Крупномасштабные данио рерио эмбриональных Сердце Вскрытие для транскрипционных анализа

Резюме

Для анализа профилей экспрессии генов сердечных во данио развития сердца, общей РНК должны быть извлечены из изолированных сердцах. Здесь мы приводим протокол для сбора функционал / бьющееся сердце быстрым ручной вскрытия из эмбрионов данио рерио, чтобы получить сердечно-специфической мРНК.

Аннотация

Данио рерио эмбриональных сердце состоит только из нескольких сотен клеток, что составляет лишь небольшую часть всей эмбриона. Поэтому, чтобы предотвратить сердечный транскриптом от маскируется глобальной эмбрионального транскриптома, необходимо собрать достаточное количество сердец для дальнейшего анализа. Кроме того, как данио сердца развитие протекает быстро, сбор сердца и методы экстракции РНК должны быть быстрым, чтобы обеспечить однородность образцов. Здесь мы представляем быстрый ручной протокол вскрытия для сбора функционал / бьющееся сердце из эмбрионов данио рерио. Это является необходимым условием для последующего извлечения сердца РНК с определения сердечно-определенные уровни экспрессии генов с транскриптомный анализы, такие как количественное ПЦР в реальном времени (RT-КПЦР). Метод основан на дифференциальных адгезивных свойств данио эмбрионального сердца по сравнению с другими тканями; Это позволяет быстро PHYSical разделение сердечной ткани от экстракардиальной сочетанием текучей нарушения силы сдвига, ступенчатой ​​фильтрации и ручного сбора трансгенных флуоресцентно меченных сердца.

Введение

Данио рерио (Danio rerio) широко используется в биологии развития для изучения органогенеза в естественных условиях из-за его быстрого, прозрачного и внематочной эмбрионального развития, в сочетании с малым размером и наличием трансгенных репортеров линий с тканевой экспрессией флуоресцентных белков. Этот небольшой позвоночных особенно хорошо подходит для изучения развития сердца, потому что оксигенации начале данио эмбриона не зависит от сердечного ритма и потока крови; Эти особенности позволили охарактеризовать большого числа сердечно-сосудистых мутантов ^1,2 и данио сейчас широко признается модельным организмом для изучения сердечных заболеваний ^3.

Для изучения экспрессии генов в ходе эмбрионального развития, стенограммы, как правило, анализируется целом монтажа в гибридизация (желанию) ^4, RT-КПЦР ^5, микрочипы ^6, или следующего поколения секвенирования (RNA-Seq) ^7. В то время какWISH позволяет пространственно-временной анализ экспрессии генов в пределах всего эмбриона, уровни транскриптов, как правило, оценивали с помощью RT-количественной ПЦР, микрочипов, или РНК-Seq подходов. Однако эти способы требуют обогащения тканей для конкретного профилирования экспрессии генов.

С данио эмбриональных сердце представляет собой небольшую долю всего эмбриона, транскриптом исследования во время развития сердца требуют протокол вскрытия и обогащения сердец. Кроме того, для получения физиологически релевантных данных, важно поддерживать сердечную ткань полностью функциональный до экстракции РНК. Здесь мы опишем протокол для быстрого выделения физиологически нормальным и избиения сердца сотен эмбрионов данио эффективно получить образцы РНК высокого качества для дальнейшего анализа. Данный способ основан на протоколе сообщалось Бернсом и MacRae, 2006 ^8. Для обогащения сердечной ткани, оба метода используют трансгенное миокарда репортер линиии воспользоваться дифференциальных адгезионные свойства данио эмбриональных сердцах по сравнению с другими тканями. Вкратце, с помощью пипетки много эмбрионов вверх и вниз через узкий кончик пипетки, сердца одновременно выпустили из эмбриональных органов, а затем отделяется от эмбриональной мусора в два этапа быстрой фильтрации; флуоресцентно меченных сердца вручную сортируются от оставшегося мусора и собирают дл дальнейшей обработки.

протокол

Этот протокол следует руководству по уходу за животными немецкой и Берлин государственного права; Данио обработки контролировали местные органы власти для защиты животных (LaGeSo, Берлин-Бранденбург).

1. Получение эмбрионов данио для сердца Добыча

1. Кросс сердечной репортер данио, такие как Tg (myl7: EGFP) трансгенной линии ^{twu34 9} с целью получения эмбрионов с сердечной-специфической экспрессии GFP.
2. Поддерживать эмбрионов в яйце воды на 28,5 ° С до желаемой эмбриональной стадии ^10,11. Убедитесь, что собрали население эмбрион является однородным как генетически, так и стадии развития, чтобы ограничить изменения в экспрессии генов.
3. Dechorionate эмбрионов вручную.

