לימפה Duct cannulated עכברוש דגם mesenteric: בקשה להערכה של המעיים הלימפה תרופות תחבורה

Summary

Here we describe a technique to cannulate the mesenteric lymph duct in rats which enables quantification of lipid and drug transport via the lymphatic system following intestinal delivery. The technique can be adapted to assess mesenteric lymph concentrations and/or transport of fluid, immune cells, peptides, proteins and lipophilic molecules.

Abstract

מערכת הלימפה המעיים משחקת תפקידי מפתח בהובלת נוזלים, קליטת שומנים ותפקוד מערכת חיסון. הלימפה זורמת ישירות למעי הדק באמצעות סדרה של כלי הלימפה ובלוטות שיתכנסו לצינור לימפה mesenteric מעולה. Cannulation של הצינור לימפה mesenteric כך מאפשר האיסוף של הלימפה mesenteric זורמת מהמעי. לימפה mesenteric מורכבת מחלק תאי של תאי מערכת חיסון (לימפוציטים 99%), חלק המימי (נוזל, פפטידים וחלבונים כגון ציטוקינים והורמוני בטן) וחלק קטן ליפופרוטאין (שומנים, מולקולות lipophilic וapo-חלבונים). מודל cannulation הצינור לימפה mesenteric לכן יכול לשמש למדידת הריכוז ושיעור התחבורה של מגוון רחב של גורמים מהמעי באמצעות מערכת הלימפה. שינויים בגורמים אלה בתגובה לאתגרים שונים (לדוגמא, דיאטות, אנטיגנים, סמים) ובמחלה (למשל, מחלת מעי דלקתית, HIV, סוכרת) יכולה גם סעיף ב 'דואר נקבע. אזור של הרחבת עניין תפקידה של תחבורת הלימפה בספיגה של תרופות אוראליות lipophilic וprodrugs שמקשרות עם מסלולי קליטת שומנים במעי. כאן אנו מתארים, בפירוט, מודל חולדה cannulated צינור לימפה mesenteric המאפשר הערכה של השיעור ושל שומנים בדם ותחבורה סמים המידה באמצעות מערכת הלימפה במשך כמה שעות לאחר לידה במערכת העיכול. השיטה היא להתאמה בקלות למדידת פרמטרים אחרים לימפה. אנו מספקים תיאורים מפורטים של הקשיים שעלולים להיוצר בעת הקמת שיטה כירורגית מורכבת זו, כמו גם נתוני נציג מניסויים כושלים ומוצלחים כדי לספק הדרכה על איך לאשר הצלחת ניסוי ולפרש את הנתונים שהתקבלו.

Introduction

הלימפה זורמת מהמעי הדק באמצעות תהליך חד-כיווני שמקורו בlacteals היחיד שנמצאים בתוך כל אחד villi מעיים הקטן ^1. Lacteals יחסית חדירים לנוזלים, מקרו-מולקולות ותאים והיווצרות הלימפה ובכך מתחיל עם כנסתם של הגורמים הללו בlacteals. לימפה הראשונית בlacteals זורמת לאחר מכן מהמעי באמצעות רשת של microvessels הלימפה, איסוף (מביא) כלי הלימפה, סדרה של בלוטות לימפה mesenteric וסופו של דבר כלי הלימפה הודעה קטרי (efferent). בתוך צמתים, הלימפה עוברת דרך סדרה של הסינוסים לשדיים בי חילופי מתרחש בתאי תושב צומת חיסוניים וכן כחומר הזנת הצומת מהדם. כל הלימפה זורמת מהמעי הדק מתכנסת סופו של דבר לצינור לימפה mesenteric מעולה efferent ולאחר מכן ציסטרנה כילי. ציסטרנה כילי גם אוספת לימפה ניקוז הרקמות היקפי הזנב, intestINAL, אזורים וכבדים והמותני מצטרף הצינור לימפה בבית החזה יחד עם הלימפה מחלל החזה וחלקי גולגולת של הגוף. הצינור לימפה בבית החזה מרוקן הלימפה ישירות למערכת הוורידים בצומת של ורידי הצוואר וsubclavian הפנימיים השמאלי. הפרוטוקול המתואר כאן, המאפשר לאוסף של הלימפה ישירות מהצינור לימפה mesenteric מעולה, ובכך מקל על הניתוח של גורמים שונים העוברים ישירות מהמעי למחזור הדם המערכתי (הכללי) באמצעות מערכת הלימפה המעיים.

הפונקציות הפיזיולוגיות הגדולות שהוקצו למערכת הלימפה המעיים הן לשמור על מאזן נוזלים, כדי להקל על שומנים בדם וקליטת מולקולת lipophilic, ולאפשר לתגובות חיסוניים מתאימות ^1. תאי גידול ווירוסים גם להפיץ באמצעות lymphatics המעיים ^2-4 ומפתח שינויים להתרחש בתוך lymphatics בכמה פתולוגיות דלקתיות וחילוף חומרים ^5-7. יכולnulation של הצינור לימפה mesenteric לאסוף הלימפה בתוך לפדר מאפשר ניתוח של זרימת נוזל בתפזורת באמצעות lymphatics המעיים כמו גם כימות של שיעור הריכוז והובלה של תאים ומולקולות שונים. שינויים בריכוז או המעבר של גורמים אלה בתגובה לאתגרים שונים (לדוגמא, דיאטות, אנטיגנים, סמים) ובמודלי מחלה (למשל, דלקת המעי הגס, HIV, סוכרת) יכול גם להיות מוערכת. בעוד שזה אי אפשר לתאר כל רכיב לימפה שניתן לנתח ולהשוות כאן בהרחבה, לימפה mesenteric פשטנית מורכבת ממימי, שומנים בדם ושלבים סלולריים. רכיבים של עניין בשלב המימי כוללים פפטידים וחלבונים כגון אנטיגנים או tolerogens ^8, שליחים חיסוניים כגון ציטוקינים ותא פיטום מתווכים ^9, ומתווכי חילוף חומרים כגון incretins ^10. החלק הסלולרי של הלימפה mesenteric פוסט-קטרי מורכב כמעט כולו (מעל 99%) של lymphocytes ^11. תאים חיסוניים שונים (תאים דנדריטיים, תאי פיטום, וכו ') להיכנס לlymphatics mesenteric מראש קטרי אבל להישאר בצומת ^12. אם התאים בתוך הלימפה מביא הם עניין, ניתן לאסוף תאים אלה באמצעות הסרת הלימפה mesenteric צומת כמה ימים לפני cannulation של הצינור לימפה mesenteric ^12. בדרך זו צינוריות הלימפה מביא וefferent מחוברות ישירות ותאי הלימפה בהלימפה מביא לעבור ישירות לתוך הצינור לימפה mesenteric. כך ניתן לבחון את המעבר והפנוטיפ של תאי חיסון שונים עוברים דרך lymphatics המעיים. אולי הסיבה השכיחה ביותר שצוינה עבור איסוף הלימפה mesenteric עד כה, עם זאת, היא ללמוד את העיבוד, קליטה והובלה של שומנים בתזונה ובמולקולות lipophilic ¹⁰ מעיים.

בעקבות בליעה, שומנים תזונתיים מתעכלים (למשל, מהטריגליצרידים לחומצות שומן ומונוגליצריד, phospholipid לחומצות שומן וlysophospholipid, ואסתר כולסטרול לחומצות שומן וכולסטרול, וכו ') והתפזרו בתוך חלל המעי לmicelle קטנה ומבני לפוחי באמצעות התוספת של amphiphiles ממרה (פוספוליפידים, מלחי מרה וכולסטרול) והפעולה של אנזימי לבלב ^10,13. מכאן שהם נספגים לתוך enterocytes. חלקם של הרכיבים נספגים מחדש אסטרי ליצירת הטריגליצרידים, פוספוליפידים ואסטרים כולסטרול בתוך תאי הקליטה (enterocytes). שומנים-אסטרי מחדש אלה מורכבים משילוב של מרכיבים שומניים אקסוגני בלע ומרכיבים שומניים אנדוגני מהמרה המופרשת, בריכות שומנים ריריות או אספקת הדם במעיים ^13. מכאן שומני אסטרי מאוחסנים או בתוך enterocytes או התאספו לתוך יפופרוטאינים מעיים (chylomicrons, ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה מאוד (VLDL)) יחד עם apoproteins השונים ומולקולות lipophilic אחרות ( למשל, ויטמינים) ^10,13. לאחר יציאת enterocytes, ליפופרוטאין באופן ספציפי מועבר מהמעי למחזור המערכתי באמצעות מערכת הלימפה mesenteric כlacteals המעיים הם יותר חדיר לכניסתם מנימי הדם במעיים. חלקם של מרכיבים שומניים נספגים גם מועבר מהמעי למחזור המערכתי באמצעות נימי הדם ווריד שער כלא-lipoprotein היחיד, קשורים, מולקולות ^14. באופן כללי, לעומת זאת, מסלול תחבורת וריד השער הוא שחקן משמעותי היחיד בקליטת שומני אורך שרשרת קצרים ובינוניים.

האוסף של הלימפה mesenteric כך מאפשר ההערכה של התחבורה של ליפופרוטאין וברכיבים נלווים (שומנים, מולקולות lipophilic, apo-חלבונים) מהמעי. ניתן ונרשמת ליפופרוטאינים ומתאפיינים ביתרון שיפופרוטאינים לימפה mesenteric, באופן כללי, נמצאים בnascenמדינה לא מכיוון שהם לא שונו באופן נרחב על ידי אנזימים מערכתיים כגון lipase ליפופרוטאין ^15. בעוד מודל החולדה cannulated הלימפה mesenteric יש אולי מבחינה היסטורית תואר בצורה נרחבת ביותר לניתוח תחבורת השומנים / ליפופרוטאין מהמעי, על שטח של הרחבת העניין הוא התפקיד של lymphatics בהובלה של תרופות lipophilic, prodrugs וxenobiotics האחר ^13,16 המהווה את המוקד של המודל שתואר כאן. תרופות lipophilic (בדרך כלל אלה עם P יומן> 5 ומסיסות בהטריגליצרידים> 50 מ"ג / g ארוכת שרשרת למרות שהיוצאים מן הכלל לכאורה) ^17,18, prodrugs ¹⁹ וxenobiotics האחר ^13,16 יכולים לקבל גישה לlymphatics המעיים או באופן פסיבי או על ידי פעיל להשתלב במסלולי תחבורה ליפופרוטאין במעיים ^19.

טכניקת cannulation הלימפה mesenteric העכברוש לכן יש יישומים רבים. Bollman et al. תאר techniq הראשוןue לcannulate הצינור לימפה mesenteric בחולדות בשנת 1948 ^20. מאז מספר הווריאציות על המודל שתואר. לדוגמא, אוסף יכול להתרחש כאשר החולדה מורדמת עם הרדמה שונות ^21,22, או במדינה המודעת תוך מאופק ¹⁵ או באופן חופשי לנוע ^23,24. יכולות להינתן חולדות פתרונות להחזרה נוזלים שונים וחומרים אחרים כגון שומנים וניסוחי סמים בשיעורים שונים לקיבה, המעי או parenterally (בדרך כלל 0-5 מיליליטר / hr) ^25. בחלק ממחקרי הצינור לימפה בבית החזה ולא דביקה לימפה mesenteric הוא cannulated להעריך הובלה מהמעי באמצעות lymphatics אם כי זה עשוי להפריז בהערכת מעבר מהמעי הדק, תלוי בגורם של עניין, כצינור לימפה בבית החזה גם מקבל הלימפה מאחרת אזורי ^22,26. מודלים cannulation הלימפה גם תוארו בכמה מינים אחרים, כוללים עכברים ^15,27, מיני-pi¹² GS, הכבשים ^{28,29, 30} חזירים וכלבים ^31. עם זאת, מודל החולדה הוא נרחב ועקבי ביותר שצוטט. פרוטוקולים מפורטים לcannulation של הצינור לימפה mesenteric אחריה אוסף של הלימפה במודעת או ²⁵ מורדמים ²² חולדות ועכברים ^15,27 כבר פורסמו בעבר והקורא המעוניין מופנה לפרוטוקולים אלה. פרוטוקול זה הוא ראשון כדי להדגים את הטכניקה בפורמט דמיין.

יש מודל העכברים לימפה cannulated יתרונות על פני מודלים של בעלי חיים גדולים יותר במונחים של הוצאה, את הקלות של הניתוח ושיקולים אתיים. בהשוואה למודל של העכברים, ניתוח cannulation לימפה mesenteric הוא גם קל יותר בחולדה למרות מודל העכבר מאפשר מחקרים מפורטים יותר בבעלי חיים מהונדסים ^27. יחד עם זאת, יש כמה מגבלות מודל החולדה, במיוחד אלה הקשורים להבדלים בפיזיולוגיה, שextrapolat הגבוליון למצבים פרה-קליניים וקליניים אחרים. לדוגמא, בזרימת המרה החולדה הוא קבוע ובלתי תלוי של צריכת מזון ואילו במזון מינים גבוה או שומנים לעורר את זרימת מרה ^32. זה יוצר אתגרים להשגת סביבות לפני ואחרי ארוחת נציג בחולדה שמשקפות את מה שראה במינים ובני אדם גדולים יותר. ללימודי משלוח סמים, מין גדול יותר יכול להיות גם העדיף בעת הערכת תחבורת הלימפה לאחר שהממשל של מינון אנושי מציאותי מהווה ^25. במחקר שנערך לאחרונה, שיעורי תחבורת שומנים בהלימפה mesenteric נמצאו דומה בין מינים (עכבר, חולדה, כלב) לאחר מתן של מסה שווה ערך וסוג של שומנים בדם המספק קצת ביטחון באקסטרפולציה של נתונים תחבורת שומנים על פני מינים ^27. עם זאת, ההובלה של מודל lipophilic סמים, halofantrine, מדורגת לפי סדר הגודל של בעלי חיים (כלומר, כלב> חולדה> עכבר). גורם קנה מידה ניתן אפוא נדרש לשעברtrapolate נתוני תחבורת סמים הלימפה מחולדה למינים אחרים.

הגבלה של דגמי cannulation לימפה, באופן כללי, היא שאוסף פסיבי הלימפה ישירות מצינור הלימפה רשאי לשנות זרימת הלימפה ותחבורה מאז כלי הלימפה לעבוד נגד פרש לחצים שמשתנה ברגע שהספינה היא cannulated ^33. מודל cannulation הלימפה יכול להיות גם קשה לקבוע במעבדות שאינן מכיר את הטכניקה. מודלים חלופיים וכך תוארו. לדוגמא, המעבר של גורמים באמצעות מערכת הלימפה המעיים, כגון יפופרוטאינים ומולקולות lipophilic, נחקר באופן עקיף באמצעות אוסף של דם. מודל כזה כרוך השוואת ריכוזי שומנים ו / או סמים דם לאחר נטילה דרך פה בנוכחות והיעדרות של מעכבים (למשל, קולכיצין, pluronic L81, cycloheximide) של ייצור ליפופרוטאין במעיים, החוסמים תחבורת הלימפה ^34. יתרוןדגמים שלכמת תחבורת הלימפה בעקיפין באמצעות איסוף דגימות דם הוא שהיא מאפשרת כמה הערכה של תחבורת הלימפה בבני אדם כניתוח פולשני לא נדרש ^35. עם זאת, מעכבי תחבורת הלימפה אינם ספציפיים וגורמים המועברים באמצעות lymphatics הם בדילול ושינוי במחזור המערכתי אשר מסבך הערכות אלה. חלופות במבחנה גם תוארו. לדוגמא, תרבויות קאקו-2 תאים או אנתרוציט המבודדת כבר נוצלו כדי ללמוד ביתר פירוט את הפרשת המעיים של מולקולות שנכנסות lymphatics ^36-38. מודל במבחנה מתקדם שמייצגים יותר ממייקרו-סביבת המעיים האנושי גם תאר לאחרונה את ^39. במודל זה שכבת תאי האנדותל הלימפה היא שיתוף תרבותי עם קאקו-2 תאים המאפשרים ניתוח מפורט יותר של העברת חומרים מהמעי לlymphatics. עם זאת, בvitro מערכות תא חסרות זרימת חליפין ולהעביר כלומר חיבור עם חלל מעי ודם בסיסי ואספקת דם לימפטי. בגישה חלופית, קסיס et al. הוקם ערוץ כפול (וידאו במהירות גבוהה בהיר שדה וקרינה) במערכת הדמיה באתר המאפשרת השוואות כמותיות בין התכווצות כלי דם, זרימת הלימפה וריכוזי שומנים ניאון בכלי הלימפה mesenteric ^33. יתרון של מודל זה על האמור במערכות חוץ גופית הוא שזה מאפשר מעקב מדויק של המעבר של תאי מערכת חיסון באמצעות lymphatics. מדידות מוחלטות של שומנים בדם המוניים (או סמים) תחבורה, לעומת זאת, עדיין לא הוקמו תוך שימוש בשיטות הדמיה. במבחנה ובסיליקון ומתקרבים לחזות באופן ספציפי את היקף תחבורת סמים lipophilic באמצעות lymphatics המעיים פורסמו גם ^40-42. לדוגמא, את הזיקה vivo לשעבר של מספר גompounds לchylomicrons פלזמה נמצא לתאם בצורה סבירה עם תחבורת הלימפה שלהם in vivo ^41. בהמשך לכך, אותה הקבוצה שהוקמה במודל סיליקו לחזות זיקת תרופה לchylomicrons מבוסס על מאפייני physicochemical מרובים ^40. Holm et al. גם הוקם מורכב יחסית במודל סיליקו לחזות הסף תחבורת הלימפה של תרכובות lipophilic על בסיס מתארים מולקולריים ^42. מודלים אלה עשויים לספק גישה שימושית לחזות את היקף תחבורת הלימפה של תרופות לא ידועות. אימות של המודלים עם מגוון רחב של תרופות ועל פני מעבדות שונות, עם זאת, תידרש לאשר את הדיוק ושחזורם.

Cannulation של הצינור לימפה mesenteric כך נשאר רק האמצעי כדי לבחון את התוכן של ימפה ניקוז המעי הדק ושיעור המעבר של המערך המורכב של גורמים (תאים, חלבונים ישירות,פפטידים, שומנים, תרופות) לימפה במצב in vivo. במסמך זה אנו מתארים פרוטוקול לcannulation של עורק התרדמה והצינור לימפה mesenteric שמאפשר האיסוף של הלימפה mesenteric ודם מערכתי מחולדות מורדמות. נציגי נתונים להדגים כיצד המודל יכול לשמש כדי לבחון שומנים ותחבורה סמים מהמעי דרך מערכת הלימפה mesenteric. זה ואחריו דיון בקשיים שניתן נתקלו בהקמת המודל ומדריך לפתרון בעיות. ברגע שהקים את המודל הוא כלי רב עוצמה כדי לחקור תחבורת הלימפה מעיים.

Protocol

המחקרים שתוארו בכתב היד הזה אושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים המקומיות ונערכו בהתאם למועצת אוסטרליה וניו זילנד לטיפול בבעלי חיים בהנחיות מחקר והוראה. לפני תחילת כל הליך של בעלי חיים, להבטיח כי את ההרשאה המתאימה מתקבלת באמצעות מוסד / הארגון המקומי. כמו בכל הניתוחים בבעלי החיים, להבטיח שהניתוח מבוצע על ידי מפעילי הכשרה מתאימה, בתנאים אספטיים וכי הרדמה, משככי כאבים ואנטיביוטיקה מנוהלים כאשר נדרשים על מנת להבטיח תוצאה אתית ומוצלחת.

1. הכנות היום לפני ההליך כירורגי

1. לצום העכברוש בלילה שלפני הניתוח במידת הצורך. יש להבטיח את עכברוש גישה חופשית למים.
2. הפתרונות להכין להינתן לחולדה.
   1. הכן פתרון להחזרת נוזלים כגון תמיסת מלח סטרילית או פתרון Ringers.
   2. הכןפתרונות אסתטיים כנדרש. ההרדמה המשמשת בניסויים שתוארו כאן כללה "קוקטייל 1" שהוכן על ידי שילוב של 1.9 מיליליטר של קטמין 100 מ"ג / מיליליטר, 0.5 מיליליטר של Xylazine מ"ג 100 / מיליליטר, 0.2 מיליליטר של acepromazine 10 מ"ג / מיליליטר ו 2.5 מיליליטר של תמיסת מלח ו" קוקטייל 2 "בהיקף של 1 מיליליטר של קטמין 100 מ"ג / מיליליטר ו 0.1 מיליליטר acepromazine 10 מ"ג / מיליליטר. הערה: isoflurane בשאיפה או sevoflurane עשוי להיות מועדף כפי שהוא יכול לספק מטוס של הרדמה כירורגית לתקופה ארוכה יותר של זמן.
   3. לחלופין להכין ניסוח המכיל את התרופה ב, למשל, תחליב שומנים. לבצע מחקרי יציבות מתאימים כדי להבטיח את היציבות של הניסוח על פני תקופת האחסון וניהול.
      הערה: הטבע של הניסוח והתרופה המדויק ללהינתן תשתנה עם כל מחקר כמטרת מחקרי תחבורת סמים הלימפה היא לרוב כדי להעריך את היעילות של תחבורת סמים הלימפה כפונקציה של admini הניסוח והסמיםstered.
      1. הניסוח מנוצל בניסויי הנציג באיור 4 ו -5 כאן מוכן, כפי שתואר לעיל ^43. בקצרה, לשלב ¹⁴ חומצה אולאית C (2-5 μCi) וhalofantrine (200 מיקרוגרם) לחומצה אולאית 40 מ"ג לפני פיזור ב5.6 מיליליטר של שלב מימי בהיקף של taurocholate נתרן 5 מ"מ בופר פוספט (pH 6.9).
      2. לניסוחים המכילים 2-monoolein, להוסיף 7.1 מ"ג של 2-monoolein יחד עם רכיבים אחרים, לשלב המימי באותו הזמן כhalofantrine שלב המכיל חומצה אולאית. הכן את הניסוחים המכילים 2-monoolein מייד לפני ממשל לחולדה כ2-monoolein אינה יציב יחסית וisomerises ל1-monoolein.
      3. בהמשך לכך חלב את הניסוחים ידי ultrasonication 2 דקות בRT.
         הערה: כפי שכבר תיארו בעבר ^43, לפקח על היציבות של הניסוחים ידי i) בדיקה ויזואלית של emulשיאון תחת אור המקוטב על מנת להבטיח כי התחליב אינו שלב מופרד, ii) גודל חלקיקי ניתוח מייד לאחר ההכנה והבאה מינון באמצעות פיזור אור דינאמי כדי לספק אינדיקציה על כל שינויים בשלב ו / או הפרדה, וiii) ניתוח של ריכוזי halofantrine באמצעות assay HPLC תוקף.
3. הכן פתרון נוגד קרישה המכיל 10 מ"ג / מיליליטר EDTA במים סטריליים או 10 IU / ml הפרין במלח כדי לשטוף את הצינורית לימפה. כמו כן להכין פתרון נוגד קרישה המכיל 2.5-10 IU הפרין מיליליטר / במלח כדי לשטוף את צינורית העורק הראשי.
4. הכן את קנולות פוליאתילן להכנסה לתוך צינור הלימפה mesenteric (OD 0.8 מ"מ, 0.5 מ"מ ID), עורק התרדמה (OD 0.96 מ"מ, 0.58 OD מזהה מ"מ או 0.8 מ"מ, מזהה 0.5 מ"מ) והתריסריון (OD 0.96 מ"מ, 0.58 מ"מ ID )
   1. חותך את קנולות לאורך הנדרש (בדרך כלל 25 - 30 סנטימטר לעורק הראשי וצינורית התריסריון ו10-15 סנטימטר לCann הלימפהאולא) והמקום שפוע בקצה קנולות באמצעות סכין כירורגית סטרילי (ראה איור 1).
      הערה: זה מגדיל את הקלות של הכנסת צינורית ומפחית את השכיחות של חסימת צינורית לאחר החדרה.
   2. הנח נקודת עוגן צורת J בצינורית intraduodenal ידי לולאות חלק קטן של הצינורית חזרה על עצמה, מחמם אותו עם צלחת קלה או חמה ולאחר מכן חיתוך לגודל (ראה איור 1).
5. צרף את צינורית הלימפה למחט 25 G ומזרק המכיל פתרון נוגד קרישה (מוכן בשלב 1.3). מלא את הצינורית לימפה עם הפתרון נוגד קרישה ולהשאיר את הפתרון בO הצינורית / N כדי להפחית את השכיחות של היווצרות קריש דם בצינורית הלימפה במהלך איסוף הלימפה.
6. הכן צינורות לאיסוף לימפה ודגימת דם. טרום לשקול צינורות איסוף הלימפה, צינורות תווית לאוסף הלימפה ודגימת דם ולהוסיף פתרון נוגד קרישה. להוסיף solut נוגד קרישה המספיקיון כדי להשיג ריכוז סופי של 1 מ"ג / מיליליטר EDTA במים סטריליים או 10 - 20 IU / ml הפרין בהלימפה או דם שנאסף.

2. תכשירים מייד לפני תחילת ההליך הכירורגי

1. סמנו את כל קנולות על ידי שטיפה עם תמיסת מלח סטרילית או פתרון נוגד קרישה על מנת להבטיח שהם פטנט.
2. הכן את העכברוש להליך כירורגי.
   הערה: הצינור לימפה mesenteric הוא גלוי יותר בחולדות שאכלו או היה להזריק מנה של שמן כהלימפה mesenteric הופכת חלבית ואטומה עם טעינת שומנים גבוהה יותר. מפעילים מסוימים, במיוחד אלה חדשים לניתוח, ולכן קלים יותר לcannulate הצינור לימפה mesenteric כאשר חולדות הם מראש במינון-עם שמן (סביב 0.1-1 מיליליטר) כגון זית או סויה שמן 0.5-2 שעות לפני ניתוח החל . עם זאת, לפני מינון הנפט משפיע על תחבורת הלימפה של שומנים, תרופות lipophilic וגורמים אחרים בהלימפה כך שזה לא יכול להיות אידיאלי מראש מנת שמןבהתאם למטרת הניסוי.
   1. להרדים את העכברוש בכל תקופת איסוף הניתוח ודגימה.
      1. לדוגמא, ליזום ההרדמה באמצעות הזרקה תת עורית של 1.5 מיליליטר / קילוגרם של קוקטייל אני (מצעד 1.2.2) לקפל עור בחלק האחורי של צוואר החולדות באמצעות מזרק 1 מיליליטר מצורף מחט 25 G. לשמור על ההרדמה באמצעות הזרקת intraperitoneal של 0.44 מיליליטר / קילוגרם של קוקטייל 2 (מצעד 1.2.2) כ כל שעה כנדרש, באמצעות מזרק 1 מיליליטר מצורף מחט 25 G.
      2. לפני תחילת הניתוח להבטיח שעומק ההרדמה מספיק על ידי התבוננות קצב נשימה, תנועת זיף, טונוס שרירים ותגובות לגירויים כגון צביטה של ​​רגל. לנהל הרדמה נוספת כנדרש.
   2. לגלח את הפרווה מאזורי כירורגים, הכוללים את צד ימין של הבטן לימפה וcannulation תריסריון, וצוואר ואזור עצם הבריח יצא לצינורית עורק התרדמהtion.
   3. נקה את האזורים כירורגית סביבה נקיה מחיידקים באמצעות פתרון פתרון או chlorhexidine povidine-יוד ולשפשף אתנול 70%. חזור 3 פעמים עבור כל אזור, שסיימתי עם טיהור סופית עם אתנול 70%.
3. מניחים את החיה בrecumbence גב בסדין נקי מעל משטח מחומם כירורגית (37 ° C).

3. Cannulation של mesenteric לימפה Duct

1. מניחים את החיה עם הצד הימני שלה פונה כלפי המפעיל. לבצע את הניתוח עם או בלי הסיוע של מיקרוסקופ כירורגי כפי שנדרש.
2. פתח את השכבה העליונה של קיר השרירים הבטן עם חתך 4 סנטימטר ישר משתרע מקו האמצע (תהליך xyphoid) לאגף הימני של כ -2 סנטימטרים מתחת לבית החזה (שולי costal) באמצעות סכין אזמל סטרילי (ראה איור 2).
3. פתח את השכבות הנותרות של קיר שרירים בטן 4-5 מ"מ לרוחב קו האמצע למסירת מאגף ימין עם זוג קטןשל מספריים כירורגיות (ראה איור 2).
4. לחזור בו מהמעי הדק מתחת לקיר שרירי הבטן השמאלי ולשמור אותו במקום באמצעות 2-3 חתיכות של גזה סטרילית רוויות עם מלח רגיל.
5. לגשר על העכברוש על מזרק פלסטיק 10 מיליליטר בצורה אופקי מתחת לגבו של העכברוש ברמה של כליה ימנית כדי להקל הדמיה של הצינור לימפה mesenteric.
6. אתר את הצינור מעולה mesenteric לימפה: כלי כ 0.5-1 מ"מ בקוטר שניצבת לכליה הימנית ומייד מקורי ומקביל לעורק mesenteric (כלי דם אדום כהים פועמים; ראה איור 2 ג).
   הערה: בחולדות מראש במינון-לא-צמו או שמן הכלי לבן, אטום וקל יותר לדמיין מאשר בחולדות צמו בו היא די שקוף.
7. בדוק את האזור מייד הזנב לצינור הגדול מעולה mesenteric הלימפה ועורק mesenteric כדי לקבוע אם צינור שני, קטן יותר אבזר לימפה הואהווה. אם קיימים, לחסום את זרימת הלימפה דרך הצינור על ידי ניתוק הצינור וחוסם עם דבק מגע, או קשירת תפר סביב הצינור, על מנת להבטיח כי כל הנפח של הלימפה זורמת מהמעי נאסף מהצינור לימפה mesenteric מעולה.
8. עובר זוג מלקחיים ישר דרך מיטת שומן פרי כליות בשוליים התחתונים של הכליה הימנית, ודרך שכבות רקמת חיבור באופן מיידי מתחת לווריד הנבוב, במקביל כיוון עם הצינור לימפה mesenteric מעולה.
9. באמצעות הקצה של המלקחיים לאחוז את צינורית הלימפה ולמשוך אותו דרך מיטת שומן פרי כליות עם קצה אחד מייד בסמוך לצינור לימפה mesenteric והאחר exteriorised מהחיה ברמה של הכליה הימנית.
10. לבודד את הצינור לימפה mesenteric ממעל השכבות של רקמת חיבור ושומן על ידי נתיחה בוטה. הקפד לא לנקב או לפגוע בצינור לימפה.
11. לאחר בידוד הצינור לימפה, לעשות הו קטןle בצינור לימפה גם עם מיקרו מספריים, הקצה החד של המלקחיים של צורף או מחט 25 G. הקפד לא לנתק את הכלי לחלוטין.
12. ודא שצינורית הלימפה היא מלאה לחלוטין עם פתרון נוגד קרישה (באמצעות מזרק ומחט 25 G) ללא פערי אוויר. הכנס את הצינורית לימפה כ 2-4 מ"מ בתוך הצינור לימפה mesenteric באמצעות החור הקטן בעזרת זוג קטן של מלקחיים.
13. שים לב לצינורית הלימפה במשך כמה דקות. שים לב זרימה הדרגתית של ימפה במעי מסוף האיסוף החופשי של הצינורית אם cannulation הוא מוצלח. אם cannulation הוא לא מוצלח, חזור על שלבים 3.8-3.12.
14. אם cannulation הוא מוצלח, לאבטח את הצינורית על ידי הצבת טיפה קטנה של דבק וטרינרים מעל חור הכניסה לצינור לימפה. יש להיזהר שלא לחסום את כלי באמצעות היישום של דבק וטרינרים עודף.
15. בזמן שחיכה לדבק הוטרינרים להגדיר, observe את זרימת הלימפה במשך כמה דקות על מנת להבטיח כי הליך cannulation היה מוצלח. ברגע מסוים של ההצלחה של cannulation, להסיר את חתיכות הגזה שהונחו בחלל הבטן בזהירות ומניח את המעי הדק במיקום המקורי שלה.
16. מניחים צינור איסוף הלימפה המכיל נוגדת קרישה (ראה שלב 1.6) בסוף הצינורית כדי לאסוף את הלימפה זורמת חופשית.
17. בשלב הבא, cannulate תריסריון לעירוי של פתרונות להחזרת נוזלים ו / או ניסוחים.

