EPA方法1615测量肠道病毒和诺瓦克病毒发生水由文化和RT-qPCR的了。病毒样本的收集I.

摘要

EPA Method 1615 uses an electropositive filter to concentrate enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. This manuscript describes the procedure for collecting samples for Method 1615 analyses.

摘要

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. The standardized sampling component of the method concentrates viruses that may be present in water by passage of a minimum specified volume of water through an electropositive cartridge filter. The minimum specified volumes for surface and finished/ground water are 300 L and 1,500 L, respectively. A major method limitation is the tendency for the filters to clog before meeting the sample volume requirement. Studies using two different, but equivalent, cartridge filter options showed that filter clogging was a problem with 10% of the samples with one of the filter types compared to 6% with the other filter type. Clogging tends to increase with turbidity, but cannot be predicted based on turbidity measurements only. From a cost standpoint one of the filter options is preferable over the other, but the water quality and experience with the water system to be sampled should be taken into consideration in making filter selections.

引言

人类肠道病毒在胃肠道内复制并通过粪 - 口途径分布。这些病毒经常发现在污水中高浓度的^1-3。他们能坚持生活污水^4,5，并在表面^6,7，地面^8-10和处理饮用水¹¹水域。当存在时，病毒在美国环境水的浓度典型地过低，可直接测量^12,13。这需要的病毒被浓缩从大量的水。在信息收集规则（ICR）监测由美国环境保护署^{（USEPA）14}进行，病毒浓度大事业，从0.009全国性范围的水源水阳性标本的19.7最可能的传染性单位数（MPN）/ L.中位数和平均浓度阳性标本分别为0.03和0.17 MPN / L的水源流入溪流，0.010.07 MPN / L为那些来自湖泊和水库，以及0.04〜0.74 MPN / L为那些使用地下水^11（从2000年4月25日日的ICR辅助118个月访问数据库中的数据）。阳性标本来自全国地下水一个USEPA研究的病毒浓度从0.009到2.12传染性单位/ L用中位数和平均浓度为0.13和0.29传染性单位/ L范围^8。病毒阳性地下水样品中的浓度高于溪流更高。大多数在这些研究中使用地下水的设施获得的水从位于岩溶地区地下蓄水层。这些连同那些位于石灰石和结晶（断裂基岩）设置有可能有更高的病毒浓度高于在其他设置^8,15,16。 USEPA病毒方法指定的200升的地表水（ICR）300 L（方法1615年）和1000升的地下水^{17,18（ICR）}至1500 L（方法1615年）的采样量。然而，即使使用大体积的样品，大多数地表水和地下水的样品是阴性病毒^{8,11,19,20。}

目前在地表水中的病毒构成潜在的健康风险对消费者饮用水。在地表水处理规则要求采用地表水由至少4日志，以减少病毒浓度的所有污水处理厂。即使使用4-log减少，感染性病毒的浓度在源水小至0.0044 MPN / L时有可能导致每天1感染假设这样平均曝光和处理条件和剂量反应参数为轮状病毒^11,21。从病毒中未处理地下水的风险可能更大，由于缺乏治疗和病毒的发生。博查特和他的同事估计，多达急性胃肠炎的22％的成年人和63％的儿童不到五年的时间可能是由于病毒使用未经处理的地下水¹⁹饮用水的社区。

USEPA Method 1615开发非常规污染物监测法规的第三监测周期^{（UCMR3）22}作为国家过程中检测肠道病毒和诺瓦克病毒后续博查特的调查结果和同事^19,23。美国环保局方法主要设计用于使用未经处理的地下水检测病毒系统，但被写得更普遍，包括其它水矩阵类型。新方法是一种混合型保持从ICR ¹⁷期间所使用的先前的病毒的方法，许多组件，加入分子程序基于博尔夏特等人 ^19,23和额外的引物组的诺如病毒²⁴的方法。本文的目的是描述了采样过程，并收集和运输过程中保持样品的完整性所需的步骤。总体方法进行评估，Cashdollar 等人 ²⁵进行说明。该协议涵盖了简单的现场收藏品要采样的n地表水和地下水，其中一个泵和预滤器是不必要的，在那里不需要用于pH或在水中的消毒剂的存在的调整。更复杂的采样要求中的F out 等人 ^17,18进行说明。

研究方案

1.初步程序

1. 装配一个标准滤波器装置如图1选自由摄取模块，盒外壳模块，和一个放电模块的如补充材料所述。
2. 校准流量计/累加器在第一次使用之前，用于取样的流速。检查校准第一次使用后，再一个月后使用。如果流速校准后或者在第一次使用或在第一个月的使用后发生了变化，确定所述频率校准检查如补充材料所述。
   1. 排出模块连接到一个吸气模块，然后进模块连接到一个抽头。设置流量计/累加器来读取流量。打开水龙头完全，然后调整用青铜截止阀的流率，以10升/分。一旦流量是稳定的，在10升/分钟，重置流量计/累加器读总体积。
   2. 将出让放电模块的成4升或更大的量筒并且同时复位累加器归零。测量累加器读数在4升的标记，并达到在缸的4个L标记所需的时间。改变流量计/累加器设置回流量。
      注意:如果流量下降到低于9.95 L或完成步骤1.2.2之后增加至超过10.05 L，等到流量稳定并重复步骤1.2.2。一个正确校准仪将达到4升大关量筒在24±1秒，4.0±0.04 L.累加器阅读
   3. 如果累加器读数小于3.96或大于4.04 L时，计算需要调整为所观察到的差异的校正因子。例如，如果流量计/累加器读3.9 l位于上量筒4 L标记，校正因子是1.026（4÷3.9）。因此，如果一个场的样品的所需体积分别为300升的容积根据第r收集eading上流量计/累加器应为300÷1.026 = 292.4 L。
3. 消毒标准过滤设备并准备样品采集。
   1. 由任一完全浸入所述模块中的溶液或通过虽然使用泵模块循环次氯酸钠每次使用前消毒的摄入和仓外壳模块0.525％次氯酸钠至少30分钟。冲洗模块用无菌的dh _{2 O}和然后脱氯在含有5分钟加入50ml每升无菌试剂级水的1M硫代硫酸钠的溶液中。覆盖用无菌铝箔滤波器采样装置模块结束。
   2. 添加一个正电筒式过滤器到盒外壳模块无菌。
      注:请注意，以确保滤芯过滤器在外壳正确就位。正确安装过滤器不会泄露和动摇，当过滤器将不会在壳体内移动。在AP上的垫片roperly坐在滤波器将有明显的凹痕表示在过滤器接触他们。垫片应当始终被检查之后立即将过滤器从壳体移除凹陷。
   3. 记录在样本数据表独特的样本号（见补充材料的一个例子），然后采取或运送过滤器的采样设备和采样数据表到谁将会收集现场采样的个人，以及关于样品的任何必要的说明集合（ 例如 ，样品体积，取样位置等 ）。

2.准备样品采集在采样现场

1. 抵达后洗手，在收集的网站，不要手术手套，以尽量减少样品污染的可能性。不收集样品，如果遇到肠道或呼吸道症状。更换手套频繁，尤其是触摸水龙头及其他项目后，可能会续胺化。
2. 记录相关样本跟踪一个样本数据表的信息。相关信息包括网站和样品标识，采样的名字，设备型号和序列号。
3. 放水水龙头2-3分钟以清除在该行已经解决任何碎屑。如有必要，可使用一个花园软管或油管在这一步，达到排水。
4. 如果取样装置模块连接，断开它们和保护用无菌箔盒外壳模块的开口端。排出模块连接到进气模块然后两者连接到水龙头。连接一个花园软管在放电模块的端部，并放置在1升聚丙烯容器中的自由端。
5. 打开水龙头，并通过至少加入75μL的水通过该装置进行采样。
   1. 测量并在水冲洗周期流入聚丙烯容器氯渣油记录水质参数UAL，pH，温度，和浊度。
   2. 关闭水水龙头后，断开从吸气模块的放电模块，然后暗盒壳体模块连接到进气模块的出口与排出模块到盒外壳模块的出口。重置累计读数为零。

3.现场样品采集

1. 记录初始累加器读数连同日期和时间，然后缓慢打开水龙头。
   1. 确保该盒式外壳处于直立位置，它完全与水填充。一些外壳有可压在填充过程，以排出空气从壳体的排气按钮。
   2. 完全打开水龙头。使用青铜截止阀调节流量，以10L /分钟，然后记录的初始流速。
2. 经过300升的地表水或使用1500至1800 L的地下水通过设备累加器读数（如调节，如果需要的话）。如果所需的体积之前，过滤器堵塞达到和超过一半的体积已经被收集起来，用第二过滤器壳体模块以收集剩余的样本，如果有一个可用。
3. 观察的流速为样品体积接近取样周期结束，然后关闭水流在样品抽头。记录最终的流速，日期，当天的时间，最后累加器读数，总样品体积。
4. 断开水龙头过滤器取样装置。断开其它模块盒外壳模块。
   1. 转动过滤器外壳（S）上下颠倒，并允许过量水流出，直到没有更多的水会流失从两个进口和出口。
   2. 打开外壳直立覆盖每端用无菌铝箔的快速连接。放置在外壳成一个或多个可密封的塑料袋。
   3. 从进气以及d沥干水ischarge模块。放置模块为一个或多个可密封的塑料袋。

4.装运现场样品

1. 将过滤器取样装置模块到隔热存储和运输凉爽。
2. 加冷冻冰袋或双袋装冰块到存储和运输冷却器，以确保样品在运输过程中保持之间的1-10℃。两个大或小的6-8冰袋应该足够了。
3. 放置在保温储存和运输的胸部在一个位置的温度记录装置不接触冰袋或冰袋。
   注:温度记录装置是可选的，如果分析实验室将使用一个视觉红外线温度计测量仓外壳到达后立即与容器的开口部的温度。
4. 填补空隙与包装材料，然后将样本数据表，在一个密封的塑料袋保护，在T运算。关闭隔热存储和运输的胸部，然后用胶带防止水泄漏。
5. 交通运输或运送样品的分析实验室。保证样品字段样本采集开始后到达分析实验室不迟于24小时（ 即 ，记录在步骤3.1的时间）。

结果

过滤器堵塞是可以与方法1615可能遇到堵塞减小的水通过过滤器的流率的一个主要的潜在问题。在某些情况下，这可以通过打开截止阀，以允许更大的流动来克服。在其他情况下，该过滤器将变成完全堵塞之前所需的体积已经通过它。 表1示出样品具有减少量作为过滤型，水型，和浊度的函数的百分比。堵塞发生了地下水和地表水样，与氧化铝纳米纤维为基础的过滤器跑赢季胺类过滤地下水样品，而相反的是地表水样品的情况下。总体而言，使用的季胺系滤波器收集的样本6％是缺乏量，同时与氧化铝纳米纤维为基础的过滤器收集的样品的10％没有达到所要求的最小规定体积由于堵塞。在属升，堵塞随浊度，但是许多不同的组件有助于浊度和其中的一些不会导致堵塞。例如，所述的ICR研究期间发生的所有事件的堵塞的43％被限制到2水系（数据未示出）。在ICR的最低目标卷的地表水为200 L.在研究过程中收集的平均量为217±32升用208升的容积中位数（日期为2000年4月25日从ICR辅助118个月访问数据库中的数据） 。因此，全卷可以从许多水域收集即使在高浊度。

该ICR要求采样使用预过滤器时，浊度均超过75 NTU，但即使有一个预过滤器，收集水域浊度超过75样本的34％NTU堵塞。方法1615建议使用预过滤器与水超过50 NTU;但是，由于方法1615的出版物中，除了在该方法中列出的几个不同的预过滤器的选择已经测试。所有这些导致了样品体积显著改善（数据未显示）。

图1.标准过滤设备的标准过滤器装置由进气，过滤器外壳，放电模块（见补充材料的每个模块的介绍）。 请点击此处查看该图的放大版本。

^Ç

总样本 一	对缺乏样品 B 号码	百分比缺乏样品	浊度（NTU）
使用NanoCeram地下水过滤器Ç
113	1	1	<20
使用地表水NanoCeram过滤器Ç
83	12	14	<20天
8	4	50	20 - <50
6	五	83	≥50ð
总NanoCeramÇ
210	22	10	≥0
使用1MDS过滤地下水Ç
374	75	20	<20
269​​3	27	1 C	<20个电子
505	36	7 F	20 - <50架F
122	19	16ê	50 - <75克
175	60	34 E，F	≥75 E，F，G
总1MDSÇ
3869	217	6	≥0

分机对齐:中心">地表水使用1MDS过滤器

表1.过滤能力 ^一个样品是从下面的研究从体积和浊度的数据是可用的: 从 4/2日的ICR辅助118个月access数据库1）美国环保局的ICR研究（数据5/2000），2）美国环保局地下水研究^8,3）USEPA劳伦斯和洛厄尔，MA研究（未发表资料），4）USEPA密西西比河研究（未发表资料），5）USEPA饮用水处理厂的研究（未发表资料） 6）USEPA方法1615评价研究²⁵和7）的前三个月的UCMR3监测（未公布数据^{）。B瓶尿样} ，其中的每个研究规定的水体积最小才堵塞过滤器收集。这是200升的地表水和1500 L代表地下水，但200升的水源，正在接受美国环保局ICR地下水和1893 L代表美国环保局地下水研究^。C到收集指定数量的最低全面的能力是不同的显著为使用样品收集NanoCeram和1MDS过滤器（P = 0.002）之间，地表水和地下水均整体（P <0.001），并为每个过滤器类型（P <0.001）采用Mann-Whitney秩和检验^。D＆＃8211; ^G组相同的标值是显著差异（P <0.05），根据方差的秩和检验单向分析秩和检验和邓恩的成对多重比较程序。对于所有的统计检验的因变量是通过过滤器作为最小指定体积的一小部分通过了体积，但具有1.0的最大值。

讨论

浓缩的环境水域病毒不同的过滤器类型已经使用多年^26。目前的方法采用超滤^27，负电的过滤器^13,28,29，玻璃棉过滤器²³和正电的过滤器^30。负电的过滤器被广泛地使用了许多年，但对于添加盐和前或取样期间水的pH值在现场的调整的要求限制了它们的效用^13。最实用的过滤器选择现场采样正电的过滤器。利用这些过滤器的大体积的水的采样在高流速和没有水的任何设施。玻璃棉过滤器是最便宜的选项，但具有较慢的流速比正电的过滤器和市场上不能买到。超滤提供最高的病毒回收率在大范围的水的质量，但需要sampli设备纳克不易字段便携式和收集样品所需要的时间要长得多^27。方法最近已开发了利用预处理阴电过滤器以避免需要调整的领域，但这些可能不适用，用于收集大体积样品^28,29。

EPA方法1615使用阳电滤芯其中获得无论从氧化铝纳米纤维或季胺的正电荷。前者超过后者的优点是，它是便宜的，并有效地收集病毒从水域在更宽的范围内的天然pH值的值^30,31;然而，每个盒，以及使用博尔夏特和他的同事的玻璃棉过滤得到肠病毒和诺沃克病毒从水^{23,31,32（Cashdollar，}未发表的数据）的类似的回收率。筒式过滤器被放置成，其被设计来简化样品的集合的简单采样装置和取样过程中减少污染。

标准方法是非常宝贵的，当大型研究使用多个分析实验室进行。 EPA方法1615提供了标准的程序和指导，以尽量减少可能会影响在这些收集的数据的两大样本采集问题的研究，假阳性结果所产生的污染过程中样本采集或充分消毒的设备部件和过滤毛孔由组件堵塞水进行采样。

正如肠道病毒可波及人对人由于卫生不足，病毒可以被引入到从洗涤不好的手或双手的样品与被污染的手套^33。至关重要的是，采样理解污染的潜在途径和采样过程中使用无菌技术。采样应该明白，手套主要用于保护免于暴露采样，而不是为protect从污染的装置。手要洗净前的取样和关怀的开始必须手套的穿戴过程中注意防止手手套污染。取样与胃肠炎或呼吸道症状不能收集样本，因为它们可能被脱落的肠道病毒或诺如病毒在较高的水平。

其次，必须小心，以防止病毒交叉污染，从上次采样事件。为了尽量减少这种潜在的污染的来源，在方法1615取样装置是从该ICR的由不包括进口和仓外壳模块之间的压力调节器和压力计修改。这些组件被删除，因为采样期间观察到的事件的压力总是低于最高住房等级（ 例如 ，125磅的5英寸盒式磁带的外壳），因为他们难以消毒。通过ST设备的使用空白对照后一个问题被证明udies到ICR ^6,20以后。在何种程度上影响了它的ICR数据是未知的，但很可能很小;在研究过程中，只有两个假阳性负面绩效考核的样本（数据未显示）。为了进一步减少遗留污染的可能性，也建议每个采样事件之后所述入口模块管代替。它是特别重要的，以确保有足够的消毒，如果该装置被用于被接种病毒一质量或性能的控制。之前进行消毒，游离氯的浓度应测量储存过程中的任何损失。除改变上述的装置的结构中，很重要的是正规的设备空白运行，以表明消毒是有效的。方法1615的设备使用的空白已经被用于病毒种子的控制后，经过消毒设备执行任务，从而简化由于不需要的程序之前，通过该装置中的病毒种子溶液来消毒。消毒剂的浓度增加至0.525％，次氯酸钠为方法1615，因为这个浓度是必需既以灭活设备上的任何可行的病毒和降解的核酸。因此，设备的空白，必须使用两个细胞培养和qPCR测定来进行分析。

这两种类型的过滤器正电的是主体在报告表1中的研究堵塞。未知的样本数量与体积的减少可能是由于抽样误差，如累加器的误读或抽样的有意尽早停止，以满足另一最后期限，特别是对水浊度读数低于20 NTU。堵塞的程度取决于两个经滤波器类型和水的质量的参数。预过滤器提供一些改善的措施，但如果使用的话，应进行处理和分析分别从正电的过滤器。为UCMR3当前的建议是，将样品在不使用氧化二铝纳米纤维基过滤器，如果至少有一半的体积可以使用第一过滤器来收集预过滤器收集。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-L polypropylene bottle	Nalgene	2104-0032
Aluminum foil squares	Cole-Parmer	06275-40
Autoclave	Steris	Amsco Lab Series
Bubble wrap	U.S. Plastics	50776
Closable bag	Uline	S-12283
Closable bag	Fisher Scientific	S31798C
Commercial ice packs	Cole-Parmer	06345-20
Cool safe box	Diversified Biotech	CSF-BOX
Gauze sponge	Fisher Scientific	22-415-469
Graduated cylinder	Cole-Parmer	06135-90	4-L or larger
Hype Wipe	Fisher Scientific	14-412-56
iButtons temperature data logger	Maxim	DS1921G
Insulated storage and transport chest	Fisher Scientific	11-676-12
Packing tape	U.S. Plastics	50083
Portable chlorine colorimeter II test kit	Hach	5870062
Portable pH and temperature probe	Omega	PHH-830
Portable turbidity meter	Omega	TRB-2020-E
PTFE thread tape	Cole-Parmer	08270-34	Use on all threaded connections
Pump, Centrifugal Magnetic Drive	Cole-Parmer	72010-20
Reduction nipple	Cole-Parmer	06349-87
Sodium hypochlorite (NaClO)			Use locally available household bleach
Sodium thiosulfate (Na2S2O3)	Sigma Aldrich	217247
Surgical gloves	Fisher Scientific	19-058-800
Waterproof marker	Fisher Scientific	22-290546
Media	Composition
0.525% sodium hypochlorite (NaClO)	Prepare a 0.525% NaClO solution by diluting household bleach 1:10 in dH2O.  Store 0.525% NaClO solutions for up to 1 week at room temperature.
[header]
1 M sodium thiosulfate (Na2S2O3) pentahydrate	Prepare a 1 M solution by dissolving 248.2 g of Na2S2O3 in 1 L of dH2O.  Store sodium thiosulfate for up to 6 months at room temperature.