2. Режущая рыбок данио эмбриональных Сердца

ПРИМЕЧАНИЕ: Держите все решения на льду. Если возможно, совместную работу: один человек рассекает сердца от набryos в то время как другой человек сортирует сердца под флуоресцентным стереомикроскопа. Это позволяет обрабатывать несколько сотен эмбрионов в течение нескольких часов.

1. Перевести около 100 эмбрионов в 1,5 мл центрифужную пробирку. Обезболить эмбрионов с Tricaine (0,16 мг / мл в E3 среда). Продолжить когда зародыши четко наркозом (они не плавать, а осадок на дне пробирки, но их сердца все еще бьется).
2. Снимите Tricaine решение / E3 и мыть эмбрионов один раз 1 мл L-15/10% FBS среде и поддерживать на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: L-15/10% FBS средой важно сохранить органы и клетки живых в течение всей процедуры вскрытия до сердца не были переданы в RNAlater или TRIZOL.
3. Добавить 1 мл L-15/10% FBS среду с эмбрионами и пипетки вверх и вниз 5-8 раз с круглым Гель наливного наконечника до желтка не полностью нарушена. Пипетки эмбрионы каплям на поверхности раствора, так что падение лопнет иэмбрионы аккуратно нарушена.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как энергично и как часто эмбрионы должны быть пипеткой вверх и вниз, зависит от стадии развития эмбрионов, т.е. более пипетки необходимо на поздних стадиях (например, на 56 часов после оплодотворения).
4. Для первой партии расчлененный эмбрионов, оценить целостность эмбрионов и доли расчлененный сердца под стереомикроскопом, так как некоторые сердца может оставаться присоединенным к эмбрионов, если слишком мягко пипеткой. Отрегулируйте манеру пипетки для следующих раундов вскрытия соответственно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте низкие советы удержание пипетки и микроцентрифужных трубы, чтобы свести к минимуму сердца, торчащие на пластик.
5. Применение пробы на 100 мкм фильтре, расположенном на 50 мл центрифужную пробирку; промыть 1,5 мл пробирку с 1 мл L-15/10% FBS среде, а затем применить это к фильтру, чтобы минимизировать потерю образца (около сердца может быть прилипание к стенкам трубки). Промойте фильтр в два раза с 1 мл L-15/10% FBS. На этом этапе сердца проходит через фильтр и собирают в 50 мл пробирку.
6. Применение проточного на фильтр 30 мкм помещали на 15 мл центрифужную пробирку и промыть фильтр один раз 1 мл L-15/10% FBS средой. В этой второй стадии фильтрации, сердца, сохраняются в фильтре и меньше мусора смывается.
7. Поверните фильтр с ног на голову и промойте сердца из фильтра в 1% агарозном покрытием чашке Петри, применяя три последовательных промывок 1 мл L-15/10% FBS.
8. Вручную отделяют GFP-положительных сердца от нефлуоресцентный эмбрионального мусора (например, глазные линзы) с парой щипцов под флуоресцентным стереомикроскопа и концентрируют их в центр чашки. Соберите их в соответствии со стадией 3.
   Примечание: Если эмбрионы старше 24 HPF, сердца следует бить, указывающий, что ткани еще физиологически нормальным.

