在肠系膜淋巴管空心​​大鼠模型:应用肠淋巴药物运输的评估

摘要

Here we describe a technique to cannulate the mesenteric lymph duct in rats which enables quantification of lipid and drug transport via the lymphatic system following intestinal delivery. The technique can be adapted to assess mesenteric lymph concentrations and/or transport of fluid, immune cells, peptides, proteins and lipophilic molecules.

摘要

肠道淋巴系统在流体输送，脂质的吸收及免疫功能键的作用。淋巴流直接从小肠通过一系列的淋巴管和节点会聚在肠系膜淋巴管。的肠系膜淋巴管插管从而使肠系膜淋巴结从肠流出的集合。肠系膜淋巴结由免疫细胞（99％淋巴细胞），水相（流体，肽和蛋白质，例如细胞因子和胃肠激素）和脂蛋白组分（脂质，亲脂性分子和apo-蛋白）的细胞级分。的肠系膜淋巴管插管模型因此可用于测量通过淋巴系统的浓度和一系列从肠道因素的输送速率。改变这些因素以响应不同的挑战（ 例如，饮食，抗原，药物）和在疾病（ 例如，炎性肠病，艾滋病，糖尿病）也BË确定。扩大感兴趣的一个领域是淋巴运输中的口服亲脂性药物和药物前体，与肠脂质吸收途径关联的吸收的作用。这里，我们描述，详细地说，一个肠系膜淋巴管空心​​大鼠模型使通过淋巴系统的速率和脂质和药物输送的程度的评价为以下的肠释放数小时。该方法是很容易适应在淋巴其它参数的测量。我们提供了建立这种复杂的外科手术方法时可能遇到的困难的详细描述，以及从实验失败和成功的有代表性的数据，以提供指令，关于如何确认实验的成功和解释所获得的数据。

引言

从小肠通过一个单向过程，起源于所包含的每个小肠绒毛¹内单乳糜淋巴流动。乳糜是相对可渗透的流体，大分子和细胞和淋巴形成从而开始与这些因素进入乳糜。在乳糜初始淋巴随后从肠经由淋巴微血管网络，收集（传入）淋巴管中，一系列的肠系膜淋巴结，并最终在后节点（传出）淋巴管流动。中的节点，淋巴通过一系列髓窦的其中交换发生在节点驻留的免疫细胞，以及材料进入从血液中的节点传递。所有淋巴从小肠流入最终收敛到传出肠系膜淋巴管，随后将乳糜池。该乳糜池还收集淋巴引流尾外周组织，INTEST伊纳勒，肝和腰部区域和一起加入胸淋巴导管与来自纵隔和身体的颅部位淋巴结。胸淋巴导管直接排空淋巴液进入静脉系统在左侧颈内静脉和锁骨下静脉的交界处。这里所描述的协议，使淋巴收集直接从肠系膜淋巴管，从而便于直接从通过肠道淋巴系统肠道全身（普通）循环过渡的各种因素进行分析。

分配到肠淋巴系统的主要生理功能是维持体液平衡，以促进脂质和亲脂性分子的吸收，以及使适当的免疫应答^1。肿瘤细胞和病毒也可通过淋巴管肠道淋巴管内发生的几种炎症和代谢病症^{5-7 2-4，}关键的变化传播。可以的肠系膜淋巴管nulation收集淋巴结内肠系膜使得能够经由肠淋巴散装流体流动分析的各种细胞和分子的浓度和输送速率，以及量化。改变浓度或这些因素的过境响应于各种挑战（ 例如，饮食，抗原，药物）和在疾病模型（ 例如，结肠炎，艾滋病，糖尿病）也可以评估。而这是不可能广泛描述其可以被分析和比较，这里的每个淋巴成分，肠系膜淋巴结简单化由含水，类脂和细胞相。的在水相中的兴趣的组件包括肽和蛋白质，例如抗原或耐受原^8，免疫信使如细胞因子和肥大细胞介质⁹和代谢介质如肠降血糖素^10。后节点肠系膜淋巴结的细胞部分包含lymphocyt的几乎完全（99％以上）上课^11。各种免疫细胞（树突状细胞，肥大细胞等 ）进入预结肠系膜淋巴管，但仍然在节点¹²内。如果内输入淋巴细胞是感兴趣的，则可以通过去除肠系膜淋巴结的收集这些细胞中的肠系膜淋巴管¹²的插管前节点几天。以这种方式，传入和传出淋巴管直接连接和淋巴细胞传入淋巴直接传递到肠系膜淋巴管。各种免疫细胞通过淋巴管肠道的运输和表型可以这样进行检查。或许引用于收集肠系膜淋巴结迄今为止最常见的原因，但是，是研究肠处理，吸收和膳食脂质和亲油性分子¹⁰的运输。

以下摄取，膳食脂质被消化（例如，从甘油三酯脂肪酸和单甘油酯，phospholipid到脂肪酸和溶血磷脂，和胆固醇酯脂肪酸和胆固醇等 ），并经由加法从胆汁两亲物的肠腔成小胶束和囊泡结构中分散（磷脂，胆固醇和胆汁盐）和作用胰腺酶^10,13。从这里，他们被吸收到肠。被吸收的组分的比例被重新酯化，以形成吸收细胞（肠）内的甘油三酯，磷脂和胆固醇酯。这些再酯化脂肪是由摄入外源性脂质成分和内源性脂质成分的自分泌胆汁，粘膜脂质池或肠道血液供应¹³的组合装配。从这里的酯化脂质要么存储肠内或组装成肠脂蛋白（乳糜微粒，极低密度脂蛋白（VLDL））连同各种脱辅基蛋白和其它亲脂性分子（ 如维生素^）10,13。退出后肠，脂蛋白是专门从肠道通过肠系膜淋巴系统运输到全身循环作为肠乳糜更可渗透其比肠毛细血管条目。吸收的脂质组分的比例还通过毛细血管和门静脉作为单独的，非相关的脂蛋白运送从肠道到体循环，分子^14。在一般情况下，然而，门静脉输送路径是唯一的一个显著球员的短链和中链长度的脂质吸收。

肠系膜淋巴结的收集由此使从肠脂蛋白和相关的部件（脂质，亲脂性分子，脱辅基蛋白）的传输的评估。脂蛋白可定量和表征的优点，即肠系膜淋巴结脂蛋白，在一般情况下，是在一个nascen吨状态，因为它们没有被广泛地通过全身酶改性，如脂蛋白脂肪酶^15。而肠系膜淋巴结插管的大鼠模型已经也许历来最广泛的脂质/脂蛋白运输从肠道的分析描述的，扩大的兴趣的区域是淋巴管中的亲脂性药物，前药和其他外源物^13,16的传输中的作用这是在这里描述的模型的焦点。亲脂性药物（一般是那些与log P> 5和溶解度在长链甘油三酯> 50毫克/克，尽管异常是明显的^）17,18，前药¹⁹和其他外源物^13,16可以访问肠淋巴或者被动地或通过积极融入肠道脂蛋白运输通路^19。

大鼠肠系膜淋巴结插管技术因此有许多应用。博尔曼等人首先描述一个techniqUE到导管插入大鼠的肠系膜淋巴管在1948年^20，从此一数量的变型的模型已经描述。例如，收集可在昏迷状态，同时抑制¹⁵或自由活动^23,24发生时，老鼠被麻醉的各种麻醉剂^21,22，或。大鼠可以施用不同补液溶液和其他物质如脂质和药物制剂以不同的速率进入胃，肠或肠胃外（一般0 -为5毫升/小时^）25。在一些研究中胸淋巴导管，而不是肠系膜淋巴管插管经由淋巴管来估计传输从肠道尽管这可能高估中转从小肠，取决于感兴趣的因素，因为胸淋巴导管还接收来自其它淋巴区^22,26。淋巴插管车型也已经在其他几个物种，包括小鼠^15,27，迷你PI描述GS ^12，28,29羊，猪³⁰和狗^31。然而，在大鼠模型中是最广泛和一致引用。对肠系膜淋巴管随后采集淋巴液中有意识²⁵或麻醉²²大鼠和小鼠^15,27的插管的详细方案先前已公布的和有兴趣的读者是针对这些协议。这个协议是第一次证明该技术在一个可视化格式。

淋巴空心大鼠模型拥有较大的动物模型的优势在费用方面，易用性的手术和伦理方面的考虑。相比，小鼠模型中，肠系膜淋巴结插管手术也是在大鼠容易虽然小鼠模型能够在转基因动物²⁷更详细的研究。尽管如此，也有在大鼠模型中，特别是那些在生理差异有关，该限extrapolat的一些局限离子对其他临床前和临床情况。例如，在大鼠胆汁流量是恒定的，独立的食物摄取，而在更高的物种的食物或脂质刺激胆汁流^32。这产生挑战获得代表前和餐后环境在大鼠反映了什么被认为是在较大的品种和人类。用于药物递送的研究，大的物质也可以评估淋巴运输时后的现实人类剂量的给药形式²⁵优选的。在最近的研究中，在肠系膜淋巴结脂质转运率被发现是跨越一个等效质量和脂质的类型，它提供了一些信心跨物种²⁷外插脂质转运数据给药后物种（小鼠，大鼠，狗）媲美。然而，模型的亲脂性药物，卤泛群运输，动物的大小（ 即狗>大鼠>小鼠）的顺序排名。比例因子可能因此被要求前trapolate大鼠淋巴药物传送数据到其他物种。

的淋巴插管模型的限制，一般来说，是直接被动淋巴收集从淋巴管可以修改淋巴流动和传输自淋巴管的工作对一个压力梯度被改变，一旦容器被插入套管^33。淋巴插管模型也可以是难以建立在实验室中是不熟悉的技术。替代模式进行了说明。举例来说，经由肠道淋巴系统的因素，如脂蛋白和亲脂性分子的转运，已经间接通过采集血液的研究。一个这样的模型涉及口服给药后，在存在和不存在抑制剂的比较脂质和/或药物的血药浓度（ 例如，秋水仙碱，普朗尼克L81，放线菌酮）肠脂蛋白生产阻断淋巴运输^34。优势的经由采集血样 ​​量化淋巴运输间接模型是，它使淋巴运输的一些评估在人中作为侵入性手术，不需要^35。然而，淋巴运输的抑制剂不特定且经由淋巴管输送因子稀释并修改在全身循环变得复杂这样的评估， 在体外替代物也被描述。例如，Caco-2细胞或分离的肠细胞培养物已被用于更详细地研究该进入淋巴管^36-38分子的肠分泌。一种先进的体外模型是比较有代表性的人体肠道微环境也在最近描述^39。在此模型中的淋巴管内皮细胞层是共培养Caco-2细胞使物质转移从肠进入淋巴管的更详细的分析。然而， 在VITRO单元系统缺乏交流流动和转移与肠腔和潜在血液和淋巴血管供应，即互联。在另一种方法，Kassis 等人建立了原位成像系统，使血管收缩，淋巴流动和肠系膜淋巴管荧光灯³³血脂浓度之间的定量比较，双通道（高速明场视频和荧光）。该模型在上述的体外系统的一个优点是，它使免疫细胞通过淋巴管的通道的准确的跟踪。质量的脂质（或药物）的运输的绝对测量，但是，尚未建立使用的成像方法， 在体外和在硅片接近经由肠淋巴也已出版^40-42特异性预测脂溶性药物输送的程度。例如， 离体数的c亲和力ompounds血浆乳糜微粒被发现关联相当好与它们在体内的⁴¹淋巴运输。接着，在同一组，在硅片模型建立一个预测药物亲和性基于多个物理化学性质⁴⁰乳糜微粒。冬青等人还建立了在计算机芯片模型相对复杂，以彻底预测分子描述符⁴²的基础上，亲脂性化合物的淋巴运输。这些模型可提供预测未知药物淋巴运输的程度上有用的方法。与广泛的药物和不同的实验室模型的验证将然而，需要确认其准确性和可重复性。

的肠系膜淋巴管插管因而仍然是唯一的手段来直接检查淋巴引流小肠和的因子（细胞，蛋白质的复数排列的传输速率的内容，肽在体内的情况淋巴液，脂类，药物）。这里我们描述了一个协议，用于在肠系膜淋巴管和颈动脉，使肠系膜淋巴结和从麻醉大鼠的全身血液的收集的插管。代表性的数据说明了如何在模型可用于通过肠系膜淋巴系统以检查脂质和药物输送从肠道。这之后，可以在建立模型和故障排除指南会遇到一个困难的讨论。一旦建立了模型是一个强大的工具，调查肠道淋巴运输。

研究方案

在这个手稿中描述的研究，批准由当地动物伦理委员会，并按照澳大利亚和新西兰会动物的护理研究与教学的指导方针进行的。在此之前开始的任何动物的程序，确保适当的权限是通过当地的机构/组织获得。与所有的动物外科手术，确保手术是经过适当培训的操作人员进行的，在无菌条件和麻醉剂，止痛药和抗生素时，必须确保道德，并取得圆满成功的管理。

1.准备前一天的手术过程

1. 如果需要手术的前一天晚上快的老鼠。确保鼠有自由饮水。
2. 制备的溶液，以施用给大鼠。
   1. 制备补液溶液例如无菌盐水或林格溶液。
   2. 准备作为审美要求的解决方案。在这里所描述的实验中使用的麻醉剂包括"鸡尾酒1"的制备通过组合1.9毫升氯胺酮100毫克/毫升，0.5毫升甲苯噻嗪100毫克/毫升，0.2的乙酰丙嗪10毫克/毫升毫升和2.5ml盐水和"鸡尾酒2"由1毫升氯胺酮100毫克/毫升和0.1ml乙酰丙嗪10毫克/毫升。注:吸入异氟烷或七氟醚可以是优选，因为它可以为更长的时间期间，提供麻醉的手术平面。
   3. 任选制备含有药物的制剂中，例如，脂质乳剂。执行适当的稳定性研究，以保证制剂的稳定性在储存和给药期。
      注:该制剂和药物的确切性质待施用将随着每次研究淋巴药物转运研究的目的是最经常以评价药物的淋巴运输的效率作为制剂和药物ADMINI的函数stered。
      1. 用在实验中的代表图4和5此处所述制剂被制备，如先前描述的^43。简言之，将包含^{14 C-}油酸（2-5微居里）和卤泛群（200微克）到40毫克油酸之前分散在5.6组成为5mM牛磺胆酸钠在磷酸盐缓冲盐水（pH值6.9）的水相的溶液中。
      2. 对于含有2-油酸单甘油酯的配方，加入7.1毫克2-油酸单甘油酯连同其它部件，以水相的同时作为油酸含卤泛群酸相。制备含有2-油酸单甘油酯前立即施用到老鼠2-油酸单甘油酯是相对不稳定的，isomerises〜1-油酸单甘油酯的配方。
      3. 接着乳化该制剂通过超声在室温2分钟。
         注:由于先前已描述^43，监视制剂用i的稳定性）乳状的外观检查在偏振光下传送给确保乳液不相分离，ⅱ）粒度分析以下使用动态光散射以提供任何相变和/或分离的指示给药制剂后即刻和，以及iii）用卤泛群浓度的分析经过验证的HPLC测定。
3. 制备在无菌水中含10mg抗凝血剂溶液/ ml的EDTA或10国际单位/毫升肝素的生理盐水冲洗淋巴插管。还制备含有2.5抗凝血剂溶液 - 10国际单位/毫升肝素的生理盐水冲洗颈动脉插管。
4. 制备的聚乙烯插管，用于插入肠系膜淋巴管（0.8毫米外径，0.5毫米内径），颈动脉（0.96毫米外径，0.58毫米内径0.8毫米外径，0.5毫米内径）和十二指肠（0.96毫米外径，0.58毫米内径）
   1. 切开插管到所需的长度（通常为25 - 30厘米为颈动脉和十二指肠插管和10 - 24厘米为淋巴卡恩ULA），并放置一斜面在用无菌手术刮刀将插管的尖端（参见图1）。
      注意:这增加了便于插管插入并减少套管堵塞后插入的发生率。
   2. 通过循环插管的小部分回到它自身上，用打火机或热板加热，然后切割成尺寸放置在十二指肠内插管J形锚点（ 见图1）。
5. 附加淋巴插管将25g针头和注射器含有抗凝血剂溶液（在步骤1.3中制备）。填充淋巴插管用抗凝血剂溶液中并保留在插管澳溶液/ N，减少淋巴收集期间凝块形成在淋巴插管的发生率。
6. 制备管淋巴和血液样品收集。预称量淋巴收集管，标号管淋巴和血液样品的收集和添加抗凝血剂溶液中。添加足够的抗凝血剂SOLUT离子达到1毫克/毫升EDTA的无菌水的最终浓度，或10 - 20国际单位/毫升肝素的收集淋巴或血液。

2.准备之前立即开始手术过程

1. 检查所有的插管通过用无菌盐水或抗凝血剂溶液冲洗，以确保它们是专利。
2. 制备大鼠的手术过程。
   注:肠系膜淋巴管是在吃了或已给予的油剂量为肠系膜淋巴结变成乳白色不透明具有较高的脂质负荷大鼠更为明显。一些运营商，特别是那些新的外科手术，因此可以更容易导管插入肠系膜淋巴管时大鼠预先服用一种油（大约0.1 - 1毫升）中，如橄榄油或豆油0.5 - 2小时之前开始手术。然而，给药前油影响脂质，亲脂性药物和其他因素在淋巴结的淋巴运输，使得它可能不是很理想，以预剂量油根据实验的目的。
   1. 整个麻醉手术和样本收集期的老鼠。
      1. 例如，通过皮下注射1.5毫升/千克鸡尾酒的启动麻醉朕（从步骤1.2.2），使用1ml注射器附连到地下25针插入皮肤褶皱在大鼠颈背部。保持经由腹膜内注射0.44毫升/约根据需要，使用1ml注射器附连到地下25针每小时公斤鸡尾酒2（来自步骤1.2.2）的麻醉。
      2. 之前开始的外科手术确保麻醉深度足以通过观察呼吸速率，晶须运动，肌肉张力和响应刺激如捏脚。根据需要管理更多的麻醉。
   2. 剃从手术区域，这包括右侧腹部淋巴结和十二指肠插管的毛皮，以及颈部和左锁骨区域为颈动脉插管化。
   3. 清洁无菌使用povidine碘溶液或洗必泰溶液和70％的乙醇擦洗手术区域。重复此操作3次对每个区域，用70％乙醇的最终清洗整理。
3. 将背recumbence动物在丢球一个以上的手术加热垫（37°C）。

3.插管的肠系膜淋巴管

1. 将动物用其右侧面朝向操作者。具有或不具有根据需要手术显微镜的帮助下进行手术。
2. 从中线（xyphoid处理）用无菌解剖刀刀片的直4厘米切口延伸到右侧约2厘米以下的肋骨（肋缘）打开腹部肌肉壁的顶层（ 见图2B）。
3. 从4打开腹部肌壁的其余层 - 5毫米外侧中线的右侧有一个小的对手术剪（ 见图2B）。
4. 收回小肠下，左腹部肌肉壁，并保持它在使用2个地方 - 3个无菌纱布，用生理盐水饱和。
5. 弥合老鼠在10毫升的塑料注射器在老鼠背上的右肾来缓解肠系膜淋巴管可视化水平横放。
6. 定位肠系膜淋巴管:一个容器大约0.5 - 1毫米直径的垂直于右肾和立即延髓并平行于肠系膜动脉（脉动暗红色血管;参见图2C）。
   注意:在非禁食或油预先给药的大鼠的血管是白色的，不透明的，更容易形象化比在禁食大鼠中它是相当透明的。
7. 检查区域紧接尾向大肠系膜淋巴管和肠系膜动脉，以确定是否一个第二，较小的附件淋巴管是目前。如果存在的话，方框淋巴液通过导管的流动通过切割导管和强力胶阻塞，或捆扎缝线周围的风道，以确保淋巴从肠流出的整个体积被从肠系膜淋巴管收集。
8. 通过肾周脂肪床通过一对直镊子在右肾的下缘，并通过结缔组织层紧接腔静脉的下方，在与肠系膜淋巴管平行的方向。
9. 使用镊子的顶端握住淋巴插管并通过肾周脂肪床一端紧邻肠系膜淋巴管，而另一个从动物exteriorised在右肾的水平拉出。
10. 由钝性分离覆结缔组织和脂肪组织层隔离肠系膜淋巴管。小心不要刺破或损坏的淋巴管。
11. 隔离淋巴管后，让小何乐在淋巴管有两种微型剪刀，珠宝商的镊子尖端或将25g针头。小心不要完全切断血管。
12. 确保淋巴插管完全充满抗凝血剂溶液（使用注射器和25g针），没有空气间隙。通过小孔用小钳子的帮助4毫米肠系膜淋巴管内 - 将淋巴导管大约2。
13. 观察淋巴插管几分钟。观察肠淋巴结的从套管的自由端收集的逐渐流如果插管是成功的。如果插管不成功，重复步骤3.8 - 3.12。
14. 如果插管是成功的，通过将一小滴兽医粘合剂的比入口孔进入淋巴管固定套管。小心不要通过多余的兽医胶粘剂的应用堵塞血管。
15. 虽然等待兽医粘合剂设置，安装前后已经淋巴液几分钟的流动，以确保所述的插管过程是成功的。一旦某些插管的成功，取出纱布枚被小心地放置在腹腔，并把小肠在其原来的位置。
16. 放置含有抗凝血剂淋巴收集管（参见步骤1.6）在所述套管的端部，以收集自由流动的淋巴。
17. 接着，导管插入十二指肠输注补液溶液和/或制剂。

4.插管十二指肠

1. 附上十二指肠插管到注射器（ 例如，10ml）中填充有补液溶液。
2. 确定十二指肠的亮粉色（有更多的血管）小肠部分，它在温和的向下拉动揭示了胃。
3. 通过使约2厘米以下的胃和十二指肠（幽门）的交界处十二指肠小穿刺孔无菌23政针。
4. 将通过穿刺孔十二指肠插管的歼形钩端。安全的地方用一滴氰基丙烯酸酯胶。
5. 通过将插管在输注泵中装入的补液注射器开始的大鼠的水合作用。据文献报道补液率从0.5 - 3毫升/小时^15,25。
6. 淋巴和十二指肠插管完成后，关闭该切口在腹部肌肉壁与缝合。然后通过施加几滴组织粘合剂（腈基丙烯酸酯）的沿所述切口的侧和夹持在切口两侧的皮肤一起关闭皮肤切口。

5.插管的颈动脉

颈动脉插管可能之前或肠系膜淋巴管的插管之后进行。一些运营商宁愿导管插入颈动脉cannulating的淋巴管，以便减少婆之前移动的动物时，tentially撞出淋巴导管。

1. 放置一个标记上的颈动脉插管从该斜面尖端2.5厘米识别管道的所述部分插入到动脉中。连接套管（ 即没有斜角）的另一端，以附着在填充有抗凝血剂溶液的注射器23或地下25针和填充套管与抗凝血剂溶液，确保没有空气间隙存在。
2. 为了便于插管，放置在背卧麻醉大鼠伸展颈部和头部指向操作人员。请注意，一些运营商更喜欢用老鼠的尾巴指向操作者执行该技术。
3. 通过皮肤层在矢状平面中的气管的左侧上方1.5厘米纵向切口 - 放置1。
4. 解剖使用钝头镊子以暴露底层配对颈部肌肉皮下结缔组织。
5. 收回颈部肌肉吨Ó揭示左颈动脉（位于约1厘米以下的皮肤表面和脉冲）。清理从动脉钝性分离上覆结缔组织。
6. 仔细分离使用钝组织钳，注意不要损坏相邻的迷走神经的轨道动脉的约1cm部分。通过打开和关闭所述钝头镊子垂直沿动脉的任一侧，以从周围组织和迷走神经释放它执行此。
7. 用细尖镊子，螺纹2丝线缝合颈动脉下方，并将其放置在分离的动脉部的每一端。摘下领带最接近的缝合操作和最远从大鼠的心脏和锁骨（ 图3A）。
8. 通过将一对直的细尖镊子的动脉（ 图3B）下方闭塞通过动脉的血流。
9. 使用细尖虹膜剪，放置一个小切口上的动脉（约1/3的顶面方式向下从分离区的顶部）。刷新任何泻血用肝素盐水动脉表面上，并用棉花提示轻轻擦拭。
10. 插入插管的尖端插入有一对弯曲的尖镊子的动脉。一旦插入，删除该直细尖镊子阻断血流，推进套管2.5厘米成使用两对镊子的一对保持动脉内插管动脉阻止血液泄漏背面，另一插入插管。
11. 用小动脉夹来保存动脉内插管，并删除被放置动脉以下步骤5.8闭塞血流直细尖镊子。
12. 通过注射抗凝血剂溶液进入插管和拉伸背部少量血液（ 图3C）证实插管的通畅。随后把抗凝溶液插管并使用的打火机的火焰或套管插头密封端。
13. 配合日Ë插管到位与两个缝合步骤5.8动脉之下。
14. 取出动脉夹，固定动脉插管，并围绕第三缝合。关闭伤口缝合带在脖子上。

6.手术后期间和输液制剂

1. 继续保持在麻醉下和在加热垫的大鼠。
2. 补充水分经由输注补液溶液大鼠进入十二指肠为至少0.5小时以下的插管的完成。观察淋巴流率减少（〜0.1 - 以0.5ml /小时）在初始阶段之后插管并很快增加到一稳定的基线（0.4 - 2.5毫升/小时取决于复水率）。
3. 以下恢复期，注入感兴趣的制剂（含有脂质，药物等 ）插入通过套管十二指肠。任选地，用一个输注泵来调节制剂的流速。注:在这里描述的协议动物保持anaesthetised整个手术和淋巴收集周期和麻醉下，使得不需要额外的镇痛实施安乐死。如果该协议被修改和动物启用恢复知觉，然后适当的镇痛和术后护理是必需的。
4. 在完成制定输液继续补充水分大鼠在1.5-3毫升/小时用生理盐水率进入十二指肠，以防止脱水。
5. 通过继续向下轻柔按压，以保持大鼠在37˚C加热手术垫，以保持温度（如每步2.3），明确尿液从膀胱放在小腹的要求，并重新眼药膏每隔一小时（如每步2.2。 3）。常规体位改变建议，如果动物是在手术后恢复意识。

7.集合淋巴和血液样本，以评估脂质和药物吸收

1. 收集淋巴不断进入管含有抗凝血剂。在规定的时间间隔改变管（ 如每小时）。
2. 采集血液样本在设定的时间点。
   1. 通过弯曲套管后面约2厘米的密封端阻塞通过套管的血流。启封插管通过切断密封端或移除套管插头。
   2. 用空的注射器，收回肝素盐水从套管，直到血液充满整个插管。
   3. 采用了全新的空的注射器，收回血和地点所需的体积含有抗凝血剂的管子。
   4. 使用第一注射器，更换采样之前所采取的血液，以减少不必要的血液损失。注射前，轻弹注射器，同时保持直立，以确保无气泡进入插管。
   5. 使用注射器，取代的血液从与抗凝血剂溶液中的鼠取出的体积。确保无残留的血液是可见的插管，任何剩余的可凝结并阻止插管。
   6. 弯曲插管从所述未密封端约2cm到方框血流并卸下注射器。使用的打火机的火焰或套管插头，重新密封的套管。
3. 在完成血液和淋巴收集从大鼠，经由> 100毫克/公斤戊巴比妥钠腹膜内给药安乐死大鼠。
4. 通过测量淋巴在每个时间段收集的质量确定淋巴流速。
5. 测量药物和脂质的浓度淋巴和血液使用中，例如，高效液相色谱法，HPLC-MS，或者使用市售试剂盒，以评估脂质和药物的吸收效率。
6. 计算药物和脂质在淋巴质量传输从收集到的测得的浓度和淋巴的容积的乘积。

结果

代表性实验的结果以定量通过以下使用肠系膜淋巴结插管模型肠递送淋巴系统的累积程度及脂质和药物转运的速率示于图4和图5，在该实验中，200微克的模型的亲脂性的药物卤泛群施用至大鼠的十二指肠在2小时中含有40mg油酸（包括2 - 5微居里^{14 C-}油酸）的制剂和7.1毫克2-油酸单甘油酯的磷酸分散在毫升5mM的5.6牛磺胆酸钠缓冲生理盐水pH值6.9。下列制剂给药的大鼠再?...

讨论

大鼠肠系膜淋巴结插管模型使浓度和各种细胞和分子（例如脂质和药物）从肠进入淋巴和修改这些发生在响应的传输速率的直接量化挑战各种物质（饮食，抗原，药物，制剂等 ^）10,27和疾病（癌症，病毒，大肠炎，胰岛素抗性等 ^）5-7。收集在淋巴结的组件也可被进一步用于另外的实验。例如，细胞可以是培养的^44，脂蛋白分馏和淋巴或它的组分，例如脂蛋白?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sterile saline	Baxter healthcare	AHB 1307	Any brand can be used. Example here is Baxter 100 ml saline bags, box of 50
70 % ethanol in water	Any		Any brand can be used
Chlorhexidine gluconate solution (Microshield 4)	Livingstone International	JJ60243L	Any brand can be used. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =JJ60243L
Betadine solution	Livingstone International	BU0510	Any brand can be used. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =BU0510
Ilium Ketamil (Ketamine 100 mg/ml)	PROVET VICTORIA	KETA I 1	http://www.provet.com.au/
Ilium Xylazil (Xylazine 100 mg/ml)	PROVET VICTORIA	TRO-3828	http://www.provet.com.au/
ACP 10 Injection (Acepromazine 10 mg/ml)	PROVET VICTORIA	VTG-DACP010020	http://www.provet.com.au/
Sodium pentobarbitone	PROVET VICTORIA	24529	Any brand can be used. Example here is Lethabarb® 325 mg/ml sodium pentobarbitone, Virbac Animal Health. http://www.provet.com.au
Heparin (35000I.U. in 35 mL)	Sigma Pharmaceuticals	337220	http://sigmaco.com.au/
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate	Sigma-Aldrich	E1644	Any brand can be used. Example here is disodium salt of EDTA from Sigma.
Polyethylene (PE) cannula o.d. 0.96 mm x i.d. 0.58 mm	Microtube extensions	PE8050	Any brand can be used. Example here is PE tubing 0.8x0.5 mm, 30 m
Polyethylene (PE) cannula o.d. 0.8 mm x i.d. 0.5 mm	Microtube extensions	PE9658	Any brand can be used. Example here is PE tubing 0.96x0.58 mm, 30 m
Ruler	Any		Any brand can be used
Markers	Any		Any brand can be used
Cigarette lighter	Any		Any brand can be used
Cyanoacrylate glue	Any		Any brand can be used
23 gauge needles	Livingstone International	DN23GX0.75LV	Any brand can be used. Example here is Livingstone Disposable Needle, Sterile, 23GX0.75inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT= 6&search=DN23GX0.75LV
25 gauge needles	Livingstone International	DN25GX1.0LV	Any brand can be used. Example here is Livingstone Disposable Needle, Sterile, 25GX1.0inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search= DN25GX1.0LV
1 ml syringe	Livingstone International	T3SS01TA	Any brand can be used. Example here is Terumo syringe 1 ml Slip Tuberculin 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =T3SS01TA
10 ml syringe	Livingstone International	T3SS10SA	Any brand can be used. Example here is Terumo syringe 10 ml Slip 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =T3SS10SA
Gauze swabs	Livingstone International	GSC075	Any brand can be used and cut to required size. Example here is gauze swabs cotton filled 7.5x7.5 cm, 8 ply. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =GSC075
Cotton buds	Livingstone International	CTAST075DP	Any brand can be used. Example here is Livingstone cotton applicator plastic double tipped. 75MM. 100/PK. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =CTAST075DP
Heating pad	Ratek	WT1	Any brand that keeps temperature at 37C can be used. Example here is Ratek warming tray.
Surgical light	Harvard Apparatus	72-0215 with 72-0267	Any brand can be used. Example here is Harvard apparatus V-Lux 1000 Cold Light Source with Bifurcated Gooseneck Light Guide, Black, 4.7 mm fiber diameter (each arm). http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_50601_ -1_HAI_ProductDetail and  http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_35487_ -1_HAI_ProductDetail___
Surgical microscope	Zeiss	495005-0014-000	Any brand can be used. Example here is Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000-C with Stand S Double Spot and KL 300 LED. https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=e&i=10143
Silk suture	Livingstone International	DTSK163019F4	Any brand can be used. Example here is *  Email this item to my friend 3/8 Circle Reverse Cut Silk Suture 3/0 Thread 19mm. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =DTSK163019F4
Scalpel blades	Fine Science Tools (FST)	10020-00	Any brand can be used. Example here is FST Scalpel Blade #20. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=191
Scalpel handle	Fine Science Tools (FST)	10004-13	Any brand can be used. Example here is FST Scalpel Handle #4. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=298&CategoryId=51
1 x Small surgical scissors	Fine Science Tools (FST)	14060-09	Any brand can be used. Example here is FST Fine Scissors, 9 cm with 21 mm cutting edge, sharp, straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=40&CategoryId=17
2 x Forceps with serrated curved tip	Fine Science Tools (FST)	11001-13	Any brand can be used. Example here is FST 13 cm standard pattern forceps with curved 2.8x1.4 mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=405&CategoryId=32
1 x Iridectomy scissors	Fine Science Tools (FST)	15000-08	Any brand can be used. Example here is FST Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge, Straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=17&CategoryId=16
1 x Forceps with straight serated tip	Fine Science Tools (FST)	11650-10	Any brand can be used. Example here is FST Graefe 10 cm straight with serrated 1 x 0.99 mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=390&CategoryId=32
1 x Forceps with smooth sharp straight fine tip	Fine Science Tools (FST)	11251-10	Any brand can be used. Example here is FST Dumont #5 forceps straight 11cm with 0.08 x 0.04mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=335&CategoryId=29
1 x Forceps with smooth fine curved forceps	Fine Science Tools (FST)	11063-07	Any brand can be used. Example here is FST Delicate Forceps 9 cm with smooth 0.4 x 0.3mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=360
2 x Hemostats	Fine Science Tools (FST)	13010-12	Any brand can be used. Not all operators use the hemostats. Example here is FST 12 cm Micro-Mosquito Hemostats with 20 mm length x 1.3 mm width serrated, straight tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=377&CategoryId=33
1 x Suture needle holder	Fine Science Tools (FST)	12001-13	Any brand can be used. Example here is FST 13cm Hasley Needle Holder with 16 mm length x 1.9 mm width tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=254&CategoryId=70
1 x Artery clamp	Fine Science Tools (FST)	18050-28	Any brand can be used. Example here is FST Bulldog Serrefines straight, 28 mm long, 9x1.6 mm jaw dimension with medium clamp press. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=270&CategoryId=82
Oleic acid	Sigma Aldrich	O1008	When required, any brand can be used. Example here is 99% pure oleic acid. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/o1008?lang=en&region=AU
14C-oleic acid	Perkin	NEC317050UC	Any brand can be used. Example here is Oleic Acid, [1-14C]-, 50µCi (1.85MBq). http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/NEC317050UC
Sodium taurocholate	Sigma Aldrich	T4009	Any brand can be used. Example here is taurocholic acid sodium salt hydrate ≥95% (TLC) . http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4009?lang=en&region=AU
Halofantrine	Glaxo Smith Kline		Halofantrine was kindly provided as a gift from Glaxo Smith Kline
Sodium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	71507	Any brand can be used. Example here is sodium phosphate monobasic monohydrate, BioXtra, for molecular biology, >99.5%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71643?lang=en&region=AU
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	71643	Any brand can be used. Example here is sodium phosphate dibasic dihydrate, BioUltra, for molecular biology, >99%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71507?lang=en&region=AU