4. Cannulation של התריסריון

1. צרף את צינורית תריסריון למזרק (למשל, 10 מיליליטר) מלאים בפתרון להחזרת הנוזלים.
2. זהה את תריסריון כורוד הבהיר (עם יותר כלי דם) סעיף של המעי הדק, שעל ירידה עדינה מושכת חושף את הבטן.
3. לעשות חור קטן לנקב בתריסריון כ -2 סנטימטרים מתחת לצומת של הקיבה והתריסריון (השוער) באמצעותמחט סטרילית 23 G.
4. הכנס את קצה מכור J בצורה של צינורית התריסריון דרך החור לנקב. Secure במקום עם ירידה של דבק cyanoacrylate.
5. להתחיל הידרציה של החולדה על ידי הצמדת הצינורית למזרק להחזרת הנוזלים שנטען במשאבת עירוי. על פי ספרות שיעורי החזרת נוזלים נעים 0.5-3 מיליליטר / שעה ^15,25.
6. לאחר השלמת הלימפה וcannulation תריסריון, לסגור את החתך בקיר שרירי הבטן עם תפרים. ואז לסגור את החתך בעור על ידי יישום כמה טיפות של דבק רקמות (cyanoacrylate) בצד של החתך וצובט את העור משני צידי החתך יחד.

5. Cannulation של עורק התרדמה

Cannulation העורק הראשי ניתן לבצע לפני או אחרי cannulation של הצינור לימפה mesenteric. מפעילים מסוימים מעדיפים cannulate עורק התרדמה לפני cannulating צינור הלימפה כדי להפחית potentially פירוק צינורית הלימפה בעת מעבר לבעלי החיים.

1. מציב סימן על צינורית עורק התרדמה 2.5 סנטימטר מהקצה שפוע לזהות את החלק של הצינור להכניס לתוך העורק. חבר את הקצה השני של הצינורית (כלומר, בלי שפוע) לG מחט 23 או 25 מצורפת מזרק מלא בפתרון נוגד קרישה ולמלא את הצינורית עם הפתרון נוגד קרישה כדי לוודא שאין פערי אוויר נוכחים.
2. כדי להקל על cannulation, למקם את העכברוש הרדים שכיבה על גב עם הצוואר המתוח והראש מופנה כלפי המפעיל. שים לב שחלק מהמפעילים מעדיפים לבצע בטכניקה זו עם הזנב של החולדה מצביע לכיוון המפעיל.
3. הנח 1 - חתך אורכי 1.5 סנטימטרים דרך שכבת העור מעל השמאלי של קנה הנשימה במטוס sagittal.
4. לנתח את רקמת חיבור תת עורית באמצעות מלקחיים קצה קהים לחשוף את שרירי צוואר לזווג בסיס.
5. לחזור בו לא שרירי צווארo לחשוף את העורק השמאלי הראשי (הממוקם ~ 1 סנטימטר מתחת לפני השטח של העור והפועם). נקה את רקמת החיבור שמעליה מהעורק על ידי נתיחה בוטה.
6. לבודד סעיף סנטימטר ~ 1 של העורק באמצעות זהירות מלקחיים רקמות בוטות, נזהר שלא לפגוע במסלול עצב המחנק הסמוך. לבצע זאת על ידי פתיחה וסגירת המלקחיים קצה הקהים אנכית לאורך כל צד של העורק כדי לשחרר אותו מהרקמות הסובבות ועצב התועה.
7. בעזרת מלקחיים טיפ נאה, חוט שני תפרי משי מתחת לעורק הראשי ולמקם אותם בכל קצה של סעיף העורק הבודד. לקשור את התפר הקרוב ביותר למפעיל ורחוק מהלב ועצם הבריח (איור 3 א) של החולדה.
8. לחסום את זרימת דם דרך העורק על ידי הנחת זוג מלקחיים טיפ נאה ישר מתחת לעורק (איור 3).
9. בעזרת המספריים איריס טיפ הנאה, למקם את חתך קטן על פני השטח העליונים של העורק (כ 1/3 מדרך למטה מהחלק העליון של האזור המבודד). לשטוף כל דם שנשפך על פני השטח של העורק עם מי מלח heparinised ולנגב בעדינות באמצעות טיפים כותנה.
10. הכנס את הקצה של הצינורית לתוך העורק עם זוג מלקחיים קצה מעוגלים. הוכנס ברגע, להסיר את המלקחיים טיפ נאה ישר חוסמים את זרימת הדם ולקדם את הצינורית 2.5 סנטימטרים לתוך העורק באמצעות שני זוגות מלקחיים, אחד להחזיק את הצינורית בתוך העורק לעצור דם דליפת גב ואחר להכניס את הצינורית.
11. השתמש במהדק עורק קטן להחזיק את הצינורית בתוך העורק ולהסיר את המלקחיים טיפ הנאה ישר שהונחו מתחת לעורק בשלב 5.8 כדי לחסום את זרימת הדם.
12. לאשר את patency של הצינורית על ידי הזרקת תמיסה נוגדת קרישה לצינורית וציור בחזרה כמות קטנה של דם (איור 3 ג). לאחר מכן לשטוף את הצינורית עם פתרון נוגד קרישה ולאטום את סוף השימוש בלהבה של מצית או תקע צינורית.
13. לקשור הצינורית דואר במקום עם שני התפרים ממוקמים מתחת לעורק בשלב 5.8.
14. הסר את מהדק העורק ולהבטיח תפר שלישי סביב העורק והצינורית. סגור את צוואר פצע עם תפרים.

תקופת 6. לאחר ניתוח וגיבוש עירוי

1. תמשיך לשמור על החולדה בהרדמה ועל משטח הלוהט.
2. רעננות העכברוש באמצעות עירוי של פתרון להחזרת נוזלים לתריסריון לפחות 0.5 שעות לאחר סיום cannulations. שים לב לירידת קצב זרימת הלימפה (~ 0.1-0.5 מיליליטר / שעה) בתקופה הראשונה לאחר cannulation ולהגדיל בקרוב לבסיס יציב (0.4-2.5 מיליליטר / שעה בהתאם לשיעור החזרת נוזלים).
3. לאחר תקופת ההתאוששות, להחדיר הניסוח של עניין (המכיל שומנים, תרופות, וכו ') לתריסריון באמצעות הצינורית. לחלופין, להשתמש במשאבת עירוי כדי להסדיר את קצב הזרימה של ניסוח. הערה: בפרוטוקול מתואר כאן בעלי החיים יישארו anaesthetised לאורך כל תקופת הניתוח ואיסוף הלימפה וeuthanised בהרדמה כך ששיכוך כאבים נוספים לא נדרש. אם הפרוטוקול הוא שונה ובעלי החיים אפשרו להחזיר לעצמו את ההכרה ואז שיכוך כאבים מתאימים וטיפול שלאחר ניתוח יהיו צורך.
4. בסיום עירוי ניסוח ימשיך רעננות העכברוש בשיעור של 1.5-3 מיליליטר / שעה עם מלח רגיל לתריסריון על מנת למנוע התייבשות.
5. תמשיך לשמור על החולדה על הכרית כירורגית המחוממת 37 ˚ C כדי לשמור על טמפרטורה (כמו לכל שלב 2.3), שתן מפורש משלפוחית ​​השתן באמצעות דחיפה כלפי מטה עדינה על הבטן התחתונה כנדרש ולהחיל מחדש משחת עיניים בכל שעה (לפי שלב 2.2. 3). שינויי תנוחת גוף רגילים מומלצים אם בעל החיים הוא להחזיר לעצמו את ההכרה לאחר ההליך.

7. אוסף של ימפה ודגימות דם להערכת שומנים וספיגת תרופה

1. לאסוף הלימפה ברציפות לצינורות המכילים נוגדת קרישה. צינורות שינוי במרווחי הזמן הנדרשים (לדוגמא, לשעה).
2. לאסוף דגימות דם בנקודות זמן שנקבע.
   1. לחסום את זרימת דם דרך הצינורית על ידי כיפוף הצינורית בחזרה כ 2 סנטימטר מהקצה האטום. לפרוץ דרך הצינורית ידי ניתוק הסוף האטום או ניתוק תקע חשמל הצינורית.
   2. שימוש במזרק ריק, לסגת מלוח heparinised מהצינורית עד דם ממלא את כל הצינורית.
   3. באמצעות מזרק ריק חדש, למשוך את הנפח הרצוי של דם ומקום בצינור המכיל נוגדת קרישה.
   4. שימוש במזרק הראשון, להחליף את הדם שנלקח לפני הדגימה כדי לצמצם את אובדן דם מיותר. לפני ההזרקה, קפיצי המזרק בעוד מחזיק אותו הזקוף, כדי להבטיח שאין בועות אוויר להיכנס לצינורית.
   5. באמצעות מזרק, להחליף את נפח דם הוסר מהעכברוש עם פתרון נוגד קרישה. ודא שאין דם שייר גלוי בצינורית ככל שנותרו עלולה להיקרשולחסום את הצינורית.
   6. בנד הצינורית כ 2 סנטימטר מקצה unsealed לחסום את זרימת דם ולהסיר את המזרק. שימוש בלהבה של מצית או תקע צינורית, לחתום מחדש את הצינורית.
3. בסיום איסוף דם והלימפה מהעכברוש, להרדים את העכברוש באמצעות ממשל intraperitoneal של> 100 מ"ג / קילוגרם pentobarbitone נתרן.
4. לקבוע קצב זרימת הלימפה על ידי מדידת המסה של הלימפה שנאסף במהלך כל תקופת זמן.
5. למדוד את הריכוז של תרופה ושומנים בדם באמצעות הלימפה ו, למשל, HPLC, HPLC-MS או באמצעות ערכות מסחריות, על מנת להעריך את יעילות שומנים וספיגת תרופה.
6. לחשב תחבורה המונית של סמים ושומנים בהלימפה מהמוצר של הריכוזים שנמדדו והנפח של הלימפה שנאספו.

תוצאות

תוצאותיו של ניסוי נציג לכמת את המידה המצטברת ושיעור של שומנים בדם ותחבורה סמים באמצעות מערכת הלימפה לאחר לידת מעיים באמצעות מודל cannulation הלימפה mesenteric מוצגות באיור 4 ואיור 5. בניסוי זה, 200 מיקרוגרם של lipophilic המודל halofantrine תרופה מוחדר לתריסריון של חולדות על שעה 2 ב?...

Discussion

מודל cannulation הלימפה mesenteric העכברוש מאפשר כימות ישירה של הריכוז ושיעור התחבורה של תאים ומולקולות (כגון שומנים ותרופות) מהמעי לימפה ושינויים אלה המתרחשים בתגובה שונים לאתגר של חומרים שונים (תזונה , אנטיגן, תרופות, ניסוחים, וכו ') ^10,27 ומחלה (סרטן, וירוסים, קוליט?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sterile saline	Baxter healthcare	AHB 1307	Any brand can be used. Example here is Baxter 100 ml saline bags, box of 50
70 % ethanol in water	Any		Any brand can be used
Chlorhexidine gluconate solution (Microshield 4)	Livingstone International	JJ60243L	Any brand can be used. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =JJ60243L
Betadine solution	Livingstone International	BU0510	Any brand can be used. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =BU0510
Ilium Ketamil (Ketamine 100 mg/ml)	PROVET VICTORIA	KETA I 1	http://www.provet.com.au/
Ilium Xylazil (Xylazine 100 mg/ml)	PROVET VICTORIA	TRO-3828	http://www.provet.com.au/
ACP 10 Injection (Acepromazine 10 mg/ml)	PROVET VICTORIA	VTG-DACP010020	http://www.provet.com.au/
Sodium pentobarbitone	PROVET VICTORIA	24529	Any brand can be used. Example here is Lethabarb® 325 mg/ml sodium pentobarbitone, Virbac Animal Health. http://www.provet.com.au
Heparin (35000I.U. in 35 mL)	Sigma Pharmaceuticals	337220	http://sigmaco.com.au/
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate	Sigma-Aldrich	E1644	Any brand can be used. Example here is disodium salt of EDTA from Sigma.
Polyethylene (PE) cannula o.d. 0.96 mm x i.d. 0.58 mm	Microtube extensions	PE8050	Any brand can be used. Example here is PE tubing 0.8x0.5 mm, 30 m
Polyethylene (PE) cannula o.d. 0.8 mm x i.d. 0.5 mm	Microtube extensions	PE9658	Any brand can be used. Example here is PE tubing 0.96x0.58 mm, 30 m
Ruler	Any		Any brand can be used
Markers	Any		Any brand can be used
Cigarette lighter	Any		Any brand can be used
Cyanoacrylate glue	Any		Any brand can be used
23 gauge needles	Livingstone International	DN23GX0.75LV	Any brand can be used. Example here is Livingstone Disposable Needle, Sterile, 23GX0.75inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT= 6&search=DN23GX0.75LV
25 gauge needles	Livingstone International	DN25GX1.0LV	Any brand can be used. Example here is Livingstone Disposable Needle, Sterile, 25GX1.0inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search= DN25GX1.0LV
1 ml syringe	Livingstone International	T3SS01TA	Any brand can be used. Example here is Terumo syringe 1 ml Slip Tuberculin 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =T3SS01TA
10 ml syringe	Livingstone International	T3SS10SA	Any brand can be used. Example here is Terumo syringe 10 ml Slip 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =T3SS10SA
Gauze swabs	Livingstone International	GSC075	Any brand can be used and cut to required size. Example here is gauze swabs cotton filled 7.5x7.5 cm, 8 ply. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =GSC075
Cotton buds	Livingstone International	CTAST075DP	Any brand can be used. Example here is Livingstone cotton applicator plastic double tipped. 75MM. 100/PK. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =CTAST075DP
Heating pad	Ratek	WT1	Any brand that keeps temperature at 37C can be used. Example here is Ratek warming tray.
Surgical light	Harvard Apparatus	72-0215 with 72-0267	Any brand can be used. Example here is Harvard apparatus V-Lux 1000 Cold Light Source with Bifurcated Gooseneck Light Guide, Black, 4.7 mm fiber diameter (each arm). http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_50601_ -1_HAI_ProductDetail and  http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_35487_ -1_HAI_ProductDetail___
Surgical microscope	Zeiss	495005-0014-000	Any brand can be used. Example here is Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000-C with Stand S Double Spot and KL 300 LED. https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=e&i=10143
Silk suture	Livingstone International	DTSK163019F4	Any brand can be used. Example here is *  Email this item to my friend 3/8 Circle Reverse Cut Silk Suture 3/0 Thread 19mm. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =DTSK163019F4
Scalpel blades	Fine Science Tools (FST)	10020-00	Any brand can be used. Example here is FST Scalpel Blade #20. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=191
Scalpel handle	Fine Science Tools (FST)	10004-13	Any brand can be used. Example here is FST Scalpel Handle #4. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=298&CategoryId=51
1 x Small surgical scissors	Fine Science Tools (FST)	14060-09	Any brand can be used. Example here is FST Fine Scissors, 9 cm with 21 mm cutting edge, sharp, straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=40&CategoryId=17
2 x Forceps with serrated curved tip	Fine Science Tools (FST)	11001-13	Any brand can be used. Example here is FST 13 cm standard pattern forceps with curved 2.8x1.4 mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=405&CategoryId=32
1 x Iridectomy scissors	Fine Science Tools (FST)	15000-08	Any brand can be used. Example here is FST Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge, Straight. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=17&CategoryId=16
1 x Forceps with straight serated tip	Fine Science Tools (FST)	11650-10	Any brand can be used. Example here is FST Graefe 10 cm straight with serrated 1 x 0.99 mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=390&CategoryId=32
1 x Forceps with smooth sharp straight fine tip	Fine Science Tools (FST)	11251-10	Any brand can be used. Example here is FST Dumont #5 forceps straight 11cm with 0.08 x 0.04mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=335&CategoryId=29
1 x Forceps with smooth fine curved forceps	Fine Science Tools (FST)	11063-07	Any brand can be used. Example here is FST Delicate Forceps 9 cm with smooth 0.4 x 0.3mm tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=360
2 x Hemostats	Fine Science Tools (FST)	13010-12	Any brand can be used. Not all operators use the hemostats. Example here is FST 12 cm Micro-Mosquito Hemostats with 20 mm length x 1.3 mm width serrated, straight tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=377&CategoryId=33
1 x Suture needle holder	Fine Science Tools (FST)	12001-13	Any brand can be used. Example here is FST 13cm Hasley Needle Holder with 16 mm length x 1.9 mm width tip. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=254&CategoryId=70
1 x Artery clamp	Fine Science Tools (FST)	18050-28	Any brand can be used. Example here is FST Bulldog Serrefines straight, 28 mm long, 9x1.6 mm jaw dimension with medium clamp press. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=270&CategoryId=82
Oleic acid	Sigma Aldrich	O1008	When required, any brand can be used. Example here is 99% pure oleic acid. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/o1008?lang=en&region=AU
14C-oleic acid	Perkin	NEC317050UC	Any brand can be used. Example here is Oleic Acid, [1-14C]-, 50µCi (1.85MBq). http://www.perkinelmer.com/Catalog/Product/ID/NEC317050UC
Sodium taurocholate	Sigma Aldrich	T4009	Any brand can be used. Example here is taurocholic acid sodium salt hydrate ≥95% (TLC) . http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4009?lang=en&region=AU
Halofantrine	Glaxo Smith Kline		Halofantrine was kindly provided as a gift from Glaxo Smith Kline
Sodium phosphate monobasic	Sigma Aldrich	71507	Any brand can be used. Example here is sodium phosphate monobasic monohydrate, BioXtra, for molecular biology, >99.5%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71643?lang=en&region=AU
Sodium phosphate dibasic	Sigma Aldrich	71643	Any brand can be used. Example here is sodium phosphate dibasic dihydrate, BioUltra, for molecular biology, >99%. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/71507?lang=en&region=AU