3. Изоляция мРНК из DissecТед Сердца

1. Сбор сердца в наименьшей возможной объема (например, 10 мкл) и пипеткой в 1,5 мл пробирку, содержащую 0,75 мл RNAlater (на льду). Убедитесь, что нет сердца остаются на кончике пипетки, просмотрев его под флуоресцентным стереомикроскопа.
2. Кроме того, если химический капот в непосредственной близости от флуоресцентного микроскопа, передачи собранных сердца в триазол (Предостережение) под капотом химической. Это обходит возможную потерю сердца, торчащие в наконечника пипетки, а также во время центрифугирования из сердца (шаги 3,4, 3,5 и 3,7). Бассейн сердца из нескольких раундов изоляции в одной пробирке с TRIZOL и перейдите к шагу 3.8; Конечный объем не должен превышать 10% от первоначального объема Trizol.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Читайте Trizol Паспорт безопасности (MSDS) перед использованием. Ручка тризола реагента под капотом и рекомендуется использовать индивидуальные средства защиты. Избегать контакта с кожей, глазами и Женсканг. Удалить все источники возгорания.
3. Бассейн сердца из нескольких этапов изоляции в одной и той же трубе с RNAlater (на льду), а эффективность выделения РНК увеличивается с ростом объема собранной ткани. Если полный объем образца превышает 10% от исходного объема RNAlater, использовать дополнительную трубку с 0,75 мл RNAlater для хранения (на льду).
4. Центрифуга образцов при 15700 мкг в течение 20 мин при 4 ° С для осаждения сердца.
5. Под флуоресцентным стереомикроскопа, собирать тщательно столько супернатант насколько это возможно в 1% -ном агарозном покрытием чашку Петри, содержащую 3 мл L-15/10% FBS среду, но не мешать осевших сердца в нижней части центрифужную пробирку. Поскольку до 15% от сердца может оставаться в супернатанте из-за высокой вязкости RNAlater, извлекать их, как описано выше в стадии 3,7.
6. Под химической капотом, добавить 0,5 мл Trizol в пробирку, содержащую осевших сердца и держать на льду.
7. Под флуоресцентным microscoPE, передать сердца (из шага 3.5) из 1% агарозном покрытием блюдо, содержащие RNAlater / L-15/10% -ный раствор FBS в другой 1% агарозном покрытием блюдо с 3 мл L-15/10% FBS, чтобы разбавить из в RNAlater. Сбор сердца в центре чашки Петри и передавать их в небольшом объеме в трубку из осажденных сердца в триазол под капотом химической.
8. Vortex 1,5 мл пробирку, содержащую сердца в TRIZOL сорвать сердца и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
9. Под химической капотом, добавить 100 мкл хлороформа (Предупреждение), тщательно перемешать и перенести / хлороформ решение тризола в 1,5 мл предварительно развернулся PLG трубку (центрифуга 30 сек при максимальной скорости перед использованием). Инкубируют в течение 3 мин при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Читайте хлороформа паспорт безопасности перед использованием. Ручка хлороформ реагента под капотом и рекомендуется использовать индивидуальные средства защиты. Избегать контакта с кожей, глазами и одеждой. Хранить вдали от несовместимых, таких как металлы, щелочи.
10. CentrifuGE образца при 15700 х г в течение 15 мин при 4 ° С и передачи водной фазы в новую пробирку 1,5 мл.
11. Добавить 5-10 мкг гликогена и 250 мкл предварительно охлажденный (при -20 ° C) изопропанол; хорошо перемешать и инкубировать в течение ночи при -20 ° С.
12. Центрифуга образца при 15 700 х г в течение 30 мин при 4 ° С и отбросить супернатант.
13. Промыть гранулу с 1 мл 75% -ного этанола, центрифуге при 15700 х г в течение 15 мин при 4 ° С и отбросить супернатант.
14. Пусть этанола испаряется при сушке гранул при комнатной температуре, пока он не станет белым (например, в течение 10-15 мин).
15. Добавить 20 мкл РНКазы свободной DDH ₂ O, чтобы гранулы и инкубировать в течение 10-15 мин при 55 ° С, чтобы растворить РНК; затем держать на льду.
16. Оценка концентрации РНК и чистоту на измерении оптической плотности. Оценка целостности РНК, выполнив образец на 1% агарозном геле.

Результаты

Здесь мы опишем представительство сердце рассечение эксперимент с использованием данио TG (myl7: GFP) ^twu34 трансгенной линии ^9, в котором выражается зеленый флуоресцентный белок (GFP) исключительно в миокарде (рис 1).. Мы собрали оба расчлененный сердца и эмбрионы, из которых они...

Обсуждение

Этот протокол позволяет быстрое обогащение данио эмбриональных тканей сердца для экспрессии гена анализа. Количество и качество сердечно-конкретного образца РНК во многом зависит от нескольких важных этапов: во-первых, количество образца значительно улучшено, если потеря сердца пре?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment for raising fish and collecting eggs			see the Zebrafish Book11 for details
Fluorescence stereomicroscope
Refrigerated Microcentrifuge
UV-Spectrophotometer			e.g. Thermo Scientific Nanodrop 2000
Nucleic acid electrophoresis chamber
Petri dishes 4 cm Ø, coated with 1% agarose in E3 medium
Micropipettes and tips (P20, P100, P1000)
1.5 ml centrifugation tubes
15 ml and 50 ml centrifugation tubes
Pair of Dumont #5 forceps
ExactaCruz™ Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200μl	Santa Cruz	sc-201732
100 μm filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer)	BD Biosciences	352360
30 μm filter (Pre-Separation Filters-30 µm)	Miltenyi Biotec	130-041-407
Phase lock gel, heavy, 1.5 ml tubes	Prime	2302810
Egg water medium			60 μg/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue
E3 medium			5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4
Tricaine (3-amino benzoic acidethylester)	Sigma-Aldrich	A-5040	4 mg/ml Tricaine stock solution, pH 7
1% agarose (in E3 medium)
1% agarose gel (in TBE buffer)
Leibovitz´s L-15 medium	Gibco	21083-027
FBS (Fetal Bovine Serum)	Sigma	F4135
RNAlater	Ambion	AM7020
Trizol	Ambion	1559606
Glycogen	Invitrogen	10814-010	20 µg/µl in RNase-free water
chloroform
isopropanol
75% ethanol (in DEPC-ddH2O)
Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O
Nucleic acid loading buffer
TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis