大规模的斑马鱼胚胎的心脏解剖的转录分析

摘要

到斑马鱼心脏发育过程中分析的心脏基因表达分布，总RNA已被提取从离体心脏。在这里，我们提出了一个协议，用于收集功能/跳动的心迅速人工清扫，从斑马鱼胚胎获得心脏特异性mRNA。

摘要

斑马鱼胚胎的心脏是由只有几百细胞，占整个胚胎中只有一小部分。因此，为了防止被掩蔽由全局胚胎转录心脏转录，有必要收集足够数量的心作进一步的分析。此外，如斑马鱼心脏发育迅速进行，心脏收集和RNA提取方法需要快，以保证样品的均匀性。在这里，我们提出了一个快速的手动清扫协议收集功能/跳动的心，从斑马鱼胚胎。这是为随后的心脏特异性RNA提取，以确定心肌特异性基因表达水平通过转录组分析，例如定量实时聚合酶链反应（RT-qPCR的）的必要先决条件。该方法是基于在斑马鱼胚胎心脏和其他组织相比的差的粘合性能;这允许迅速的phy从心外心脏组织由流体剪切力的破坏，逐步过滤和人工采集转基因荧光标记心中的组合SICAL分离。

引言

斑马鱼（ 斑马鱼 ）被广泛用于发育生物学研究器官体内 ，由于其快速的，透明的和宫外胚胎发育，结合小尺寸和转基因记者线荧光蛋白的组织特异性表达的可用性。这个小脊椎动物特别适于研究心脏发育，因为早期的斑马鱼胚胎的氧合不依赖于心脏的跳动及血液流动;这些特点使大量心血管突变^1,2的表征和斑马鱼现在是一个被广泛认可的模式生物来研究心脏疾病^3。

到胚胎发育过程中研究基因表达，转录通常通过整个安装原位杂交^（WISH）4分析，RT-qPCR的^5，微阵列^6，或下一代测序（RNA测序^）7。而WISH允许基因表达的整个胚胎内的空间 - 时间分析，转录水平通过RT-qPCR的，微阵列或RNA测序方法，通常进行评估。然而，这些方法需要组织富集为特定的基因表达图谱。

因为斑马鱼胚胎心脏表示整个胚胎的一小部分，心脏发育过程中转录研究需要一个协议，用于解剖和心脏的富集。此外，为了得到生理上相关的数据，以维持心脏组织完全功能，直到RNA提取它是很重要的。在这里，我们描述了一种协议，用于快速分离生理正常和跳动心脏从数百斑马鱼胚胎的有效地获得高品质的RNA样品用于进一步分析。本方法是基于报道的烧伤和麦克雷，2006年⁸所述的协议，对于心脏组织的富集，这两种方法都使用的转基因心肌记者线并利用斑马鱼胚胎心脏与其他组织的鉴别粘附性能优势。简要地说，通过一个狭窄的枪头吹打许多胚胎上下，心脏被同时从胚体释放并随后从胚胎碎片两个快速过滤步骤中分离;荧光标记的心脏，然后手动地从剩余的碎片来分类并收集用于进一步处理。

研究方案

该协议遵循了德国和柏林国家法律的动物护理准则;斑马鱼的处理是由动物保护（LaGeSo，柏林 - 勃兰登堡）地方当局监控。

1.获取斑马鱼胚胎的心脏提取

1. 横心脏记者斑马鱼，例如作为Tg（MYL7:EGFP）转基因^twu34线^9，以便获得胚胎心脏特异性GFP表达。
2. 保持水蛋胚胎在28.5°C，直到所需的萌芽阶段^10,11。确保所收集的胚胎人口是同质既遗传和发育阶段以限制的变化的基因表达。
3. 手动Dechorionate胚胎。

2.解剖斑马鱼胚胎的心脏

注意:保留所有的解决方案上的冰。如果可能的话，做团队:一个人从教统局解剖的心ryos而另一个人在排序的荧光体视显微镜的心。这允许几百胚胎在几个小时的处理。

1. 转约100胚胎成1.5ml的离心管中。麻醉用三卡因的胚胎（0.16毫克/毫升在E3的培养基）。一旦进入胚胎显然麻醉（他们不游泳和沉积物的试管底部，但他们的心还在跳动）。
2. 除去三卡因/ E3溶液和1毫升的L-15/10％FBS培养基中，一旦洗涤胚胎并在冰上保持。
   注:L-15/10％FBS培养基中是很重要的，整个解剖过程中，以保持器官和细胞存活，直到心已被转移到RNAlater中或Trizol试剂。
3. 加入1毫升的L-15/10％FBS培养基中的胚胎和移液器上下用圆形凝胶加载提示5-8次，直到蛋黄被完全破坏。吸取胚胎逐滴到溶液的表面上，从而使压降将会破裂和将胚轻轻破碎。
   注意:如何大力和频率胚胎必须吸取上下取决于胚胎的发育阶段， 即多移液需要在后期（ 例如在56 HPF）。
4. 对于第一批解剖胚胎，评估胚的完整性并解剖心在立体显微镜下的比例，因为一些心中可保持附着在胚胎如果过轻轻吸入。调整移液的方式为下轮清扫相应。
   注:使用低滞留枪头和离心管，以减少心中坚持的塑料。
5. 样品应用到100微米的过滤器放置在50毫升离心管中;冲洗1.5 ml管1毫升的L-15/10％FBS培养基中，然后将此到滤波器，以便最小化样品的损失（一些心可能被粘在管的壁）。 1毫升L洗两次过滤器-15 / 10％FBS中。在此步骤中心通过过滤器，并收集在50ml管中。
6. 应用流通到30微米的过滤器放置在一个15毫升的离心管中，用1ml的L-15/10％FBS培养基冲洗过滤器一次。在这第二个过滤步骤中，心被保留在过滤器和较小的碎片被洗掉。
7. 转动过滤器倒置并通过施加连续洗涤三次用1ml的L-15/10％FBS冲洗心中从过滤器的成在1％琼脂糖包被的培养皿。
8. 手动分离GFP阳性的心从非荧光胚胎碎片（ 如眼镜头）与一对钳下，荧光体视显微镜，集中他们的菜心。根据步骤3收集它们。
   注:如果胚胎是年龄超过24 HPF，心中应跳动，表明组织仍然生理正常。

3.从Dissec分离mRNA特德心

1. 收集在尽可能小的体积的心（ 例如 10微升），并吸移管到1.5ml试管含有0.75毫升RNAlater中（在冰上）。确认没有心留在枪头通过查看它在荧光体视显微镜。
2. 或者，如果一种化学罩是可以在荧光显微镜的附近，在化学罩所收集的心转移到的Trizol（警告）。这就避免心贴在了枪头，也是心灵的离心过程中可能的损失（步骤3.4，3.5和3.7）。汇集来自几轮孤立的心在同一个管的Trizol，并直接转到步骤3.8;最终的体积应不超过原始的Trizol体积的10％。
   注意:请阅读的Trizol材料安全数据表（MSDS）后再使用。处理Trizol试剂罩下，并建议穿戴个人防护装备。避免与皮肤，眼睛和clothi接触纳克。去除所有火源。
3. 普尔从几轮隔离心中到相同的管中的RNAlater（在冰上），与组织的收集量的RNA分离的效率提高。如果总样品体积超过原始RNAlater中体积的10％，可以使用一个额外的管0.75毫升RNAlater中存储（在冰上）。
4. 离心样品在15700 XG为20分钟，在4°C至沉淀的心。
5. 下一个荧光立体显微镜，收集仔细尽可能多的上清液尽可能到装有3毫升的L-15/10％FBS的培养基中在1％琼脂糖包被的培养皿，但是不干扰沉淀的心在离心管的底部。由于心的高达15％的可保留在上清液由于RNAlater中的高粘度，如在步骤3.7中所述检索它们。
6. 在化学罩，加0.5毫升的Trizol含有沉淀的心管和保持在冰上。
7. 根据荧光microscoPE，传送从1％琼脂糖包被培养皿含有的RNAlater / L-15/10％FBS的溶液的心（来自步骤3.5）转换成另一种1％琼脂糖包被培养皿用3ml的L-15/10％FBS稀释出RNAlater中。收集的心在培养皿的中心，下化学罩在小体积转移成沉淀心中的Trizol的管。
8. 涡1.5 ml管中含有的Trizol心中破坏心脏和孵化5分钟，在室温下。
9. 在化学罩，加100微升氯仿（警告），调匀（使用前以最大速度离心30秒）的Trizol /氯仿溶液转移到1.5 ml的预纺PLG管。孵育3分钟，在室温下进行。
   注意:请阅读氯仿MSDS方可使用。处理氯仿试剂罩下，并建议穿戴个人防护装备。避免与皮肤，眼睛和衣服接触。远离不相容，如金属，碱。
10. CentrifuGE将样品在15700×g离心15分钟，在4℃下，将水相转移到一个新的1.5毫升管。
11. 添加5-10微克糖原和250μl的预冷（-20℃）异丙醇;拌匀，孵育过夜，在-20℃。
12. 离心样品在15700×g离心30分钟，在4℃，弃去上清液。
13. 在15700×g离心在4℃下洗用1ml 75％乙醇，离心沉淀15分钟，并弃去上清液。
14. 让乙醇蒸发干燥的粒料在室温下，直到它变成白色（ 例如 10-15分钟）。
15. 添加20微升不含RNA酶的DDH _{2 O}的以沉淀孵育10-15分钟，在55℃以溶解的RNA然后保持在冰上。
16. 评估RNA的浓度和纯度通过吸光度测定。通过运行在1％琼脂糖凝胶的样品评估RNA的完整性。

结果

在这里，我们描述了使用斑马鱼的Tg（MYL7:GFP）的有代表性的心脏解剖实验专在心肌（图1）的转基因^twu34线^9，它表达绿色荧光蛋白（GFP）。我们收集了两个解剖心，从他们得出评估心脏样品的纯度胚胎。简言之，将纯合的^{Tg（MYL7:GFP）twu34}斑马鱼⁹进行异型杂交用野生型，使得所有的胚胎心脏的GFP标记。大约500胚胎（56 HPF）转移到1.5毫升管（约100?...

讨论

该协议允许斑马鱼胚胎心脏组织的快速富集的基因表达分析。心脏特异性RNA样品的数量和质量在很大程度上取决于几个关键步骤:第一，如果能够防止在该协议中的每一步的心损耗的样品的量有很大的提高，因为RNA纯化将仅具有足够的工作起始材料。第二，样品，这完全取决于实验者的纯度，通过分类和收集的心内的培养皿同时严格排除其它组织确定的。第三，样品的质量主要取决于限制可能发生...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment for raising fish and collecting eggs			see the Zebrafish Book11 for details
Fluorescence stereomicroscope
Refrigerated Microcentrifuge
UV-Spectrophotometer			e.g. Thermo Scientific Nanodrop 2000
Nucleic acid electrophoresis chamber
Petri dishes 4 cm Ø, coated with 1% agarose in E3 medium
Micropipettes and tips (P20, P100, P1000)
1.5 ml centrifugation tubes
15 ml and 50 ml centrifugation tubes
Pair of Dumont #5 forceps
ExactaCruz™ Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200μl	Santa Cruz	sc-201732
100 μm filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer)	BD Biosciences	352360
30 μm filter (Pre-Separation Filters-30 µm)	Miltenyi Biotec	130-041-407
Phase lock gel, heavy, 1.5 ml tubes	Prime	2302810
Egg water medium			60 μg/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue
E3 medium			5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4
Tricaine (3-amino benzoic acidethylester)	Sigma-Aldrich	A-5040	4 mg/ml Tricaine stock solution, pH 7
1% agarose (in E3 medium)
1% agarose gel (in TBE buffer)
Leibovitz´s L-15 medium	Gibco	21083-027
FBS (Fetal Bovine Serum)	Sigma	F4135
RNAlater	Ambion	AM7020
Trizol	Ambion	1559606
Glycogen	Invitrogen	10814-010	20 µg/µl in RNase-free water
chloroform
isopropanol
75% ethanol (in DEPC-ddH2O)
Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O
Nucleic acid loading buffer
TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis