Su larga scala Zebrafish embrionali Cuore dissezione per l'analisi trascrizionale

Riepilogo

Per analizzare i profili di espressione genica cardiaco durante lo sviluppo del cuore zebrafish, RNA totale deve essere estratto dai cuori isolati. Qui, vi presentiamo un protocollo per la raccolta funzionali / cuori che battono per una rapida dissezione manuale da embrioni di zebrafish per ottenere mRNA specifici cardiaco.

Abstract

Il cuore embrionale zebrafish è composto da poche centinaia di cellule, che rappresentano solo una piccola frazione dell'intero dell'embrione. Pertanto, per evitare che il trascrittoma cardiaco venga mascherato dal trascrittoma embrionale globale, è necessario raccogliere un numero sufficiente di cuore per ulteriori analisi. Inoltre, lo sviluppo cardiaco zebrafish procede rapidamente, raccolta cuore e metodi di estrazione di RNA devono essere veloce per garantire l'omogeneità dei campioni. Qui, vi presentiamo un protocollo dissezione manuale rapido per la raccolta funzionali / cuori che battono da embrioni di zebrafish. Questo è un presupposto essenziale per la successiva estrazione di RNA specifico cardiaco-per determinare cardiaco-specifici livelli di espressione genica per analisi trascrittomica, come ad esempio Real time PCR quantitativa (RT-qPCR). Il metodo si basa sulle proprietà adesive differenziali del cuore embrionale zebrafish rispetto ad altri tessuti; questo permette la rapida PHYSeparazione Sical di cardiaca dal tessuto extracardiache da una combinazione di fluidica perturbazione forza di taglio, filtrazione graduale e la raccolta manuale dei transgenici cuori fluorescente.

Introduzione

Zebrafish (Danio rerio) è ampiamente usato in biologia dello sviluppo per studiare organogenesi in vivo per la sua veloce, trasparente e extrauterina sviluppo embrionale, combinato con dimensioni ridotte e la disponibilità di linee giornalista transgeniche con espressione tessuto-specifica di proteine ​​fluorescenti. Questo piccolo vertebrato è particolarmente adatto per studiare lo sviluppo cuore perché l'ossigenazione del primo embrione zebrafish non si basa sul battito cardiaco e il flusso di sangue; queste caratteristiche hanno permesso la caratterizzazione di un gran numero di mutanti cardiovascolari ^1,2 e il pesce zebra è ora un organismo modello ampiamente riconosciuto per lo studio delle malattie del cuore ^3.

Per studiare l'espressione del gene durante lo sviluppo embrionale, le trascrizioni sono comunemente analizzati con tutto il montaggio in situ (WISH) ^4, RT-qPCR ^{5, 6} microarrays, o generazione sequenziamento next (RNA-Seq) ^7. MentreWISH consente un'analisi spazio-temporale di espressione genica nell'intero embrione, livelli di trascrizione sono solitamente valutati mediante RT-qPCR, microarrays o approcci RNA-Seq. Tuttavia, questi metodi richiedono arricchimento tessuto specifico per profili di espressione genica.

Poiché il cuore embrionale zebrafish rappresenta una piccola frazione dell'intero dell'embrione, studi trascrittoma durante lo sviluppo cardiaco richiedono un protocollo per la dissezione e arricchimento di cuori. Inoltre, per ottenere dati fisiologicamente rilevanti, è importante mantenere il tessuto cardiaco completamente funzionale fino estrazione dell'RNA. Qui, descriviamo un protocollo per isolare rapidamente fisiologicamente normale e battere i cuori di centinaia di embrioni di zebrafish per ottenere in modo efficiente campioni di RNA di alta qualità per ulteriori analisi. Il presente metodo è basato sul protocollo riportato da Burns e MacRae 2006 ^8. Per arricchimento del tessuto cardiaco, entrambi i metodi utilizzano una linea giornalista infarto transgenicae sfruttare le proprietà di adesione differenziale di zebrafish cuori embrionali rispetto ad altri tessuti. In breve, pipettando molti embrioni su e giù attraverso un puntale stretto, cuori sono simultaneamente rilasciati dai corpi embrionali e successivamente separati dai detriti embrionale in due fasi di filtrazione rapidi; cuori fluorescente vengono poi ordinati manualmente da residui restanti e raccolti per ulteriori elaborazioni.

Protocollo

Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali della legge tedesca e lo stato di Berlino; gestione zebrafish è stato monitorato dalle autorità locali per la protezione degli animali (LAGeSo, Berlin-Brandenburg).

1. Ottenere embrioni di zebrafish per Cuore Estrazione

1. Croce zebrafish giornalista cardiaca come il Tg (myl7: EGFP) ^twu34 linea transgenica ⁹ al fine di ottenere embrioni con espressione GFP-specific cuore.
2. Mantenere gli embrioni in acqua uovo a 28,5 ° C, fino alla fase embrionale desiderato ^10,11. Assicurarsi che la popolazione embrione raccolto è omogeneo sia geneticamente e stadio di sviluppo per limitare le variazioni nell'espressione genica.
3. Dechorionate gli embrioni manualmente.

2. Dissezione Zebrafish embrionali Hearts

NOTA: Tenere tutte le soluzioni sul ghiaccio. Se possibile, effettuare il lavoro di squadra: una persona analizza i cuori dal embRyos mentre un'altra persona ordina i cuori allo stereomicroscopio a fluorescenza. Questo permette la lavorazione di diverse centinaia di embrioni in poche ore.

1. Trasferire circa 100 embrioni in una provetta da 1,5 ml centrifugazione. Anestetizzare gli embrioni con tricaine (0,16 mg / ml in E3 medio). Procedere volta gli embrioni sono chiaramente anestetizzati (essi non nuotano e sedimenti sul fondo del tubo, ma i loro cuori sono ancora battendo).
2. Rimuovere la soluzione / E3 tricaine e lavare gli embrioni una volta con 1 ml di L-15/10% di media FBS e mantenere in ghiaccio.
   NOTA: Il mezzo FBS L-15/10% è importante mantenere gli organi e le cellule in vita durante l'intera procedura di dissezione fino a quando i cuori sono stati trasferiti in RNAlater o Trizol.
3. Aggiungere 1 ml di L-15/10% di media FBS agli embrioni e pipetta su e giù 5-8 volte con un Round Gel Loading Suggerimento fino a quando il tuorlo è completamente distrutto. Pipetta embrioni goccia a goccia sulla superficie della soluzione, in modo che la goccia scoppio egli embrioni vengono delicatamente interrotte.
   NOTA: Come con vigore e con quale frequenza gli embrioni devono essere pipettati su e giù dipende dallo stadio di sviluppo degli embrioni, cioè più pipettaggio è necessaria a stadi più avanzati (ad esempio a 56 HPF).
4. Per il primo lotto di embrioni sezionati, valutare l'integrità degli embrioni e la percentuale di cuore sezionato allo stereomicroscopio, dal momento che alcuni cuori possono rimanere attaccati ai embrioni se pipettati troppo delicatamente. Regolare il modo di pipettaggio per i prossimi turni di dissezione di conseguenza.
   NOTA: utilizzare punte bassa ritenzione per pipette e tubi microcentrifuga per ridurre al minimo i cuori attaccare alla plastica.
5. Applicare il campione attraverso un filtro 100 micron collocato su un tubo da 50 ml centrifugazione; risciacquare la provetta da 1,5 ml con 1 ml di mezzo L-15/10% FBS e quindi applicare questo al filtro per minimizzare la perdita del campione (alcuni cuori potrebbero essere attaccati alle pareti del tubo). Lavare due volte il filtro con 1 ml L-15 / 10% FBS. In questa fase i cuori passano attraverso il filtro e sono raccolti nel tubo 50 ml.
6. Applicare il flusso continuo su un filtro da 30 micron collocato su un tubo di centrifugazione 15 ml e risciacquare il filtro una volta con 1 ml L-15/10% FBS media. In questa seconda fase di filtrazione, i cuori sono trattenuti nel filtro e detriti più piccolo è lavato via.
7. Ruotare il filtro a testa in giù e lavare i cuori fuori del filtro in un agarosio rivestite Petri 1% applicando tre lavaggi consecutivi con 1 ml L-15/10% FBS.
8. Separare manualmente cuori GFP-positive dalla macerie embrionale nonfluorescent (ad esempio le lenti degli occhi), con un paio di pinze allo stereomicroscopio a fluorescenza e concentrarsi al centro del piatto. Raccogliere loro secondo step 3.
   NOTA: Se gli embrioni sono più vecchi di 24 HPF, il cuore dovrebbe essere battono, indicando che i tessuti sono ancora fisiologicamente normale.

