们的活性被监测^10（ 图1）。这种行为模式通常导致的自发行为（8-12倍以上的基线活动^）11，这是保持以下停止注射可卡因数月的强劲敏，显示了PERV的形成的用药经验asive记忆痕迹。

奖励的神经回路，自然参与加强行为的一个物种的成功（ 例如喂食，性别）必不可少的，是由药物滥用，加强药物相关的行为^12,13的利用。由药物滥用的经验增强的分子和细胞机制似乎是类似的底层声明或语义记忆在其他大脑结构¹⁴的形成机制。因此，该行为敏化模型的稳健性，使其成为有吸引力的模型系统来研究的经验依赖性可塑性机制。

伏隔核（NAC）是大脑奖励环路的中央集成商，并已被广泛使用成瘾^5,6的发展有关。瘾的形成取决于在伏隔核的新的蛋白质的转录，并在鲁棒的结构清晰的转录程序duction是在伏隔核以下可卡因经验^15-19 观察到可卡因曝光的急性转录反应是可能的，多层次的，以适应于强诱导刺激，并直接生产新的蛋白质的功能即负责通过照射诱发的药物^6,19-22的结构和电学的改变。

为了促进的经验依赖性可塑性在大脑中的分子机制的研究中，一个协议被描述为转录动力学的脑组织样品中的下列行为操作的全面分析。该协议说明的行为经验研究的生活更轻松实验室环境 - 行为敏可卡因，利用微流体动态数组进行转录分析。中描述的协议显然不限于学习吨他细胞核中行为敏化的背景下伏，而是可以应用到大量的行为范例和大脑区域。事实上，这个协议可以被应用到身体组织中的外脑，和各种经历或生物体的操作的影响。

该协议被粗略地分为四个步骤。在第一步骤中，将动物进行的行为模式;在第二步骤中，组织是显微切割的;在第三步骤 - 的mRNA的纯化，逆转录和探测，并在最后的步骤中的数据进行了分析。

在研究转录动力学的情况下，精确定时的经验和定义可能是最重要的实验参数来控制。出于这个原因，我们的行为选择的模式是，行为敏可卡因，一种系统，其允许实验者控制的高含量超过experien的参数CE。提供额外的行为范式，使精确定时和解决不同型号的经验依赖可塑性和记忆的形成。这些模型包括恐惧条件^23，急性丰富环境^24,25，新物体探索^26项黑暗饲养²⁷的视觉体验。然而，行为敏可卡因是一贯稳健的操纵行为，创造一个高度普遍的记忆痕迹而持续数月以下的可卡因经验^28。

大脑切片，随后是伏隔核的手工显微​​切割。一直以来，我们的经验，从快速制备脑切片手工显微切割提供提取相关的行为范例组织的最可靠和快速的方法，并且有经验的，组织的边界变得明显和容易地识别。另外，精细的切片可以prepar编，接着通过激光捕获显微切割。虽然这种方法能够高度限定的感兴趣区域的分界，它是慢（因而冒不稳定的mRNA的丢失），繁琐，并且需要昂贵的专用设备（配有激光捕获设置的显微镜）。本文所定义的协议，也可以适用于单细胞转录分析，通过使用膜片移液管²⁹在视觉上识别细胞的细胞质中的手动抽吸。要注意的是所描述的协议提供了人口平均，而这是极可能的是，在大多数情况下，在组织内的细胞中，只有亚群实际参与反应的经验是很重要的。这是感兴趣的，从特定的细胞群响应经验内轮廓的转录以选择性方式，但这些方法的讨论已超出当前范围。

对于mRNA的纯化，反转录和定量PCR的查询中，组织是通过细针，其次是市售试剂盒的使用传递给它打乱了（有关详细信息，请参阅表8）。的选择是通过用这些方法，这确保了高品质的RNA和从下游应用健壮的结果可靠提取经验得知。

而该协议描述了用于高通量定量PCR使用动态阵列，样品可以用终点PCR，低通量定量PCR，基因表达的微阵列或深度测序被探测的基因表达。偏爱高通量定量PCR使用动态阵列是由于mRNA的脑细胞得到下列行为范例是常常限制量的事实。动态数组提供了一个平台，使成绩单高效综合分析从一个单一的实验大量平行样品。最初的收购微流体系统（通常是机构PU后rchase），实验是相对便宜的运行。根据这一分析，可以用更昂贵的平台，以寻找新的成绩单（由微阵列或RNAseq）与动态数组提供质量保证全面的参考来进行样品的进一步查询。最后，对数据进行分析，标准的方法被利用​​。对于可能出现的问题的具体指针将在协议的文本进行讨论。

该协议是最适合感兴趣的是他们的利益制度进行彻底的调查调查，研究多个条件和重复。该协议也是谁已经磨练中（通过微阵列或RNAseq实验）在50-500基因的兴趣，他们有兴趣在反复询问一个子集，研究者最合适的。

研究方案

注：该协议遵循耶路撒冷希伯来大学的动物护理指引。

1，准备学联解决方案

1. 如表1中所述制备ACSF溶液。车型1升在DDH _{2 O（>} 18兆欧的纯度），使渗透压〜300毫渗透摩尔/升以适当添加水或氯化钠。

2，设备及室内设置

该设备用于监控的可卡因诱导的运动行为由行为室（50×45cm）上连接有内光源，风扇和相机（或红外传感器），并配有在其内的有机玻璃箱（30×30厘米）该小鼠可以自由移动，同时其运动受到监视。在行为测试应1小时之间灯之后进行到1小时灯之前关闭，在常规的光/暗循环。动物要坚持在每天同一时间进行培训。

1. 连接​​摄像机或红外线系统到一个适当的系统监测和记录小鼠的自发行为。
2. 清洗每次试验用小鼠设施和/或除臭剂提供消毒后的腔室，以防止嗅觉提示偏压，并确保适当的消毒。

重要提示：当处理的小鼠安静，冷静和谨慎。

3，动物准备

1. 众议院5 C57BL6雄性小鼠（6-12周龄〜25〜35克的重量）每笼，在一个配有12小时的光/暗周期和免费获得食物和水，按照标准和当地的动物的要求护理委员会的指导和协议。在启动实验，权衡小鼠和日志数据。可卡因是根据小鼠的体重后施用。
2. 在开始第一次庭审前将全部含有老鼠进入室内行为30分钟的笼子里。
3. ，观察者所有的在实验中使用的小鼠对实验者处理剂，注射剂，并在行为设置监测。这是通过加入250μl盐水连续3次每日腹膜内注射，如下所述来实现。
4. 辖腹膜内注射250μl的生理盐水。紧接在注射，将鼠标在一个行为室来监测运动活性15分钟。每天重复这个动作，连续3天，在相同的时间。
5. 在第四天，分化的小鼠分成两组。制备可卡因的原液在2毫克/毫升的盐水中。管理一个单一的注射可卡因溶液（最后20毫克/千克）的实验组根据鼠标的重量（ 如 25 G滑鼠-注入250微升，而30克鼠标将获得300微升）。施用生理盐水的对照组。紧接射出，将鼠标20分钟的行为室监测自发活动（炎热的典型盟友，前15分钟进行监控）。
6. 可卡因注射后，牺牲小鼠在不同时间点（0，1，2，4，8和24小时以下的注射）。重要的是，确保参考老鼠（0时刻）将不会收到任何注射的这一天。由于其重要性，就必须有参​​照组的复制。

4，解剖的伏隔核

1. 麻醉的小鼠用异氟烷在可卡因/盐水注射后适当的时间。异氟醚必须直接排放走出了房间。因此，该程序应在通风橱中进行。
2. 通过测试后足部反射监测麻醉深度。捏爪子引发的动物提款回应。动物，显示了反射是不是麻醉的手术水平，而不是在国家安乐死。
3. 提取的大脑：
   1. 断头安乐死鼠标。
   2. 删除上面的头骨中间的皮，切用锋利的剪刀头骨。
   3. 将剪刀在那里的脊髓进入脑中（枕骨大孔）点，使两侧切口。
   4. 从同一点，使沿矢状缝长矢状切。在到达嗅球，夹在左侧和右侧。
   5. 有镊子，小心地取出颅骨，抓颅骨各占一半牢固，拉在一旁，小心不要按到或损伤大脑。
   6. 取出大脑，而通过使用一个倒置的微勺铲切断脑神经。
4. 将大脑中的冰冷ACSF溶液1-2分钟来冷却和硬化。
5. 从学联取出大脑，灯芯多余的液体用纸巾，创造小脑和大脑的其余部分之间的冠状切口和胶水的脑，有喙的部分朝上，上vibratome阶段。
6. 切割的伏隔核：
   1. 维持学联的解决方案，在冰冷的气温在vibratome的切片室。在200微米到伏隔核（NAc的）部分被清楚地识别根据Paxinos和Franklin小鼠脑图谱（约1.8毫米前到前囟门;注意胼胝体，前连合的位置和形状的形状和心室，以及在脑切片的整体的形态）。在这一点上，创建两个400微米的部分，从该伏隔将解剖。
   2. 根据立体镜，用细刀片从解剖切片的伏隔核区域了。根据Paxinos和Franklin小鼠脑图谱的伏隔核的定义，并可以方便地通过在组织上的刀片4快速传递解剖中相应的部分。 （ 图2）。
   3. 将立刻伏隔段在离心管和存储900微升的Trizol裂解试剂在-80°C，直到RNA的抽行动。

5，RNA提取和cDNA反转录

1. 解冻含核管伏在Trizol试剂裂解试剂部分在室温下和均化用1ml注射器连接至25g针溶解物直至组织完全均化（至少15-20倍）。第一几轮是困难的，并且需要推压管的壁的组织，以将其分解到小块可能进入针的尖端。
2. 以确保均质，吸管溶解物到QIAshredder微型旋转柱和离心机以12,000 xg离心1分钟。
3. 根据制造商的说明吸管溶解物到新的离心管中，并提取RNA。存储所述RNA在-80℃直到使用。
4. 测量RNA浓度，使用生物分析仪或等同设备分析的完整性和质量。使用100-500纳克的RNA每一轮的cDNA的制备有Random六聚体引物。

6，引物设计和检测引物

1. 选择良好的引物：为获得最佳引物对mRNA转录的定量PCR，请按照下列要求（ 图3）：
   1. 设计引物含有不超过17-28个碱基。避免核苷酸重复，因为他们推动错配。
   2. 设计引物之间56-68℃（最佳60-64℃）熔化温度_（Tm值）。该引物对中的_Tm值应该是在彼此的1℃。
   3. 请注意，该产品的尺寸最好应在80和150个基点之间。
   4. 确保引物中的至少一个包括一个外显子 - 外显子交界处，或扩增子中含有大量的内含子（内含子跨越），以避免基因组DNA污染的扩增。
   5. 为了提高引物的设计采用基于引物3（对于实施例参照表2）的可靠的软件。
2. 测试PRimers：为了确保引物的专一性和效率，控制定量PCR反应应进行：
   1. 用积极的样品（含cDNA模板为所有相关的引物对）和滴定的基因（ 如 8从〜10毫微克的初始浓度3倍稀释）一式两份平行反应。包括无模板对照，这对于用于反应的溶液中的污染控制。
   2. （ ^{- 1 /斜率）-1 10（）}×100，}使得它们的最佳斜率的曲线是- 3.333（ 即 ^{10（ - 1 / 3.333）=} 2）（ 图4）：使用下面的公式计算出的引物效率。
   3. 确定扩增的特异性。特异性扩增证明由共同的扩增产物所有的熔解曲线的单一主峰，而脱靶扩增会出现一个明显的偏差FROM单大峰。

7，定量PCR分析

1. 前置放大：
   1. 综合定量PCR分析是基于限制的RNA的量与大量的引物对的并行查询。因此，预扩增步骤是必不可少的。在此步骤中，cDNA经受预扩增14-18个循环的所有将被用于查询该样品在未来（最多800个引物对）中的引物的混合物。
   2. 稀释于TE（低EDTA）的所有引物，以50为针对特定目标扩增（STA）。
   3. 池一起所有的50μM引物的1微升等分设置要包括在该STA反应，高达800测定。
   4. 制备预混物和样品的STA，如表3所述。通过制备混合为需要被放大的样本数的110％允许误差。
   5. 等分3.75微升STA预混每个样品。添加1.25微升的cDNA的每一个。
   6. 涡流以混合反应并离心10秒。
   7. 将STA的反应在热循环和周期，在表4所示。
2. 核酸外切酶I（ExoI）治疗：
   1. 稀释的外切余如表5所示。
   2. 加入2微升稀释ExoI（4 U /μL），以每5微升的STA反应，漩涡，降速（> 6000 XG），并将其放置在热循环仪，37 ℃下进行30分钟，然后在80℃下进行15分钟。
   3. 稀释的最终产品，以适当的浓度进行测试。用TE缓冲液（加43μLTE缓冲液到7微升TSA样品）。
   4. 存储稀释STA产品在-20°C或立即使用。
3. 底漆和样品安装在定量PCR：
   1. 制备的样品，如表6。根据选择的实验中，芯片准备混合，并添加样品适当。
   2. 敏捷射孔样品混合解决方案，最少20秒，而离心机（> 6000 XG）至少30秒。制备的反应可以被存储为短的持续时间，在4℃，直至该芯片已准备好装载。
   3. 如表7中所述制备的测定。
   4. 搅动测定混合物最少20秒，离心机（> 6000 XG）的至少30秒降速所有组件。
      重要提示：涡彻底离心吸取之前的所有样品制备和分析解决方案集成到芯片的入口。如果不这样做，可能会导致数据质量的下降。
      注意：每个引物的终浓度为5μM的在入口和500nM的最终反应。
4. 底漆和加载动态数组国际金融公司（集成流体通路）芯片。在IFC芯片具有入口的样品和测定法，以及指定的入口（累加器）为用于加压的微流体腔室的控制管道流体（矿物油）（Figu重新4A）。
   1. 注入控制线流体到芯片上的每个累加器。
   2. 移除并从芯片的底部丢弃蓝色保护膜。
   3. 将芯片插入相应的国际金融公司（IFC）控制器（控制器MX的48.48动态阵列国际金融公司（IFC）和国际金融公司（IFC）控制器HX的96.96动态阵列国际金融公司），然后运行首相（113X）脚本的48.48动态阵列国际金融公司（IFC）和总理（136X）脚本的96.96动态阵列国际金融公司（IFC），以素片。
   4. 当剧本完成后，请从国际金融公司控制器底漆芯片。
   5. 移液管将5μl各测定混合物和5μl各样品混合到其入口。
   6. 返回芯片到IFC控制器。
   7. 利用国际金融公司控制器软件，运行负载混合（113X）脚本的48.48动态阵列国际金融公司）或混合装载（136X）脚本的96.96动态阵列国际金融公司装载样品和检测到芯片中。当负载混合脚本已经完成，除去负荷版芯片从国​​际金融公司控制器。
   8. 装载在热循环仪的芯片，创建一个新的芯片运行（根据制造商的指导方针），包括熔解曲线分析。使用热循环仪软件，确保该反应室被正确识别，并允许该反应进行至完成。

8，数据分析

1. 质量保证：为了确保数据的质量，通过寻址稀释度曲线验证引物的质量（如上述）。通过观察扩增子的熔化曲线监测扩增的特异性，其中峰值应最佳地紧密排列^29。
2. 可视化：对于大批量的高通量定量PCR获得的数据可视化，使用软件生成的热图，其中表现为颜色编码的强度。此外，显示单个基因作为内衬散点图的转录动力学。
3. 出版：出版基因表达的结果，建议遵循MIQE准则发布实时定量PCR实验，详细说明了必须报告的定量PCR实验，以确保其相关性，准确性，正确的解释，和可重复性的最少信息。

结果

通过施加这个协议中得到的结果的质量在很大程度上取决于于许多参数。适当的试验计划将造成最小干扰的实验小鼠，如所测试的经验（在本例中，即暴露于可卡因）将在其最近历史上最占优势的经验，因此，将导致一个强大的和特异性的转录程序。 图1描述了实验计划行为敏可卡因，限定的时间点以下可卡因经验在其中的伏隔核是从小鼠解剖和分析。下一个关键点是，限定了精确的...

讨论

从脑组织以下行为范式成功的表征基因的表达依赖于：行为范式中1）认真小鼠的处理; 2）快速，精确的利益组织的解剖; 3）RNA的保护措施以确保RNA的完整性; 4）引物和实验布局精心规划，以及精度和对细节的关注，准备的qPCR分析。

描述的步骤的目的是表征诱发一种行为体验的转录活动动态;因此，认真注意是必要的，以确保该行为范式所经历的小鼠确实表示打算由研究者的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Virusol	Oriek Medical	J29D
Isoflurane, USP 100%	MINRAD INC	NDC 60307-110-25
RNeasy plus Universal Mini Kit	QIAGEN	73404
QIAshredder	QIAGEN	79654
High Capacity cDNA Reverse Transcription kit	Invitrogen	AB-4368814
TE Buffer	Invitrogen	1355656
Behavior Chamber (MDF; 50 x 45 cm)			Self assembled
Inner Perspex box (30 x 30 cm)			Self assembled
Camera and video recorder	Campden Inst.	CMD-80051
Media Recorder software	Noldus	NDS-NMR3-00M
Iris Scissors	FST	FST-14062-09
Vibratome	Campden Inst.	7000SMZ-2
Bioanalyzer	Agilent Technologies	The Agilent 2100 Bioanalyzer
Thermal cycler	Bio-Rad	1852048
Inverted microspoon spatula	Bochem Instrument GmbH	3213
Biomark HD Reader	Fluidigm	BMHD-BMKHD
Dynamic array Chip for 96.96 gene expression	Fluidigm	BMK-M-96.96