Davranış Deneyim ardından Beyin Örneklerden Deşifre Dynamics Kapsamlı Analizi

Özet

This manuscript describes a protocol that applies comprehensive profiling for analysis of transcriptional programs induced in specific brain nuclei of rodents following behavioral paradigms. Herein, this approach is illustrated in the context of profiling genes induced in the nucleus accumbens (NAc) of mice following acute cocaine exposure, utilizing microfluidic qPCR arrays.

Özet

Beyin ve uzun vadeli anıları konsolidasyon deneyimleri kodlama gen transkripsiyonu bağlıdır. Kodlama deneyim spesifik genlerin işlevini belirlenmesi moleküler nörobilim ana hedeflerinden biridir. Ayrıca, belirli davranışları ile tanımlanan genlerin fonksiyonel dernek nöropsikiyatrik bozuklukların temelini anlamak için etkileri vardır. Güçlü transkripsiyon programları indüksiyonu çeşitli davranışsal manipülasyonlar ardından fare beyinlerinde gözlenmiştir. Bazı genetik elemanların farklı davranış manipülasyonlar takip eden ve farklı beyin çekirdeklerinde tekrarlı kullanılmışsa da, transkripsiyon programları genel olarak uyaran uyarılara ve ^1,2 incelenmiştir edildiği yapıya benzersizdir.

Bu yayında, bir protokol davranışsal manipülasyon yanıt farelerin beyin çekirdeklerine sağlam ve kapsamlı transkripsiyon profilleme için tarif edilmiştir.Protokol Akut kokain deneyimi aşağıdaki akumbens çekirdekte gen ekspresyon dinamiklerin analiz bağlamında gösterilmektedir. In vivo deneyim tanımlanan bir sonraki hedef nöral doku disseke edilir; RNA, ardından arıtma için, çok hedefli genlerin geniş QPCR analizi için transkripsiyonu ve mikroakışkan dizilerin kullanımını ters. Bu protokol, küçük beyin numuneleri hatta tek tek hücreleri gibi kapsamlı analiz başlangıç ​​malzemesi, sınırlı bir miktar (50-500 genlerini adresleme) yönelikse.

Protokol çok sayıda örneğin paralel analizi (örneğin, tek hücreler, ilaç aşağıdaki dinamik analizi, viral ya da davranışsal düzensizlikler) için en çok avantajlıdır. Ancak, protokol aynı zamanda mikrodiziler veya RNAseq tarafından tüm genom çalışmalarından önce numunelerin karakterizasyonu ve kalite güvencesi için hizmet, yanı sıra tam-genom çalışmalarından elde edilen verilerin doğrulama olabilir.

Giriş

Beynin dinamik bir organizasyon bilişsel ve davranışsal esneklik sağlar. Deneyimler beyindeki ³ nöronlar arasındaki bağlantıların yapısı ve gücü değişiklikleri ile kodlanmıştır. Bu "tecrübeye bağımlı plastisite" sinaptik yapı ve mukavemet ⁴ modifikasyonu için gerekli proteinleri içerir gen ifadesinin spesifik örneklerine indüksiyon sonucudur. Uzun vadeli anıların oluşmasına aracılık gen düzenleyici ağların tanımlanması transkripsiyonel programların egemen unsurlarının tespiti için bellek oluşumunu, yanı sıra hedefler düzenleyen temel ilkeler içgörü sağlayacağı beklentisi ile, moleküler nörobilim merkezi ilkelerinden biridir nörodejeneratif ve nöropsikiyatrik bozuklukların tedavisi. Transkripsiyonel programlar d önemli olan farklı karakter genleri kodlayan her biri, geçici olarak tanımlanmış dalgalar açılmaksinyal olayı ^1,2 sonucu uygulanmasında ifferent aşamaları. Bu kaynaklı genlerin tam bir tamamlayıcı belirlemek ve onların indüksiyon dinamiklerine göre potansiyel fonksiyon içgörü kazanmak şekilde, ayrıntılı bir zamansal zaman ölçeği üzerinde transkripsiyonel dinamiklerini ele nedenle önemlidir.

Madde bağımlılığı, beyin ^5,6 nöral devrelerinde kötüye kullanılan ilaçların uzun süreli etkileri neden tecrübeye bağımlı plastisite sağlam bir şeklidir. Ilaçlara ilk akut maruz bağımlılık gelişmesinde ve kronik kullanımına geçişe yol açabilir. Bağlamsal bilgi bağımlılık gelişiminde çok önemli bir unsurdur. İlaç-ilişkili çevresel ipuçları uyuşturucu bağımlısı zihninde önem atanır. Ilaç özlem nüksü uyarabilir geçmiş ilaç deneyim bir ilaç istismarı hatırlatan bağlamsal bilgiler hatta uyuşturucu maruz ^7,8 kaçınmanın uzun süre takip.Dolayısıyla bağımlılığı büyük klinik meydan - yoksunluk belirtileri ⁹ yatıştıktan sonra bağımlılarının eğilimi hatta uzun nüks.

Kokain Davranışsal sensitizasyon uyuşturucu bağımlılığı mekanizmalarının çalışma yararlı kokain deneyimi basit bir modeldir. Kötüye kullanılan ilaçların kronik olarak maruz kalmak neden olduğu uzun süreli sensitizasyon bu yaygın olarak incelenmiş modelinde kemirgen önce salin enjeksiyonları (karın içinden, IP) alışık olan yeni bir ortamda (kendi lokomotor aktivite kontrol edildiği bir açık alan odası) ; onların etkinliği ¹⁰ (Şekil 1) takip edilmektedir, sonra onlar açık alanda odalarına kokain günlük enjeksiyonu yapılır. Bu davranış genellikle bir paradigma sapık oluşumunu gösteren, kokain enjeksiyonları kesilmesini takiben aylık bir süre için muhafaza edilmektedir (8-12 kat başlangıç ​​etkinliği ile elde edilmiş) Hareket ^{davranışında, 11,} sağlam bir sensitizasyon sonuçlanırilaç deneyim Asive bellek iz.

Doğal bir türün başarısı (örneğin beslenme, cinsiyet) için gerekli davranışları takviye katılan ödül nöral devreler, ilaç ilişkili davranışları ^12,13 güçlendirmek için ilaç kötüye tarafından istismar edilmektedir. Kötüye kullanılan ilaçların tecrübesi arttınlır edildiği, moleküler ve hücresel mekanizmalar, başka beyin yapılarında ¹⁴ açıklayıcı bir ya da semantik bellek oluşumu altında yatan mekanizmaların benzer görünmektedir. Bu nedenle, davranışsal sensitizasyon modelinin sağlamlığı o deneyim-bağımlı plastisite mekanizmaları incelemek için çekici bir model sistemi yapar.

Nükleus akumbens (NAC) beyin ödül devresinin bir merkezi birleştiricidir ve yoğun bağımlılığı ^5,6 gelişmesi ile ilişkilendirilmiştir. Bağımlılığı oluşumu nukleus accumbensde yeni proteinlerin transkripsiyonu bağlıdır ve sağlamaçıkça yapılandırılmış transkripsiyon programları duction kokain deneyimi ^15-19 aşağıdaki NAC görülmektedir. kokain maruz kalma akut transkripsiyonel tepkisi güçlü indüksiyon uyarana uyum ve yeni proteinlerin üretimini yönlendirmek için birden fazla düzeyde çalışması için muhtemel olduğunu ilaç ^6,19-22 maruz bırakılarak kaynaklanan yapısal değişiklikler ve elektrofizyolojik sorumludur.

Beyinde tecrübeye bağımlı plastisite moleküler mekanizmalarının çalışmasını sağlamak amacıyla, bir protokol davranış manipülasyon beyin doku örnekleri transkripsiyon dinamiklerinin kapsamlı analizi için tarif edilmiştir. Transkripsiyonel analizi için mikro-akışkan dinamik bir dizi kullanarak, kokain davranışsal duyarlılaşma - protokol Citri laboratuarda araştırılmıştır davranış deneyim bağlamında görüntülenmiştir. Açıklanan protokol belli t okuyan bunlarla sınırlı değildiro davranışsal duyarlılaşma bağlamında accumbens nükleusuna, davranış paradigmalar ve beyin bölgelerinin çok sayıda uygulanabilir. Aslında, bu protokol beyin dışında, vücut dokularına tatbik edilebilir, ve deneyimlerin veya organizmanın çeşitli manipülasyon incelenmiştir.

Protokol kabaca dört aşamada ayrılır. Birinci aşamada, hayvan davranış paradigma tabi tutulur; İkinci aşamada doku microdissected olduğu; Üçüncü aşamada - mRNA tersine transkripsiyon yapılmış, saflaştırılmış ve problandı ve son aşamada veriler analiz edilir.

Transkripsiyonel dinamiklerini okuyan kapsamında, deneyim hassas zamanlama ve tanımı kontrol etmek en önemli deneysel parametreler muhtemelen. Bu nedenle, tercih edilen modeli, bu davranışsal kokaine davranışsal duyarlılaşma, deneyimi sağlanan parametreleri üzerinde kontrol deneyi ile yüksek düzeyde sağlayan bir sistem ile ilgilidirce. Deneyim-bağımlı plastisite veya bellek oluşumu farklı modeller hassas zamanlama sağlamak ve ele Ek davranışsal paradigmalar vardır. Bu modeller korku klima ^23, akut çevresel zenginleştirme ^24,25, roman nesne keşif ²⁶ ve karanlık yetiştirme ²⁷ aşağıdaki görsel deneyim içerir. Yine, kokain davranışsal sensitizasyon sürekli güçlü davranışsal manipülasyon kokain deneyimi ²⁸ aşağıdaki ay süren oldukça yaygın bellek izleme oluşturma, olduğunu.

Beyin çekirdeği accumbensde manuel mikrodiseksiyonu takip kesilir. Hızla hazırlanan beyin dilimleri el ile mikrodisseksiyon davranışsal paradigma ilgili dokuyu çıkarma en güvenilir ve hızlı bir yöntem sağlar ki bizim deneyim olmuştur ve tecrübesi ile, doku sınırları tanınan kolayca belirgin hale gelirler. Seçenek olarak ise, ince dilimler HAZIRLIK olabilirlazer yakalama mikrodiseksiyon takip ed. Bu yöntem son derece ilgi bölgenin sınırlarının çizilmesini tanımlanan sağlar karşın, (böylece kararsız mRNA kaybetme riski) sıkıcı yavaş ve masraflı özel ekipmanları (lazer yakalama kurulumu ile donatılmış bir mikroskop) gerektirir. Burada tanımlanan protokol, yama pipetler, ²⁹ kullanılarak görsel olarak tanımlanmış olan hücrelerin sitoplazması elle aspirasyonu ile, tek hücreli bir transkripsiyonel analizi için adapte edilebilir. Bu çoğu durumda, doku içindeki hücrelerin sadece bir alt popülasyonu, aslında deneyimine yanıt katılan son derece olasıdır, ancak tarif edilen protokolü bir popülasyon ortalama sağladığını belirtmek önemlidir. Bu deneyimi yanıt belirli bir hücre popülasyonları içinde bir seçici bir şekilde transkripsiyonu profile ilgi olduğunu, ancak bu yaklaşımların tartışılması geçerli kapsamı dışındadır.

MRNA Saflaştırma için, ters transkripsiyon ve QPCR sorgulama, dokuticari olarak temin edilebilir kitlerin kullanılması ile ve ardından ince iğneler boyunca geçirilmesi ile bozulur (Daha fazla bilgi için, bakınız Tablo 8). Seçim yüksek kaliteli RNA ve alt uygulamaları sağlam sonuçların güvenilir çıkarılmasını sağlamak, bu metodolojiler, deneyim tarafından bilgilendirilir.

Protokol kullanılarak dinamik bir dizi yüksek verimli QPCR için tarif edilmiş olmasına rağmen, numuneler son nokta PCR, düşük verimlilik qPCR, gen ifadesi ya da derin mikrodizileri dizileme, gen ekspresyonu için incelenebilir. Yüksek verimli QPCR kullanılarak dinamik bir dizi için tercih mRNA davranış paradigmaların ardından genellikle sınırlayıcı miktarda olan beyin çekirdekleri elde olmasından kaynaklanmaktadır. Dinamik diziler tek bir deneyde paralel örneklerin çok sayıda transkript etkili bir biçimde analiz sağlayan bir platform sağlar. Mikroakışkan sisteminin ilk iktisabı (genellikle kurumsal bir pu sonrarchase), deney çalıştırmak için nispeten ucuzdur. Bu analizden sonra, örneklerin daha da sorgulanması dinamik diziler kalite güvencesi için kapsamlı bir referans sağlayan (mikrodiziler veya RNAseq) tarafından yeni transkript aramak için daha maliyetli platformları kullanarak yapılabilir. Son olarak, veri analizi için, standart yaklaşımlar kullanılmaktadır. Ortaya çıkabilecek sorunları ile ilgili özel işaretçileri protokol metninde ele alınacaktır.

Bu protokol birden fazla koşul ve çoğaltır okuyan kendi ilgi sisteminin kapsamlı bir soruşturma ilgilenen araştırmacılar için en uygundur. Protokolü de zaten onlar defalarca sorgulama ilgilenen ilgi 50-500 genlerin, bir alt kümesine (microarray veya RNAseq deneyler aracılığıyla) honlanmış bazı araştırmacılar için en uygun olanıdır.

Protokol

NOT: Protokol Kudüs İbrani Üniversitesi hayvan bakım yönergeleri takip eder.

ACSF Çözüm 1. Hazırlık

1. Su ya da uygun bir NaCI ilavesiyle ~ 300 mOsm / L ozmolarite getiren, Tablo 1 'de tarif edildiği gibi. ACSF çözelti hazırlayın GKD ₂ O 1 L (> 18 M saflık) konur.

2. Ekipman ve Oda Kurma

Kokain kaynaklı lokomotor davranış izlenmesi için donatım bir iç ışık kaynağı, fan ve kamera (veya kızılötesi sensörler) ile kablolu davranış odaları (50 x 45 cm) oluşur ve bir iç pleksiglas kutu (30 x 30 cm) olarak ile donatılmıştır bu fareler, lokomosyon takip edilmektedir serbestçe dolaşımına izin verildi. Davranışsal testler normal bir aydınlık / karanlık döngüsünde, ışık önce 1 saat için ışıkları sonra 1 saat arasında kapalı yapılmalıdır. Hayvanlar her gün aynı zamanda sürekli olarak eğitilmesi gerekmektedir.

1. Izleme ve farelerin lokomotor davranışını kayıt için uygun bir sistem fotoğraf makinesi veya kızılötesi sistemi bağlayın.
2. Koku işaret önyargı önlemek ve uygun dezenfeksiyon sağlamak için, fare imkan ve / veya koku kaldırarak ayıracı tarafından sağlanan dezenfektan ile her deneme sonrasında odaları temizleyin.

ÖNEMLİ: tutarken farenin, sessiz, sakin ve dikkatli olun.

3. Hayvan Hazırlık

1. Evi 5 C57BL6 erkek fareler; standartlara ve yerel Animal gereklerine göre, 12 saat aydınlık / karanlık döngüsü ve yiyecek ve su ücretsiz erişim ile bir odada kafes başına (6-12 haftalık ağırlığı ~ 25-35 gr), Komite rehberlik ve protokolleri önemsiyorum. Deney başlamadan önce, fareler tartmak ve veri giriş. Kokain sonra farelerin ağırlığına göre tatbik edilmektedir.
2. İlk deneme başlamadan önce davranışsal oda 30 dakika içine fare içeren tüm kafesleri aktarın.
3. Her alıştırmakDeneyde kullanılan farenin, enjeksiyonları taşıma ve davranış kurulumunda izlenmesi deneyci. , Aşağıda tarif edildiği gibi 250 ul tuz çözeltisi, 3 günlük ardışık intraperitonal enjeksiyon ile elde edilir.
4. 250 ul serum fizyolojik intraperitoneal uygulayın. Enjeksiyondan hemen sonra, 15 dakika boyunca lokomotor aktivitesini izlemek için bir davranış odasına fare. Her gün aynı saatte, 3 gün üst üste bu işlemi tekrarlayın.
5. Dördüncü gün, iki gruba fareler bölmek. Tuzlu su içinde 2 mg / ml kokain bir stok çözelti hazırlayın. (- 30 gr fare 300 ul alacaksınız ise, 250 ul enjekte 25 g fare için örneğin) fare ağırlığına göre deney grubuna kokain solüsyonu (son 20 mg / kg) tek bir enjeksiyon yönetmek. Kontrol grubuna tuzlu su uygulayın. Enjeksiyondan hemen sonra, lokomotor aktivite izleme (konan tipik bir davranış odası içinde 20 dakika boyunca fare yermüttefiki, ilk 15 dk) izlenmektedir.
6. Kokain enjeksiyonundan sonra farklı zaman noktalarında (enjeksiyonu takip eden 0, 1, 2, 4, 8 ve 24 saat) fareler kurban. Önemlisi, referans farenin (0 zaman noktası) Bu gün herhangi bir enjeksiyon almazsınız emin olun. Nedeniyle önemi, bu referans grubunun çoğaltır dahil etmek zorunludur.

Nucleus accumbensde 4. Diseksiyon

1. Kokain / tuzlu su enjeksiyonundan sonra uygun bir zamanda fareler izofluran ile anestezi. Izofluran direkt odadan dışarı tahliye edilmelidir. Bu nedenle, işlem, bir kimyasal buhar başlığı içinde yapılmalıdır.
2. Arka ayak refleks testi ile anestezi derinliği izlemek. Hayvan tarafından bir geri çekme yanıtı ortaya çıkarmak için pençe sıkıştırın. Bir refleks gösteren, bir hayvan anestezi cerrahi seviyesinde ve bir devlet euthanize değildir.
3. Beynin Ekstraksiyon:
   1. Dekapitasyon yoluyla fare öldürülür.
   2. kafatasının merkezi üzerinde deri çıkarın ve keskin bir makas ile kafatası kesti.
   3. Omurilik beyin (foramen magnum) girdiği noktada makas yerleştirin ve iki yan keser.
   4. Aynı noktadan, sagital sütür boyunca uzun bir sagital kesim yapmak. Sola ve sağa koku ampul, klip ulaştıktan sonra.
   5. Bir forseps, üzerine basın veya beyin zarar vermemeye özen sıkıca kafatasının her yarısını tutup yanına çekerek, dikkatlice kafatası çıkarın.
   6. Ters bir mikro kaşık spatula ile kranial sinirler kesilmesinin ise beyin çıkarın.
4. Soğuk ve sertleşmeye 1-2 dakika için bir buz-soğuk çözelti içinde ACSF beyin yerleştirin.
5. Rostral parçası Vibratome sahneye, yukarı bakacak şekilde, ACSF beyin çıkarın kağıt havlu ile fazla sıvıyı fitilieyeceklerdir, beyincik ve beyin geri kalanı arasında bir koronal kesim oluşturmak ve beyin tutkal.
6. NAC Kesme:
   1. Vibratome dilimleme odasında buz soğuk sıcaklıklarda ACSF çözümler koruyun. Nukleus accumbensde (NAC) kadar 200 mikron en bölümünde açıkça Paxinos ve Franklin Fare Beyin Atlas (bregmaya yaklaşık 1,8 mm anterior göre belirlenmiştir; korpus kallosum, ön komissürün yeri ve şekli şekline dikkat ve ventriküller, aynı zamanda beyin kesitinin genel morfolojisi). Bu noktada, NAC disseke edileceği iki 400 mikron bölümleri oluşturmak.
   2. Stereoskop altında, dilimlerden NAC bölgeyi incelemek için ince bir bıçak kullanın. NAC tanımı Paxinos ve Franklin fare beyin atlas göre ve uygun doku üzerinde bıçağın dört çabuk geçer tarafından uygun bölümlerde disseke edilebilir. (Şekil 2).
   3. Hemen NAC bölümler mikrosantrifüj tüp ve mağaza 900 ul Trizol parçalama reaktifi -80 ° C'de RNA ekstra ha kadar yerleştirineylemi.

5. RNA Ekstraksiyon ve cDNA Ters Transkripsiyon

1. Çekirdeğini içeren tüpler oda sıcaklığında Trizol liziz reaktif maddesi bölümleri akumbens çözülme ve doku, tamamen homojenize (en az 15-20 kat) altında olana kadar 25 G iğne bağlı 1 ml'lik şırınga ile homojenleştirin. İlk birkaç tur zordur ve iğne ucu girebilir küçük parçalara kırmak amacıyla tüpün duvarına karşı doku itme gerektirir.
2. Homojenliği sağlamak için, 1 dakika için 12,000 xg'de QIAshredder küçük spin kolon ve santrifüj içine lizat pipetleyin.
3. Pipet yeni mikrosantrfuj tübüne lizat ve üreticinin talimatlarına uygun olarak RNA ekstrakte edin. Kullanılana kadar -80 ° C'de RNA saklayın.
4. , RNA konsantrasyonunun ölçülmesi, bir Bioanalyzer veya eşdeğer ekipman kullanarak bütünlüğünü ve kalitesini analiz. R ile cDNA hazırlanması her tur için 100-500 ng RNA kullanınandom heksamer primerleri.

6. Primer Tasarım ve Astar Testi

1. İyi astar seçimi: mRNA QPCR için optimal bir primer çifti için, bu gereksinimleri (Şekil 3) izleyin:
   1. 17-28 bazdan daha artık içeren Tasarım astarlar. Onlar mispriming teşvik gibi nükleotid tekrarlar kaçının.
   2. 56-68 ° C (optimal olarak 60-64 ° C) arasında erime sıcaklığı _(Tm) ile tasarım astarlar. Primer çifti olan _Tm birbirinden 1 ° C arasında olması gerekir.
   3. Ürün boyutu ideal 80 ve 150bp arasında olması gerektiğini unutmayın.
   4. Genomik DNA, kirletici yükselmesini önlemek için, primerlerden en az biri, bir ekson-ekson bağlantısını kapsamaktadır, ya da amplikon (intron kapsayan), büyük bir intronu içerdiğinden emin olun.
   5. Astar tasarımını geliştirmek için (örnek için bakınız Tablo 2) Primer3 dayalı güvenilir bir yazılım kullanmak.
2. Pr Testimers: primerlerin özgünlüğünü ve verimlilik sağlamak amacıyla, bir kontrol QPCR Reaksiyon yapılmalıdır:
   1. (Tüm ilgili primer çiftleri için cDNA şablonu ihtiva eden) pozitif bir örneğini kullanabilir ve cDNA titre (örneğin 10 ng ~ bir başlangıç ​​konsantrasyonunda, sekiz üç-kat seyreltme) çift paralel reaksiyonlarda. Reaksiyon için kullanılan çözeltiler içindeki kirlenme kontrol eden herhangi bir şablon kontrol, içerir.
   2. ^{(- 1 / eğim)} -1 10 ⁽⁾ x 100, uygun eğim eğrisi gibi olduğu - 3.333 (örneğin, 10 ^{(1 - / 3.333)} = 2) (Şekil 4): aşağıdaki formül kullanılarak astar verimi olarak hesaplanır.
   3. Amplifikasyonun özgüllüğünün belirlenmesi. Spesifik amplifikasyon ise hedef dışı amplifikasyon açık bir sapma fr olarak görünür, amplifiye edilmiş ürünlerin erime eğrilerinin her ortak tek bir önemli zirve ile ortaya konmuşturtek bir büyük zirve om.

7. QPCR Analizi

1. Ön amplifikasyon:
   1. Kapsamlı QPCR analizi, primer çiftlerinin çok sayıda RNA sınırlı bir miktar paralel sorgulama dayanmaktadır. Bu nedenle, ön amplifikasyon bir adım gereklidir. Bu adımda, cDNA (800 primer çifti kadar) ileride örnek sorgulamak için kullanılacak olan tüm bir primer karışımı ile ön-amplifikasyon 14-18 döngülerine maruz kalmakta.
   2. Spesifik Hedef Güçlendirmesi (STA) için 50 mcM TE (düşük EDTA) tüm primerler sulandırmak.
   3. Havuz birlikte 50 uM primerin tüm 1 ul alikotları 800 deneyleri kadar, STA tepki olarak dahil edilmesi için ayarlar.
   4. Tablo 3 de tarif edildiği gibi. STA için ön karışım hazırlayın ve örnekleri amplifiye gereken numune sayısı% 110 için bir karışımını hazırlayarak hata için izin verir.
   5. Her numune için Tümbölen 3.75 ul STA ön karışımı. 1.25 ul ekleHer cDNA.
   6. Vortex 10 saniye boyunca tepkileri ve santrifüj karıştırın.
   7. Tablo 4 'de gösterildiği gibi, bir termal döngü cihazı ve döngüde STA reaksiyonları yerleştirin.
2. Ekzonükleaz I (ExoI) tedavisi:
   1. Tablo 5'te gösterildiği gibi Ekzo I seyreltin.
   2. Her 5 ul STA tepki seyreltilmiş ExoI (4 U / ml) 2 ul ekleyin, girdap, 37 ° C'de bir termal döngü içinde (6.000 xg>) aşağı spin ve yer ° C de 30 dakika ve daha sonra 15 dakika boyunca 80 ° C'de.
   3. Test için uygun bir konsantrasyona kadar seyreltilir son ürünleri. Kullanım TE Tampon (7 ul TSA numuneye 43 ul TE tampon eklemek).
   4. -20 ° C'de seyreltilmiş STA ürünleri saklamak veya hemen kullanın.
3. QPCR Primer ve örnek kurulumu:
   1. Tablo 6'da gösterildiği gibi. Örnekleri hazırlayın deney için seçilen çipine göre bir karışımı hazırlanmakta ve uygun örnekleri ekleyin.
   2. Agi20 sn minimum örnek Mix çözümleri oluæturma ve santrifüj (> 6,000 xg) en az 30 sn. Çip yükleme için hazır olana kadar hazırlanmış reaksiyonları 4 ° C sıcaklıkta kısa süreli saklanabilir.
   3. Tablo 7'de tarif edildiği gibi deneyler hazırlayın.
   4. Tüm bileşenleri yavaşlamalarını en az 30 saniye boyunca 20 sn ve santrifüj (> 6,000 xg) en az tahlil karışımı çalkalayın.
      ÖNEMLİ: iyice karıştırın ve santrifüj çip girişlerinin içine pipetle önce tüm örnek ve tahlil çözümleri. Bunun yapılmaması veri kalitesinde bir azalmaya neden olabilir.
      NOT: Her bir primerin son konsantrasyonu girişindeki 5 uM ve son reaksiyonda 500 nM'dir.
4. Astarlama ve Dinamik Array IFC (entegre akışkan devre) yongası yükleniyor. IFC çip (fig mikroakışkan odaları basınç altında tutmak için kullanılan kontrol hattı sıvısı (mineral yağ) için örnekler ve deneyler için girişleri yanı sıra, belirtilen giriş delikleri (akümülatörlerin) var) 4A yeniden.
   1. Çip her akümülatörüne kontrol hattı sıvı enjekte.
   2. Çıkarın ve çip altından mavi koruyucu filmi atın.
   3. Uygun IFC denetleyicisi içine yerlestirin (kontrolör MX 48.48 Dinamik Dizi IFC veya 96.96 Dinamik Dizi IFC için IFC denetleyici HX), daha sonra 48.48 Dinamik Dizi IFC veya Başbakan (136x) için Başbakan (113x) komut dosyasını çalıştırın Başbakan çip için 96.96 Dinamik Dizi IFC için komut.
   4. Komut dosyası tamamlandığında, IFC kumandadan Astarlanmış çipi çıkartın.
   5. Pipet her kontrol Mix 5 ul ve girişlerinde içine her Numune Mix 5 ul.
   6. IFC denetleyiciye çip dönün.
   7. IFC kontrolör yazılımı kullanarak, 48.48 Dinamik Dizi IFC için yük Mix (113x) komut dosyasını çalıştırın) veya 96.96 Dinamik Dizi IFC yonga içine örnekleri ve tahlilleri yüklemek için Mix (136x) komut dosyası yüklenemedi. Yük Mix komut dosyası tamamlandığında, yük kaldırmaIFC kumandadan ed çip.
   8. Erime eğrisi analizi de dahil olmak üzere, (üretici kurallarına göre), yeni bir yonga çalıştırmak oluşturmak, termal döngü çip yükleyin. Termal döngü yazılımı kullanarak, reaksiyon odaları düzgün tanındığından emin olmak için, ve reaksiyon tamamlanma çalışmasına izin.

8. Veri Analizi

1. Kalite güvencesi: Veri kalitesini sağlamak (yukarıda açıklandığı gibi) seyreltme eğrileri ele alarak primerlerin kalitesini doğrulamak için. Amplikonların erime eğrileri görüntüleyerek amplifikasyonun özgüllüğünün Monitör, optimal olarak en yüksek noktalar ²⁹ sıkı bir şekilde hizalanmalıdır.
2. Görselleştirme: yüksek verimlilik QPCR ile elde edilen büyük miktarlarda veri görselleştirme için kullanın ve yazılımları ekspresyon renk kodlu yoğunluğu olan, Heatmaps oluşturulur. Buna ek olarak, kaplı saçılım gibi, tek genlerin transkripsiyonel dinamiklerini gösterir.
3. Yayın: yayıncılıktagen ifade sonuçları, onun alaka, doğruluk, doğru yorumlama, ve tekrarlanabilirlik sağlamak için QPCR deney için rapor edilmelidir asgari ayrıntılı bilgiyi, kantitatif Real-Time PCR deneyleri yayınlanması için MIQE Yönergeleri takip etmek tavsiye edilir.

Sonuçlar

Bu protokolü uygulayarak elde edilen sonuçların kalitesi önemlisi, bir dizi parametre bağlıdır. Uygun deneysel planlama deney farelerinde minimal rahatsızlık, neden olur bu test deneyimi (bu örnekte, kokain maruz kalma olduğu) kendi yakın tarihin en dominant deneyim olacak ve bu nedenle sağlam ve belirli transkripsiyon yol açacağı programı. Şekil 1 çekirdeği farelerin disseke ve analiz edilmektedir akkumbens hangi kokain deneyim aşağıdaki zaman noktaları tanımlayarak, kokain dav...

Tartışmalar

Davranışsal paradigmaların ardından beyin dokusundan gen ifadesinin başarılı karakterizasyonu bağlıdır: davranış paradigması sırasında farelerin 1) dikkatli elleçleme; Ilgi doku 2) Hızlı ve hassas diseksiyon; 3) RNA emniyetli önlemler RNA bütünlüğünü sağlamak için; ve 4) primerleri ve deneysel dikkatli planlama düzeni gibi QPCR analiz için hazırlanırken detaylara hassas ve dikkat.

Tarif edilen prosedüre amacı, davranış deneyim ile indüklenen transkripsiyon...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Virusol	Oriek Medical	J29D
Isoflurane, USP 100%	MINRAD INC	NDC 60307-110-25
RNeasy plus Universal Mini Kit	QIAGEN	73404
QIAshredder	QIAGEN	79654
High Capacity cDNA Reverse Transcription kit	Invitrogen	AB-4368814
TE Buffer	Invitrogen	1355656
Behavior Chamber (MDF; 50 x 45 cm)			Self assembled
Inner Perspex box (30 x 30 cm)			Self assembled
Camera and video recorder	Campden Inst.	CMD-80051
Media Recorder software	Noldus	NDS-NMR3-00M
Iris Scissors	FST	FST-14062-09
Vibratome	Campden Inst.	7000SMZ-2
Bioanalyzer	Agilent Technologies	The Agilent 2100 Bioanalyzer
Thermal cycler	Bio-Rad	1852048
Inverted microspoon spatula	Bochem Instrument GmbH	3213
Biomark HD Reader	Fluidigm	BMHD-BMKHD
Dynamic array Chip for 96.96 gene expression	Fluidigm	BMK-M-96.96