3. Isolamento mRNA da dissezioneted Hearts

1. Raccogliere i cuori del minor volume possibile (ad esempio, 10 mL) e trasferirli in una provetta da 1,5 ml contenente 0,75 ml RNAlater (su ghiaccio). Verificare che nessun cuore rimane nella punta della pipetta visualizzando sotto uno stereomicroscopio a fluorescenza.
2. In alternativa, se una cappa chimica è disponibile nelle immediate vicinanze del microscopio a fluorescenza, trasferire i cuori raccolti in Trizol (ATTENZIONE) sotto il cofano chimica. Questo aggira la possibile perdita di cuori che spuntano nella punta della pipetta e anche durante la centrifugazione del cuore (i passaggi 3.4, 3.5 e 3.7). Pool i cuori di diversi cicli di isolamento nello stesso tubo con Trizol e passare direttamente al punto 3.8; il volume finale non deve superare il 10% del volume originale Trizol.
   NOTA: Leggere il Trizol Scheda di sicurezza (MSDS) prima dell'uso. Maneggiare Trizol reagente sotto una cappa e usura raccomandato dispositivi di protezione individuale. Evitare il contatto con la pelle, gli occhi e clothing. Rimuovere tutte le fonti di accensione.
3. Pool cuori di diversi cicli di isolamento nello stesso tubo con RNAlater (su ghiaccio), l'efficienza di isolamento dell'RNA migliora con la quantità di tessuto raccolto. Se il volume totale del campione supera il 10% del volume RNAlater originale, utilizzare un tubo supplementare con 0,75 ml RNAlater per la memorizzazione (su ghiaccio).
4. Centrifugare i campioni a 15.700 xg per 20 min a 4 ° C per sedimentare il cuore.
5. Sotto un stereomicroscopio a fluorescenza, raccogliere il più accuratamente possibile surnatante in una capsula petri agarosio rivestite 1% contenente 3 ml L-15/10% FBS mezzo, ma non disturbare i cuori sedimentate sul fondo del tubo di centrifugazione. Poiché fino al 15% dei cuori può rimanere nel supernatante causa dell'elevata viscosità di RNAlater, recuperali come descritto al punto 3.7.
6. Sotto una cappa chimica, aggiungere 0,5 ml Trizol per il tubo contenente i cuori sedimentati e tenere in ghiaccio.
7. Sotto la microsco fluorescentepe, trasferire i cuori (dal punto 3.5) dal piatto agarosio 1% rivestite contenenti la soluzione FBS RNAlater / L-15/10% in un altro piatto 1% agarosio rivestite con 3 ml L-15/10% FBS per diluire il RNAlater. Raccogliere il cuore nel centro della capsula di Petri e trasferirli in un piccolo volume nel tubo di cuori sedimentati in Trizol sotto cappa chimica.
8. Vortex la provetta da 1,5 ml contenente i cuori in Trizol perturbare il cuore e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
9. Sotto una cappa chimica, aggiungere 100 ml di cloroformio (ATTENZIONE), mescolare bene e trasferire la soluzione / cloroformio Trizol in un 1,5 ml pre-filata tubo PLG (centrifuga 30 sec alla massima velocità prima dell'uso). Incubare per 3 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: Leggere le MSDS cloroformio prima dell'uso. Manipolare il reagente cloroformio sotto una cappa e usura raccomandato dispositivi di protezione individuale. Evitare il contatto con la pelle, gli occhi e gli indumenti. Tenere lontano dai materiali incompatibili come i metalli, alcali.
10. Centrifugoge il campione a 15.700 xg per 15 min a 4 ° C e trasferire la fase acquosa in una nuova provetta da 1,5 ml.
11. Aggiungere 5-10 mg glicogeno e 250 microlitri preraffreddata (a -20 ° C) isopropanolo; mescolare bene e incubare per tutta la notte a -20 ° C.
12. Centrifugare il campione a 15.700 xg per 30 min a 4 ° C e scartare il surnatante.
13. Lavare il pellet con 1 ml di etanolo al 75%, centrifugare a 15.700 xg per 15 min a 4 ° C e scartare il surnatante.
14. Lasciare evaporare etanolo essiccando il pellet a temperatura ambiente fino a quando diventa bianco (ad esempio per 10-15 min).
15. Aggiungere 20 microlitri RNasi-free DDH ₂ O al pellet e incubare per 10-15 min a 55 ° C per sciogliere il RNA; poi tenere su ghiaccio.
16. Valutare la concentrazione di RNA e la purezza mediante misurazione assorbanza. Valutare l'integrità dell'RNA eseguendo il campione su un gel di agarosio 1%.

Risultati

Qui, descriviamo un esperimento rappresentativo dissezione cuore con il pesce zebra Tg (myl7: GFP) ^twu34 transgenici linea ^9, che esprime la proteina verde fluorescente (GFP) esclusivamente all'interno del miocardio (Fig. 1). Abbiamo raccolto sia il cuore sezionato e gli embrioni da cui sono stati ricavati per valutare la purezza del campione cuore. In breve, omozigote Tg (myl7: GFP) ^twu34 zebrafish ⁹ sono stati outcrossed con wild-type in modo che tutti ...

Discussione

Questo protocollo permette il rapido arricchimento di zebrafish tessuto cardiaco embrionale per analisi dell'espressione genica. La quantità e la qualità del campione RNA cardio-specifica dipende molto pochi passi fondamentali: in primo luogo, la quantità di campione viene notevolmente migliorata se la perdita di cuori è impedito ad ogni passo del protocollo, poiché la purificazione dell'RNA funziona solo con sufficiente materiale di partenza. In secondo luogo, la purezza del campione, che dipende interamen...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment for raising fish and collecting eggs			see the Zebrafish Book11 for details
Fluorescence stereomicroscope
Refrigerated Microcentrifuge
UV-Spectrophotometer			e.g. Thermo Scientific Nanodrop 2000
Nucleic acid electrophoresis chamber
Petri dishes 4 cm Ø, coated with 1% agarose in E3 medium
Micropipettes and tips (P20, P100, P1000)
1.5 ml centrifugation tubes
15 ml and 50 ml centrifugation tubes
Pair of Dumont #5 forceps
ExactaCruz™ Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200μl	Santa Cruz	sc-201732
100 μm filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer)	BD Biosciences	352360
30 μm filter (Pre-Separation Filters-30 µm)	Miltenyi Biotec	130-041-407
Phase lock gel, heavy, 1.5 ml tubes	Prime	2302810
Egg water medium			60 μg/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue
E3 medium			5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4
Tricaine (3-amino benzoic acidethylester)	Sigma-Aldrich	A-5040	4 mg/ml Tricaine stock solution, pH 7
1% agarose (in E3 medium)
1% agarose gel (in TBE buffer)
Leibovitz´s L-15 medium	Gibco	21083-027
FBS (Fetal Bovine Serum)	Sigma	F4135
RNAlater	Ambion	AM7020
Trizol	Ambion	1559606
Glycogen	Invitrogen	10814-010	20 µg/µl in RNase-free water
chloroform
isopropanol
75% ethanol (in DEPC-ddH2O)
Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O
Nucleic acid loading buffer
TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis