La linfa mesenterica Duct Cannulated Rat Modello: Applicazione alla valutazione di intestinale linfatico Drug Transport

Riepilogo

Here we describe a technique to cannulate the mesenteric lymph duct in rats which enables quantification of lipid and drug transport via the lymphatic system following intestinal delivery. The technique can be adapted to assess mesenteric lymph concentrations and/or transport of fluid, immune cells, peptides, proteins and lipophilic molecules.

Abstract

Il sistema linfatico intestinale gioca un ruolo chiave nel trasporto di liquidi, l'assorbimento dei lipidi e la funzione immunitaria. La linfa scorre direttamente dal piccolo intestino attraverso una serie di vasi linfatici e nodi che convergono al dotto linfatico mesenterica superiore. Incannulazione del condotto mesenterico linfatico consente quindi la raccolta della linfa mesenterica scorre dall'intestino. Mesenterici costituito da una frazione cellulare di cellule immunitarie (99% linfociti), frazione acquosa (liquido, peptidi e proteine ​​quali citochine e ormoni intestinali) e frazione lipoproteina (lipidi, molecole lipofile e apo-proteine). Il condotto linfatico modello cannulazione mesenterica può quindi essere utilizzato per misurare la concentrazione ed il tasso di trasporto di una serie di fattori dall'intestino attraverso il sistema linfatico. Modifiche a questi fattori in risposta alle sfide differenti (ad esempio, le diete, gli antigeni, droga) e nella malattia (ad esempio, malattia infiammatoria intestinale, HIV, diabete) può anche be determinato. Un'area di espansione interesse è il ruolo del trasporto linfatico nell'assorbimento dei farmaci lipofili somministrati per via orale e profarmaci che associano con intestinali vie di assorbimento dei lipidi. Qui si descrive, in dettaglio, un modello di topo cannulata dotto linfatico mesenterica che consente di valutare la velocità e il grado di lipidi e di trasporto della droga attraverso il sistema linfatico per diverse ore dopo la consegna intestinale. Il metodo è facilmente adattabile alla misurazione di altri parametri in linfa. Forniamo una descrizione dettagliata delle difficoltà che si possono incontrare quando si stabilisce questo metodo chirurgico complesso, così come i dati rappresentativi di esperimenti falliti e di successo per fornire istruzioni su come per confermare il successo sperimentale e interpretare i dati ottenuti.

Introduzione

La linfa fluisce dal piccolo intestino attraverso un processo unidirezionale che origina a singoli lacteals che sono contenuti all'interno di ogni piccola villi intestinali ^1. Lacteals sono relativamente permeabile ai fluidi, macromolecole e cellule e la formazione della linfa quindi inizia con l'ingresso di questi fattori in lacteals. La linfa iniziale nei lacteals scorre successivamente dall'intestino tramite una rete di microvasi linfatici, raccolta (afferente) vasi linfatici, una serie di linfonodi mesenterici e, infine, i post-nodale (efferenti) vasi linfatici. Nei nodi, linfa passa attraverso una serie di seni midollari dove avviene lo scambio con le cellule immunitarie nodo residenti nonché materiale che entrano nodo dal sangue. Tutte linfa scorre dal piccolo intestino eventualmente converge nel dotto efferente linfa mesenterica superiore e successivamente il chyli cisterna. Il chyli cisterna raccoglie anche linfodrenante tessuti periferici caudali, intestinale, regioni epatiche e lombari e si unisce al dotto linfatico toracico con la linfa del mediastino e parti del cranio del corpo. Il dotto linfatico toracico svuota linfa direttamente nel sistema venoso a livello della giunzione delle vene giugulari e succlavia sinistra interna. Il protocollo qui descritto, che consente la raccolta di linfa direttamente dal condotto mesenterico linfatico superiore, facilita quindi l'analisi di vari fattori che transitano direttamente dall'intestino al (generale) circolazione sistemica attraverso il sistema linfatico intestinale.

Le principali funzioni fisiologiche assegnate al sistema linfatico intestinale sono di mantenere l'equilibrio dei fluidi, per facilitare l'assorbimento dei lipidi e molecola lipofila, e per consentire opportune risposte immunitarie ^1. Le cellule tumorali e virus si propagano anche attraverso i vasi linfatici intestinali ^2-4 e principali cambiamenti si verificano all'interno dei vasi linfatici in diverse patologie infiammatorie e metaboliche ^5-7. Lattinanulation del condotto linfatico mesenterico per raccogliere linfa nel mesentere consente un'analisi del flusso di fluido di massa attraverso i vasi linfatici intestinali e quantificazione del tasso di concentrazione e trasporto di varie cellule e molecole. Modifiche alla concentrazione o di transito di questi fattori in risposta alle varie sfide (ad esempio, diete, antigeni, farmaci) e in modelli di malattia (ad esempio, colite, HIV, diabete) possono anche essere valutate. Sebbene sia impossibile descrivere ampiamente ogni componente linfa che possono essere analizzati e confrontati qui, linfonodi mesenterici consiste semplicisticamente di acquosa, lipidi e fasi cellulari. I componenti di interesse nella fase acquosa includono peptidi e proteine, come antigeni o tolerogens ^8, messaggeri del sistema immunitario come le citochine e mediatori dei mastociti ^9, e mediatori metaboliche come incretine ^10. La frazione cellulare del mesenterico linfatico post-nodale consiste quasi interamente (oltre il 99%) di lymphocytES ^11. Varie cellule immunitarie (cellule dendritiche, mastociti, ecc) entrano nei vasi linfatici mesenterici pre-nodali, ma rimangono all'interno del nodo ^12. Se le cellule all'interno afferente linfa sono di interesse, è possibile raccogliere queste cellule mediante la rimozione della linfa mesenterica nodi diversi giorni prima cannulazione del condotto linfatico mesenterico ^12. In questo modo i condotti linfatici afferenti ed efferenti sono direttamente collegati e le cellule linfatici afferenti linfa passano direttamente nel condotto linfa mesenterica. Il transito e il fenotipo delle varie cellule immunitarie che passano attraverso i vasi linfatici intestinali possono quindi essere esaminati. Forse il motivo più comune citato per la raccolta della linfa mesenterica fino ad oggi, tuttavia, è quello di studiare la trasformazione intestinale, l'assorbimento e il trasporto dei lipidi alimentari e molecole lipofile ^10.

Dopo ingestione, lipidi alimentari sono digeriti (ad esempio, da trigliceridi di acidi grassi e monogliceridi, phospholipid di acidi grassi e lysophospholipid e esteri del colesterolo ad acidi grassi e colesterolo, ecc) e dispersi nel lume intestinale in piccola micelle e strutture vescicolari tramite l'aggiunta di anfifili di bile (fosfolipidi, sali biliari e colesterolo) e l'azione di enzimi pancreatici ^10,13. Da qui essi vengono assorbiti nel enterociti. Una parte dei componenti sono assorbiti riesterificati per formare trigliceridi, fosfolipidi e gli esteri del colesterolo nelle cellule assorbenti (enterociti). Questi lipidi riesterificati sono costituiti da una combinazione di esogenamente ingerito componenti lipidici e dei componenti lipidici endogeni dalla bile secreta, piscine lipidici mucosa intestinale o fornitura di sangue ^13. Da qui i lipidi esterificati o sono memorizzate all'interno di enterociti o assemblati in lipoproteine ​​intestinale (chilomicroni, lipoproteine ​​a bassissima densità (VLDL)) insieme a varie apoproteine ​​e altre molecole lipofile ( per esempio, vitamine) ^10,13. Dopo l'uscita enterociti, lipoproteine ​​sono specificamente trasportati dall'intestino nella circolazione sistemica attraverso il sistema linfatico mesenterico le lacteals intestinali sono più permeabili al loro ingresso di capillari sanguigni intestinali. Una parte dei componenti lipidici assorbiti vengono anche trasportati dall'intestino alla circolazione sistemica attraverso i capillari sanguigni e della vena porta, come singolo, non-lipoproteine ​​associati, molecole ^14. In generale, tuttavia, la via di trasporto vena porta è solo un operatore significativo l'assorbimento dei lipidi lunghezza della catena corta e media.

La raccolta della linfa mesenterica consente quindi la valutazione del trasporto delle lipoproteine ​​e componenti associati (lipidi, molecole lipofile, apo-proteine) dall'intestino. Le lipoproteine ​​possono essere quantizzati e caratterizzati con il vantaggio che lipoproteine ​​linfonodi mesenterici, in generale, sono in un nascenStato t poiché non sono stati ampiamente modificati da enzimi sistemici come lipoproteina lipasi ^15. Mentre la linfa mesenterica modello di ratto cannulato è forse storicamente più ampiamente descritto per l'analisi del trasporto di lipidi / lipoproteine ​​dall'intestino, una zona di espansione interesse è il ruolo dei linfatici nel trasporto di farmaci lipofili, profarmaci e altri xenobiotici ^13,16 che è al centro del modello qui descritto. Farmaci lipofili (generalmente quelli con log P> 5 e solubilità in catena lunga trigliceridi> 50 mg / g, anche se eccezioni sono evidenti) ^17,18, profarmaci ¹⁹ e altri xenobiotici ^13,16 può accedere ai vasi linfatici intestinali passivamente o da integrando attivamente in lipoproteine ​​intestinale vie di trasporto ^19.

Il ratto linfa mesenterica tecnica incannulamento ha quindi molte applicazioni. Bollman et al. Primo descrisse una technique per cannulare condotto linfa mesenterica nei ratti nel 1948 ^20. Da allora una serie di variazioni sul modello sono state descritte. Ad esempio, la raccolta si può verificare quando il ratto è anestetizzato con diversi anestetici ^21,22, o in stato cosciente, mentre trattenuto ¹⁵ o liberamente in movimento ^23,24. I ratti possono essere somministrati diverse soluzioni reidratanti e di altre sostanze come i lipidi e le formulazioni di farmaci a prezzi diversi nello stomaco, l'intestino o parenterale (in genere 0-5 ml / h) ^25. In alcuni studi dotto linfatico toracico piuttosto che condotto linfatico mesenterico è cannulati stimare trasporto dall'intestino attraverso i vasi linfatici anche se questo può sovrastimare transito dal piccolo intestino, a seconda del fattore di interesse, come il dotto linfatico toracico riceve anche linfatico da altri regioni ^22,26. Modelli incannulamento linfonodi sono stati descritti in numerose altre specie, tra cui topi ^15,27, mini-pigs ^12, pecore ^28,29, maiali e cani ^{30 31.} Tuttavia, il modello di ratto è il più ampiamente e costantemente citata. Protocolli dettagliati per l'incannulamento della condotta della linfa mesenterica seguita dalla raccolta di linfa in conscia ²⁵ o anestetizzato ²² ratti e topi ^15,27 sono stati pubblicati in precedenza e il lettore interessato è rivolta a questi protocolli. Questo protocollo è il primo a dimostrare la tecnica in un formato visualizzato.

La linfa cannulata modello murino ha dei vantaggi rispetto ai modelli animali di maggiori dimensioni in termini di costi, la facilità di chirurgia e le considerazioni etiche. Rispetto al modello di topo, mesenterica chirurgia incannulazione linfatico è anche più facile nel ratto, anche se il modello del mouse consente studi più approfonditi sugli animali transgenici ^27. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni del modello di ratto, in particolare quelle legate a differenze nella fisiologia, tale limite extrapolatione ad altre situazioni pre-clinici e clinici. Ad esempio, nel flusso di ratto biliare è costante ed indipendente dall'assunzione di cibo che negli alimenti specie superiore o lipidi stimolano flusso biliare ^32. Questo crea problemi per ottenere rappresentanza ambienti pre e post-prandiale nel ratto che riflettono ciò che si vede in specie più grandi e gli esseri umani. Per gli studi di somministrazione di farmaci, specie più grandi possono anche essere preferito al momento della valutazione del trasporto linfatico dopo la somministrazione di dosi realistico umano forma ^25. In un recente studio, prezzi di trasporto dei lipidi nella linfa mesenterica sono risultati comparabili tra le specie (topo, ratto, cane) dopo la somministrazione di una massa equivalente e il tipo di lipidi che fornisce una certa fiducia in estrapolando i dati di trasporto dei lipidi tra le specie ^27. Tuttavia, il trasporto di un modello lipofilo droga, alofantrina, ordinati in ordine di grandezza animale (cioè, cane> rat> mouse). Un fattore di scala può quindi essere richiesto di extrapolate dati sul trasporto di droga linfatici da topo ad altre specie.

Una limitazione di modelli linfatico cannulazione, in generale, è che la raccolta della linfa passiva direttamente da un condotto linfatico può modificare il flusso linfatico e trasporto dal vasi linfatici funzionano contro un gradiente di pressione che viene alterata quando il vaso è cannulata ^33. Il modello linfa incannulamento può anche essere difficile stabilire in laboratori che non hanno familiarità con la tecnica. Sono stati così descritto modelli alternativi. Per esempio, il transito di fattori attraverso il sistema linfatico intestinale, come lipoproteine ​​e molecole lipofile, è stata studiata indirettamente tramite la raccolta di sangue. Un tale modello prevede confrontando concentrazioni ematiche di lipidi e / o farmaci dopo somministrazione orale in presenza e in assenza di inibitori (ad esempio, colchicina, Pluronic L81, cicloeximide) della produzione lipoproteine ​​intestinali che bloccano il trasporto ³⁴ linfatica. Un vantaggiodi modelli che quantificano il trasporto linfatico indirettamente tramite la raccolta di campioni di sangue è che permette una valutazione del trasporto linfatico negli esseri umani come la chirurgia invasiva, non è richiesto ^35. Tuttavia, gli inibitori del trasporto linfatico non sono specifici e fattori che sono trasportate attraverso i vasi linfatici sono diluiti e modificati nella circolazione sistemica che complica tali valutazioni. In vitro alternative sono stati descritti. Ad esempio, le culture Caco-2 cellulari o isolato enterociti sono stati utilizzati per studiare in modo più approfondito la secrezione intestinale di molecole che entrano i vasi linfatici ^36-38. Un modello avanzato in vitro che è più rappresentativo del microambiente intestinale umano è stato anche recentemente descritto ^39. In questo modello di uno strato di cellule endoteliali linfatico è co-coltura con cellule Caco-2 che consente un'analisi più dettagliata del trasferimento di sostanze dall'intestino nei vasi linfatici. Tuttavia, in vitro sistemi cellulari mancanza di flusso di scambio e di trasferimento, ossia l'interconnessione con un lume intestinale e sangue alla base e la fornitura vascolare linfatico. In un approccio alternativo, Kassis et al. Stabilito un doppio canale (campo chiaro ad alta velocità di video e fluorescenza) in situ sistema di imaging che permette di confronto quantitativo fra contrazione nave, il flusso linfatico e le concentrazioni di lipidi fluorescenti mesenterici vasi linfatici ^33. Un vantaggio di questo modello sopra citato in sistemi in vitro è che consente un monitoraggio accurato del passaggio di cellule immunitarie attraverso i vasi linfatici. Misurazioni assolute di lipidi massa (o droga) trasporto sono, tuttavia, non sono ancora stabiliti con metodi di imaging. In vitro e in silico approcci per prevedere in particolare la misura del trasporto di droga lipofila attraverso i vasi linfatici intestinali sono stati anche pubblicati ^40-42. Ad esempio, l'ex vivo affinità di vari compounds per chilomicroni plasma è risultato correlare ragionevolmente bene con il loro trasporto linfatico in vivo ^41. Successivamente, lo stesso gruppo ha stabilito un modello in silico per prevedere affinità farmaco per chilomicroni basate su più ^{di 40} proprietà fisico-chimiche. Holm et al. Anche stabilito un modello relativamente complessa in silico per prevedere definitiva trasporto linfatico di composti lipofilici sulla base di descrittori molecolari ^42. Questi modelli possono fornire un approccio utile prevedere l'ampiezza del trasporto linfatico droghe sconosciute. Validazione dei modelli con una vasta gamma di farmaci e tra i vari laboratori, tuttavia, è necessario per confermare la loro accuratezza e riproducibilità.

Incannulazione del condotto mesenterico linfatico rimane pertanto l'unico mezzo per esaminare direttamente il contenuto della linfodrenante tenue e il tasso di transito della complessa serie di fattori (cellule, proteine,peptidi, lipidi, farmaci) in linfa in una situazione in vivo. Qui si descrive un protocollo per incannulazione del dotto linfatico e carotide arteria mesenterica che consente la raccolta di linfa mesenterica e arteriosa sistemica da ratti anestetizzati. Dati rappresentativi dimostrano come il modello può essere utilizzato per esaminare lipidico e trasporto del farmaco dall'intestino attraverso il sistema linfatico mesenterico. Questa è seguita da una discussione di difficoltà che si possono incontrare nella definizione del modello e una guida alla risoluzione. Una volta stabilito il modello è un potente strumento per studiare il trasporto linfatico intestinale.

Protocollo

Gli studi descritti in questo manoscritto sono stati approvati dal comitato etico animali locale e sono state condotte in conformità con il Consiglio Australia e Nuova Zelanda per la cura degli animali nella ricerca e nell'insegnamento linee guida. Prima di iniziare qualsiasi procedura di animale, assicurarsi che le autorizzazioni appropriate è ottenuta attraverso l'istituto / organizzazione locale. Come per tutti gli interventi chirurgici su animali, assicurarsi che l'intervento viene eseguito da operatori adeguatamente formati, in condizioni asettiche e che anestetici, analgesici e antibiotici vengono somministrati quando necessario per assicurare un risultato etico e di successo.

1. Preparazione Il giorno prima della procedura chirurgica

1. Digiunare il ratto la sera prima dell'intervento, se necessario. Assicurarsi che il ratto ha libero accesso all'acqua.
2. Preparare le soluzioni da somministrare al ratto.
   1. Preparare una soluzione reidratante come soluzione salina sterile o soluzione Ringer.
   2. Preparare unLe soluzioni estetiche come richiesto. L'anestetico utilizzato negli esperimenti qui descritti consisteva di "cocktail 1" preparata combinando 1,9 ml di ketamina 100 mg / ml, 0,5 ml di xilazina 100 mg / ml, 0,2 ml di acepromazina 10 mg / ml e 2,5 ml di soluzione fisiologica e " cocktail 2 "costituito da 1 ml di ketamina 100 mg / ml e 0,1 ml acepromazina 10 mg / ml. NOTA: inalazione isoflurano o sevoflurano può essere preferito in quanto può fornire un piano di anestesia chirurgica per un periodo di tempo più lungo.
   3. Facoltativamente preparare una formulazione contenente il farmaco, per esempio, una emulsione lipidica. Eseguire studi di stabilità appropriati per assicurare la stabilità della formulazione durante il periodo di conservazione e la somministrazione.
      NOTA: La natura esatta della formulazione e farmaci da somministrare varierà con ogni studio come l'obiettivo di studi trasporto linfatici farmaco è più spesso per valutare l'efficienza del trasporto di droga linfatica in funzione della formulazione e droga administered.
      1. La formulazione utilizzata negli esperimenti rappresentativi nella figura 4 e 5 qui viene preparato, come descritto in precedenza ^43. Brevemente, ¹⁴ C includere acido oleico (2-5 pCi) e alofantrina (200 mg) in 40 mg di acido oleico prima dispersione in 5,6 ml di una fase acquosa comprendente 5 mM sodio taurocolato in tampone fosfato (pH 6,9).
      2. Per formulazioni contenenti 2-monoolein, aggiungere 7,1 mg di 2-monoolein insieme ad altri componenti, alla fase acquosa allo stesso tempo come oleico fase acida contenente alofantrina. Preparare le formulazioni contenenti 2-monoolein immediatamente prima della somministrazione nel ratto come 2-monoolein è relativamente instabile e isomerises a 1-monoolein.
      3. Successivamente emulsionare le formulazioni da ultrasuoni per 2 min a RT.
         NOTA: Come è stato descritto in precedenza ^43, monitorare la stabilità delle formulazioni da i) esame visivo della emulsione sotto luce polarizzata per assicurare che l'emulsione non è fase separata, ii) analisi granulometrica immediatamente dopo la preparazione e dopo dosaggio utilizzando light scattering dinamico per fornire una indicazione di eventuali modifiche e / o separazione di fase, e iii) analisi delle concentrazioni di alofantrina usando un test HPLC convalidato.
3. Preparare la soluzione anticoagulante contenente 10 mg / ml di EDTA in acqua sterile o 10 UI / ml di eparina in soluzione salina per sciacquare la cannula linfa. Anche preparare soluzione anti-coagulante contenenti 2,5-10 IU / ml di eparina in soluzione salina per sciacquare la cannula carotide.
4. Preparare le cannule in polietilene per l'inserimento nel condotto linfa mesenterica (0,8 mm di diametro, ID 0.5 mm), carotide (0,96 millimetri OD, 0,58 millimetri ID 0,8 mm di diametro, 0,5 millimetri ID) e del duodeno (0,96 millimetri OD, 0,58 millimetri ID )
   1. Tagliare le cannule alla lunghezza desiderata (tipicamente ai 25 - 30 cm per l'arteria carotide e la cannula duodenale e 10 - 15 cm per il cann linfaticoula) e posizionare uno smusso sulla punta delle cannule utilizzando una lama chirurgica sterile (vedi Figura 1).
      NOTA: Questo aumenta la facilità di inserimento della cannula e riduce l'incidenza di cannula blocco post-inserimento.
   2. Inserire un punto di ancoraggio di forma J nella cannula intraduodenale avvolgendo una piccola porzione della cannula su se stesso, riscaldandolo con un piatto leggero o caldo e poi tagliando a misura (vedi Figura 1).
5. Fissare la cannula linfatico ad un ago 25 G e siringa contenente una soluzione anticoagulante (preparato al punto 1.3). Riempire la cannula linfatico con la soluzione anticoagulante e lasciare la soluzione nella cannula O / N per ridurre l'incidenza della formazione di coaguli nella cannula linfatico durante la raccolta linfa.
6. Preparare le provette di linfa e campione di sangue raccolta. Pre-pesare provette per il prelievo della linfa, tubi di etichette per la linfa e il campione di sangue raccolta e aggiungere soluzione anti-coagulante. Aggiungere sufficiente solut anticoagulanteion per ottenere una concentrazione finale di 1 mg / ml di EDTA in acqua sterile o 10 - 20 IU / ml di eparina nella linfa o sangue raccolto.

2. Preparati Immediatamente prima di iniziare la procedura chirurgica

1. Controllare tutti cannule da lavaggio con soluzione salina sterile o soluzione anti-coagulante per garantire che essi siano brevetto.
2. Preparare il topo per la procedura chirurgica.
   NOTA: Il condotto linfatico mesenterica è più visibile in ratti che hanno mangiato o state somministrate una dose di olio come linfa mesenterica diventa lattiginoso e opaco con maggiore carico lipidico. Alcuni operatori, in particolare quelli nuovi per l'intervento chirurgico, quindi è più facile cannulare condotto linfa mesenterica quando i ratti sono pre-dosati con un olio (circa 0,1-1 ml), come d'oliva o olio di soia 0,5-2 ore prima dell'intervento iniziare . Tuttavia, pre-dosaggio dell'olio colpisce il trasporto linfatico lipidi, farmaci lipofili e altri fattori in linfa tale che non può essere ideale per pre-dosaggio dell'olioa seconda dello scopo dell'esperimento.
   1. Anestetizzare ratto per tutto il periodo di raccolta chirurgia e campione.
      1. Ad esempio, avviare l'anestesia mediante iniezione sottocutanea di 1,5 ml / kg di cocktail I (dal punto 1.2.2) in una piega della pelle nella parte posteriore del collo ratti utilizzando una siringa da 1 ml collegata ad un ago da 25 G. Mantenere anestesia mediante iniezione intraperitoneale di 0,44 ml / kg di cocktail 2 (dal punto 1.2.2) approssimativamente ogni ora come richiesto, utilizzando una siringa da 1 ml collegata ad un ago da 25 G.
      2. Prima di iniziare l'operazione assicurarsi che la profondità dell'anestesia è sufficiente osservando frequenza respiratoria, movimento basette, tono muscolare e risposte a stimoli quali pizzicamento del piede. Somministrare anestesia supplementari come richiesto.
   2. Accorciare il pelo dalle regioni chirurgiche, che includono il lato destro dell'addome per incannulazione linfa e del duodeno, e la regione di collo e clavicola sinistra per carotide cannulazione.
   3. Pulire le regioni chirurgiche asetticamente con una soluzione o clorexidina soluzione iodio-povidone e etanolo scrub al 70%. Ripetere 3 volte per ogni regione, per finire con una pulizia finale con il 70% di etanolo.
3. Posto l'animale in prona dorsale su un foglio sopra un tampone chirurgico riscaldata (37 ° C).

3. Incannulazione della mesenterica Lymph Duct

1. Posto l'animale con il lato destro rivolto verso l'operatore. Effettuare l'intervento chirurgico con o senza l'ausilio di un microscopio chirurgico come richiesto.
2. Aprire lo strato superiore della parete muscolare addominale con una scala 4 centimetri incisione che si estende dalla linea mediana (processo xifoidea) al fianco destro circa 2 cm al di sotto della cassa toracica (margine costale) utilizzando un bisturi sterile (vedere la Figura 2B).
3. Aprire rimanenti strati della parete muscolare addominale 4-5 mm lateralmente alla linea mediana al fianco destro con una piccola coppiadi forbici chirurgiche (vedi Figura 2B).
4. Ritrarre il piccolo intestino sotto la parete muscolare addominale sinistra e tenerlo in posizione con 2 - 3 pezzi di garza sterile saturi con soluzione fisiologica.
5. Ponte ratto su una siringa di plastica da 10 ml posto orizzontalmente sotto la schiena del topo a livello del rene destro per facilitare la visualizzazione del dotto mesenterico linfatico.
6. Individuare il condotto superiore mesenterico linfatico: un recipiente di circa 0,5-1 mm di diametro che è perpendicolare al rene destro e subito rostrale e parallelo l'arteria mesenterica (scuro vaso sanguigno rosso pulsante; vedere la Figura 2C).
   NOTA: Nei ratti pre-dosati non a digiuno o di olio la nave è bianco, opaco e più facile da visualizzare che nei ratti a digiuno in cui è del tutto trasparente.
7. Controllare la zona immediatamente caudalmente alla grande condotto di linfa mesenterica superiore e l'arteria mesenterica per determinare se un secondo condotto linfatico, più piccolo accessorio èpresente. Se presente, bloccare il flusso della linfa attraverso il condotto di recidere il condotto e occludere con colla, o legando una sutura attorno al condotto, per assicurare che l'intero volume della linfa scorre dall'intestino viene raccolta dal condotto superiore linfonodi mesenterici.
8. Passare una coppia di pinze diritte attraverso il letto grasso perirenale al margine inferiore del rene destro, e attraverso gli strati del tessuto connettivo immediatamente sotto la vena cava, in una direzione parallela al condotto superiore linfa mesenterica.
9. Utilizzando la punta della pinza afferrare cannula linfa e tirarlo attraverso il letto grasso perirenale con un'estremità immediatamente adiacente al condotto mesenterico linfatico e l'altra esteriorizzato dall'animale al livello del rene destro.
10. Isolare il condotto linfa mesenterica da strati sovrapposti di tessuto connettivo e grasso per via smussa. Fare attenzione a non forare o danneggiare il condotto linfatico.
11. Dopo aver staccato il condotto linfa, fare un piccolo hole nel condotto linfatico sia con micro-forbici, la punta affilata della pinza del gioielliere o un ago 25 G. Fare attenzione a non recidere completamente il vaso.
12. Assicurarsi che la cannula linfatico è completamente riempito con una soluzione anti-coagulante (utilizzando una siringa e 25 ago G) senza vuoti d'aria. Inserire la cannula linfatico circa 2 - 4 mm all'interno del condotto mesenterico linfatico attraverso il piccolo foro con l'ausilio di un piccolo paio di pinze.
13. Osservare la cannula linfa per un paio di minuti. Osservare un graduale flusso della linfa intestinale dall'estremità raccolta libera della cannula se la cannulazione successo. Se l'incannulamento non è riuscita, ripetere i passaggi 3,8-3,12.
14. Se l'incannulazione è riuscita, fissare la cannula mettendo una piccola goccia di adesivo veterinaria sopra il foro di entrata nel condotto linfatico. Fare attenzione a non occludere il vaso tramite l'applicazione di un eccesso di adesivo veterinaria.
15. In attesa che l'adesivo veterinaria per impostare, osserve il flusso della linfa per alcuni minuti per garantire che la procedura cannulazione avuto successo. Una volta determinato il successo della cannulazione, rimuovere i pezzi di garza che sono stati collocati nella cavità addominale e posizionare accuratamente l'intestino tenue nella sua posizione originale.
16. Inserire un tubo di raccolta linfa contenente anticoagulante (vedere fase 1.6) alla fine della cannula per raccogliere la linfa scorrevole.
17. Successivamente, cannulate duodeno per infusione di soluzioni reidratazione e / o formulazioni.

4. Incannulazione del duodeno

1. Fissare la cannula duodenale a una siringa (ad esempio, 10 ml) riempito con la soluzione di reidratazione.
2. Identificare duodeno come rosa brillante (con più vasi sanguigni) sezione del piccolo intestino e che alla discesa delicato tirando rivela lo stomaco.
3. Fare un piccolo foro puntura nel duodeno a circa 2 cm al di sotto della giunzione dello stomaco e del duodeno (piloro) utilizzandouna sterile 23 G ago.
4. Inserire l'estremità agganciata a forma di J della cannula duodenale attraverso il foro puntura. Fissare in posizione con una goccia di colla cianoacrilato.
5. Iniziare idratazione del ratto collegando la cannula alla siringa reidratazione caricata in una pompa per infusione. Secondo la letteratura tassi reidratazione variano 0,5-3 ml / hr ^15,25.
6. Dopo il completamento della linfa e cannulazione del duodeno, chiudere l'incisione nella parete muscolare addominale con suture. Quindi chiudere l'incisione cutanea applicando qualche goccia di adesivo tissutale (cianoacrilato) lungo il lato dell'incisione e pizzicando la pelle su entrambi i lati dell'incisione insieme.

5. Incannulazione della carotide

L'arteria carotide incannulamento può essere eseguita prima o dopo la cannulazione del condotto linfatico mesenterica. Alcuni operatori preferiscono cannulare carotide prima cannulating condotto linfatico modo da ridurre pozialmente sloggiare la cannula linfa quando si sposta l'animale.

1. Inserire un segno sulla carotide cannula 2.5 cm dalla punta conica per identificare la porzione di tubo da inserire nell'arteria. Collegare l'altra estremità della cannula (cioè, senza bisello) ad un ago G 23 o 25 attaccato ad una siringa riempita con la soluzione anticoagulante e riempire la cannula con la soluzione anticoagulante assicurandosi lacune aria sono presenti.
2. Per facilitare l'incannulamento, posizionare il topo anestetizzato in decubito dorsale con il collo allungato e la testa rivolta verso l'operatore. Si noti che alcuni operatori preferiscono eseguire questa tecnica con la coda del topo rivolta verso l'operatore.
3. Inserire un 1 - incisione longitudinale 1,5 centimetri attraverso lo strato di pelle sopra fianco della trachea nel piano sagittale.
4. Sezionare il tessuto connettivo sottocutaneo con pinze punta smussata per esporre i sottostanti muscoli del collo appaiati.
5. Ritrarre i muscoli del collo to rivelare l'arteria carotide sinistra (situato ~ 1 cm sotto la superficie della pelle e pulsante). Pulire il tessuto connettivo sovrastante dalla arteria per via smussa.
6. Isolare una sezione ~ 1 cm dell'arteria con attenzione pinze tessuto smussato, facendo attenzione a non danneggiare la pista del nervo vagale adiacente. Eseguire questa aprendo e chiudendo la pinza punta smussata verticalmente lungo due lati dell'arteria per liberarlo dal tessuto circostante e nervo vago.
7. Utilizzando pinze punta fine, infilare due suture di seta sotto l'arteria carotide e metterli a ciascuna estremità della sezione dell'arteria isolato. Legare la sutura più vicino all'operatore e lontane dal cuore e clavicola (Figura 3A) del ratto.
8. Occlude il flusso di sangue attraverso l'arteria inserendo una coppia di pinze diritte punta fine sotto l'arteria (Figura 3B).
9. Usando i sottili forbici punta iris, posizionare una piccola incisione sulla superficie superiore dell'arteria (circa 1/3 delladiscesa dall'alto dell'area isolato). Lavare il sangue versato sulla superficie dell'arteria con soluzione salina eparinizzata e strofinare delicatamente con punte di cotone.
10. Inserire la punta della cannula nell'arteria con un paio di pinze punta ricurva. Una volta inserito, rimuovere le rette pinze punta fine occlusione del flusso sanguigno e far avanzare la cannula 2,5 centimetri nell'arteria utilizzando due coppie di pinze, una per tenere la cannula all'interno dell'arteria per fermare il sangue fuoriuscita indietro e l'altra per inserire la cannula.
11. Utilizzare un morsetto un'arteria per tenere la cannula all'interno dell'arteria e rimuovere le rette pinze punta fine che sono stati collocati sotto l'arteria nel passo 5.8 per occludere il flusso sanguigno.
12. Conferma la pervietà della cannula iniettando soluzione anticoagulante nella cannula e ritraendosi una piccola quantità di sangue (Figura 3C). Poi sciacquare la cannula con soluzione anticoagulante e sigillare l'estremità utilizzando la fiamma di un accendino o un plug cannula.
13. Tie the la cannula in posizione con due punti di sutura poste sotto l'arteria in fase 5.8.
14. Rimuovere il morsetto arteria e fissare una terza sutura intorno all'arteria e cannula. Chiudere il collo ferita con punti di sutura.

Periodo 6. post-chirurgica e Formulazione Infusion

1. Continuare a mantenere il ratto in anestesia e sul tappetino riscaldato.
2. Reidratare il ratto mediante infusione di soluzione reidratante nel duodeno per almeno 0,5 ore a seguito del completamento delle cannulazioni. Osservare la riduzione di flusso della linfa (~ 0,1 - 0,5 ml / h) durante il periodo iniziale dopo incannulamento e presto aumentare fino a una linea di base stabile (0,4-2,5 ml / h in base al tasso di reidratazione).
3. Dopo il periodo di recupero, infonda la formulazione di interesse (contenente lipidi, farmaci, ecc) nel duodeno attraverso la cannula. Facoltativamente, utilizzare una pompa di infusione per regolare la portata di formulazione. NOTA: Nel protocollo qui descritto gli animali rimangono ANAESthetised tutto il periodo chirurgia e raccolta linfa e sottoposti a eutanasia sotto anestesia tale che l'analgesia supplementare non è necessaria. Se il protocollo viene modificato e gli animali sono abilitati a riprendere conoscenza, è indipensabile analgesia adeguata e cure post-operatorie.
4. Al completamento della formulazione infusione continua per reidratare ratto a tasso di 1,5-3 ml / hr con soluzione fisiologica nel duodeno per prevenire la disidratazione.
5. Continuare a mantenere il topo sul pad chirurgica riscaldato 37 ° C per mantenere la temperatura (secondo step 2.3), urine espresso dalla vescica tramite gentile spingere verso il basso sul basso addome, come richiesto e riapplicare pomata oftalmica ogni ora (secondo step 2.2. 3). Regolari cambiamenti di posizione del corpo sono consigliate se l'animale è di riprendere conoscenza dopo la procedura.

7. Raccolta di linfa e di campioni di sangue per valutare Lipid e assorbimento del farmaco

1. Raccogliere linfa continuamente inprovette contenenti anti-coagulante. Modificare tubi in intervalli di tempo necessari (ad esempio, ogni ora).
2. Raccogliere campioni di sangue a intervalli di tempo insieme.
   1. Occlude il flusso di sangue attraverso la cannula piegando la cannula indietro di circa 2 cm dalla fine sigillata. Rompere il sigillo della cannula tagliando l'estremità sigillata o rimuovendo il tappo cannula.
   2. Utilizzando una siringa vuota, prelevare salina eparinizzata dalla cannula fino sangue riempie l'intera cannula.
   3. Usando una nuova siringa vuota, ritirare il volume desiderato di sangue e posto in una provetta contenente anticoagulante.
   4. Usando la prima siringa, sostituire il sangue prelevato prima del campionamento per ridurre la perdita di sangue inutili. Prima dell'iniezione, leggermente la siringa mentre si tiene in posizione verticale per garantire che bolle d'aria entrare nella cannula.
   5. Utilizzando una siringa, sostituire il volume di sangue prelevato dal ratto con soluzione anticoagulante. Assicurarsi che nessun sangue residuo è visibile nella cannula come qualsiasi residuo potrebbe coagularsie bloccare la cannula.
   6. Piegare la cannula circa 2 cm dalla fine non sigillata per bloccare il flusso di sangue e rimuovere la siringa. Utilizzando la fiamma di un accendino o un plug cannula, richiudere la cannula.
3. Al completamento del sangue e linfa raccolta dal ratto, eutanasia ratto mediante somministrazione intraperitoneale di> 100 mg / kg pentobarbitone sodio.
4. Determinare la portata linfatico misurando la massa di linfa raccolta durante ogni periodo di tempo.
5. Misurare la concentrazione di farmaco e lipidi in linfa e sangue utilizzando, per esempio, HPLC, HPLC-MS o usando kit commerciali, per valutare lipidico e l'assorbimento del farmaco efficienza.
6. Calcolare trasporto di massa di farmaco e lipidi nella linfa dal prodotto delle concentrazioni misurate e il volume della linfa raccolti.

Risultati

I risultati di un esperimento rappresentativo per quantificare la portata cumulativa e tasso di lipidi e di trasporto del farmaco attraverso il sistema linfatico seguente erogazione intestinale utilizzando il modello linfa cannulazione mesenterica sono mostrati in Figura 4 e Figura 5. In questo esperimento, 200 ug del modello lipofilo alofantrina farmaco è stato somministrato nel duodeno di ratti oltre 2 ore in una formulazione contenente 40 mg di acido oleico (compresi 2-5 uCi ^14...

Discussione

Il modello di ratto mesenterica linfa incannulamento consente la quantificazione diretta della concentrazione e la velocità di trasporto di varie cellule e molecole (come lipidi e farmaci) da l'intestino nella linfa e le modifiche a questi che si verificano in risposta a sfidare di varie sostanze (dieta , antigene, farmaci, formulazioni, ecc) ^10,27 e la malattia (cancro, virus, colite, insulino-resistenza, etc.) ^5-7. I componenti che sono raccolti nella linfa possono essere u...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sterile saline	Baxter healthcare	AHB 1307	Any brand can be used. Example here is Baxter 100 ml saline bags, box of 50
70 % ethanol in water	Any		Any brand can be used
Chlorhexidine gluconate solution (Microshield 4)	Livingstone International	JJ60243L	Any brand can be used. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =JJ60243L
Betadine solution	Livingstone International	BU0510	Any brand can be used. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =BU0510
Ilium Ketamil (Ketamine 100 mg/ml)	PROVET VICTORIA	KETA I 1	http://www.provet.com.au/
Ilium Xylazil (Xylazine 100 mg/ml)	PROVET VICTORIA	TRO-3828	http://www.provet.com.au/
ACP 10 Injection (Acepromazine 10 mg/ml)	PROVET VICTORIA	VTG-DACP010020	http://www.provet.com.au/
Sodium pentobarbitone	PROVET VICTORIA	24529	Any brand can be used. Example here is Lethabarb® 325 mg/ml sodium pentobarbitone, Virbac Animal Health. http://www.provet.com.au
Heparin (35000I.U. in 35 mL)	Sigma Pharmaceuticals	337220	http://sigmaco.com.au/
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate	Sigma-Aldrich	E1644	Any brand can be used. Example here is disodium salt of EDTA from Sigma.
Polyethylene (PE) cannula o.d. 0.96 mm x i.d. 0.58 mm	Microtube extensions	PE8050	Any brand can be used. Example here is PE tubing 0.8x0.5 mm, 30 m
Polyethylene (PE) cannula o.d. 0.8 mm x i.d. 0.5 mm	Microtube extensions	PE9658	Any brand can be used. Example here is PE tubing 0.96x0.58 mm, 30 m
Ruler	Any		Any brand can be used
Markers	Any		Any brand can be used
Cigarette lighter	Any		Any brand can be used
Cyanoacrylate glue	Any		Any brand can be used
23 gauge needles	Livingstone International	DN23GX0.75LV	Any brand can be used. Example here is Livingstone Disposable Needle, Sterile, 23GX0.75inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT= 6&search=DN23GX0.75LV
25 gauge needles	Livingstone International	DN25GX1.0LV	Any brand can be used. Example here is Livingstone Disposable Needle, Sterile, 25GX1.0inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search= DN25GX1.0LV
1 ml syringe	Livingstone International	T3SS01TA	Any brand can be used. Example here is Terumo syringe 1 ml Slip Tuberculin 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =T3SS01TA
10 ml syringe	Livingstone International	T3SS10SA	Any brand can be used. Example here is Terumo syringe 10 ml Slip 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =T3SS10SA
Gauze swabs	Livingstone International	GSC075	Any brand can be used and cut to required size. Example here is gauze swabs cotton filled 7.5x7.5 cm, 8 ply. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =GSC075
Cotton buds	Livingstone International	CTAST075DP	Any brand can be used. Example here is Livingstone cotton applicator plastic double tipped. 75MM. 100/PK. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =CTAST075DP
Heating pad	Ratek	WT1	Any brand that keeps temperature at 37C can be used. Example here is Ratek warming tray.
Surgical light	Harvard Apparatus	72-0215 with 72-0267	Any brand can be used. Example here is Harvard apparatus V-Lux 1000 Cold Light Source with Bifurcated Gooseneck Light Guide, Black, 4.7 mm fiber diameter (each arm). http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_50601_ -1_HAI_ProductDetail and  http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_35487_ -1_HAI_ProductDetail___
Surgical microscope	Zeiss	495005-0014-000	Any brand can be used. Example here is Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000-C with Stand S Double Spot and KL 300 LED. https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=e&i=10143
Silk suture	Livingstone International	DTSK163019F4	Any brand can be used. Example here is *  Email this item to my friend 3/8 Circle Reverse Cut Silk Suture 3/0 Thread 19mm. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =DTSK163019F4
Scalpel blades	Fine Science Tools (FST)	10020-00	Any brand can be used. Example here is FST Scalpel Blade #20. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=191
Scalpel handle	Fine Science Tools (FST)	10004-13	Any brand can be used. Example here is FST Scalpel Handle #4. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=298&CategoryId=51
1 x Small surgical scissors	Fine Science Tools (FST)	14060-09	Any brand can be used. Example here is FST Fine Scissors, 9 cm with 21 mm cutting edge, sharp, straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=40&CategoryId=17
2 x Forceps with serrated curved tip	Fine Science Tools (FST)	11001-13	Any brand can be used. Example here is FST 13 cm standard pattern forceps with curved 2.8x1.4 mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=405&CategoryId=32
1 x Iridectomy scissors	Fine Science Tools (FST)	15000-08	Any brand can be used. Example here is FST Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge, Straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=17&CategoryId=16
1 x Forceps with straight serated tip	Fine Science Tools (FST)	11650-10	Any brand can be used. Example here is FST Graefe 10 cm straight with serrated 1 x 0.99 mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=390&CategoryId=32
1 x Forceps with smooth sharp straight fine tip	Fine Science Tools (FST)	11251-10	Any brand can be used. Example here is FST Dumont #5 forceps straight 11cm with 0.08 x 0.04mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=335&CategoryId=29
1 x Forceps with smooth fine curved forceps	Fine Science Tools (FST)	11063-07	Any brand can be used. Example here is FST Delicate Forceps 9 cm with smooth 0.4 x 0.3mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=360
2 x Hemostats	Fine Science Tools (FST)	13010-12	Any brand can be used. Not all operators use the hemostats. Example here is FST 12 cm Micro-Mosquito Hemostats with 20 mm length x 1.3 mm width serrated, straight tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=377&CategoryId=33
1 x Suture needle holder	Fine Science Tools (FST)	12001-13	Any brand can be used. Example here is FST 13cm Hasley Needle Holder with 16 mm length x 1.9 mm width tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=254&CategoryId=70
1 x Artery clamp	Fine Science Tools (FST)	18050-28	Any brand can be used. Example here is FST Bulldog Serrefines straight, 28 mm long, 9x1.6 mm jaw dimension with medium clamp press. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=270&CategoryId=82
Oleic acid	Sigma Aldrich	O1008	When required, any brand can be used. Example here is 99% pure oleic acid. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/o1008?lang=en&region=AU
14C-oleic acid	Perkin	NEC317050UC	Any brand can be used. Example here is Oleic Acid, [1-14C]-, 50µCi (1.85MBq). http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/NEC317050UC
Sodium taurocholate	Sigma Aldrich	T4009	Any brand can be used. Example here is taurocholic acid sodium salt hydrate ≥95% (TLC) . http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4009?lang=en&region=AU
Halofantrine	Glaxo Smith Kline		Halofantrine was kindly provided as a gift from Glaxo Smith Kline
Sodium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	71507	Any brand can be used. Example here is sodium phosphate monobasic monohydrate, BioXtra, for molecular biology, >99.5%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71643?lang=en&region=AU
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	71643	Any brand can be used. Example here is sodium phosphate dibasic dihydrate, BioUltra, for molecular biology, >99%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71507?lang=en&region=AU